JP2001186884A - 微生物由来トランスグルタミナーゼの製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】本発明は、ストレプトマイセス属細菌にトラン
スグルタミナーゼを多量に分泌生産させることによっ
て、トランスグルタミナーゼを多量に製造する方法を提
供することを目的とする。 【解決手段】本発明は、放線菌由来のトランスグルタミ
ナーゼ遺伝子およびその本来の（天然の）プロモーター
を含む発現プラスミドを有するストレプトマイセス属細
菌を培養することにより、培養初期から中期にはプロト
ランスグルタミナーゼを分泌させ、培養後期にはストレ
プトマイセス属細菌に由来するプロテアーゼ等でプロ構
造体を切断除去することにより成熟型（活性型）のトラ
ンスグルタミナーゼを取得することを特徴とする、トラ
ンスグルタミナーゼの多量製造方法である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明はストレプトマイセス
・リビダンス(Streptomyces lividans)の宿主-ベクター
系を用いて、遺伝子組換え法により放線菌由来のトラン
スグルタミナーゼを分泌生産させる方法に関するもので
ある。本発明によって分泌生産されるトランスグルタミ
ナーゼは食品加工や医薬等に幅広く利用されている。

【０００２】

【従来の技術】本発明によって分泌生産されるトランス
グルタミナーゼはタンパク質のペプチド鎖内にあるγ−
カルボキシアミド基のアシル転移反応を触媒する酵素で
ある。本酵素をタンパク質に作用させると、ε−（γ−
Glu)−Lys 架橋形成反応、Glnの脱アミド化によるGlu
への置換反応が起こりうる。このトランスグルタミナー
ゼは、ゼリー等のゲル化食品、ヨーグルト、チーズ、あ
るいはゲル状化粧品などの製造や食肉の肉質改善等に利
用されている（特公平1-50382）。また、熱に安定なマ
イクロカプセルの素材、固定化酵素の担体などの製造に
利用されているなど、産業上利用性の高い酵素である。

【０００３】トランスグルタミナーゼはこれまでに動物
由来のものと微生物由来のもの（マイクロービアルトラ
ンスグルタミナーゼ：以下「ＭＴＧ」という）が知られ
ている。前者は、カルシウムイオン依存性の酵素で、動
物の臓器、皮膚、血液などに分布している。例えば、モ
ルモット肝臓トランスグルタミナーゼ（K. Ikura etal.
Biochemistry 27 2898(1988) ）、ヒト表皮ケラチン
細胞トランスグルタミナーゼ（M. A. Phillips et al.
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87 9333(1990)）、ヒト血
液凝固因子XIII（A. Ichinose et al. Biochemistry 25
6900(1990) ）などがある。後者については、ストレプ
トバーチシリウム属の菌から、カルシウム非依存性のも
のが発見されている。例えば、ストレプトバーチシリウ
ム・グリセオカルネウム（Streptoverticillium griseo
carneum ）IFO 12776 、ストレプトバーチシリウム・シ
ナモニウム（Streptoverticillium cinnamoneum sub s
p. cinnamoneum ）IFO 12852 、ストレプトバーチシリ
ウム・モバラエンス（Streptoverticillium mobaraens
e）IFO 13819 等があげられている（特開昭64-2747
1）。これらの微生物が生産するトランスグルタミナー
ゼの一次構造はペプチドマッピング及び遺伝子構造解析
の結果、動物由来のものとは相同性を全く持たないこと
が判明している（ヨーロッパ特許公開公報0 481 504 A
1）。

【０００４】微生物由来トランスグルタミナーゼ（ＭＴ
Ｇ）は、上記菌類等の培養物から精製操作をへて製造さ
れているため、供給量、効率等の点で問題があった。ま
た、遺伝子工学的手法によるトランスグルタミナーゼの
製造も試みられている。トランスグルタミナーゼタンパ
ク質およびその遺伝子については例えば、特開昭64-274
71、Biosci. Biotech. Biochem., 58, 82-87(1994)、Bi
osci. Biotech. Biochem.,58,88-92(1994)、特開平5-19
9883、Biochimie, 80, 313-319(1998)、 Eur.J. Bioche
m., 257, 570-576(1998),WO 9606931、WO 9622366など
に報告されており、これらには例えばStreptomyces liv
idans、Aspergillus oryzae、E.coli等の宿主−ベクタ
ー系での発現生産に関する報告がなされている。また、
大腸菌（E.coli）、酵母等の微生物における分泌発現
（特開平5-199883）による方法とE.coliでＭＴＧを不活
性融合タンパク質封入体として発現させた後、この封入
体をタンパク質変性剤で可溶化し、脱変性剤処理を経て
再生させることにより活性をもつＭＴＧを生産する方法
（特開平6-30771)が報告されている。しかしながら、従
来の方法による微生物による分泌発現においては、その
発現量が非常に少ないという問題点が指摘される。スト
レプトマイセスにおけるトランスグルタミナーゼの分泌
生産に関しては、具体的な分泌蓄積量の記載がある例と
して、ストレプトマイセス・リビダンス(Streptomyces
lividans)を宿主とする遺伝子組換え法でストレプトバ
ーチシリウム・モバラエンス（Streptoverticilium mob
araense）由来のトランスグルタミナーゼ遺伝子を導入
した報告があるが、その分泌量は0.1mg/l程度でしかな
い(Biosci.Biotech.Biochem., 58, 82-87(1994); 特開
平5-199883)。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、ストレプト
マイセス属細菌にトランスグルタミナーゼを多量に分泌
生産させることによって、トランスグルタミナーゼを多
量に製造する方法を提供することを目的とする。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本発明の方法は、放線菌
ストレプトマイセスの宿主-ベクター系を用いて、放線
菌由来のトランスグルタミナーゼ遺伝子、すなわちシグ
ナルペプチド領域とプロ構造領域および成熟体構造領
域、並びに当該トランスグルタミナーゼ遺伝子の発現を
制御するその本来の（天然の）プロモーター領域を用い
て、ストレプトマイセス属細菌内で高発現可能な発現型
プラスミドを構築し、この発現型プラスミドをストレプ
トマイセス属細菌に導入し、培養することにより、培養
初期から中期にはプロ構造部の付加したトランスグルタ
ミナーゼ（プロトランスグルタミナーゼ）を分泌させ、
培養後期にはプロ構造体をストレプトマイセス属細菌に
由来するプロテアーゼ等で切断除去することにより成熟
型（活性型）のトランスグルタミナーゼを取得すること
を特徴とする、トランスグルタミナーゼの多量製造方法
である。

【０００７】

【発明の実施の形態】本発明の方法により、ストレプト
マイセス属細菌が宿主−ベクター系として用いられ、ト
ランスグルタミナーゼ遺伝子の本来のプロモーターの下
流にプロ構造部を含むトランスグルタミナーゼ（プロト
ランスグルタミナーゼ）遺伝子を結合した発現構築物が
作製され、これがストレプトマイセス属細菌中に導入さ
れ、発現され、菌体外に分泌されたプロトランスグルタ
ミナーゼが更にそのストレプトマイセス属自身が生産す
るプロテアーゼ等によって切断除去されることにより、
成熟型（活性型）のトランスグルタミナーゼが多量に得
られる。

【０００８】分泌型タンパク質は一般にはプレペプチド
またはプレプロペプチドとして翻訳され、その後、翻訳
後修飾を受けて成熟型タンパク質になることが知られて
いる。すなわち、一般に、プレペプチドまたはプレプロ
ペプチドとして翻訳された後、シグナルペプチド（「プ
レ部分」）が切断されて成熟ペプチドまたはプロペプチ
ドに変換され、プロペプチドはプロテアーゼによってさ
らにプロ部分が切断されて成熟型ペプチドになることが
知られている。トランスグルタミナーゼはそのようなタ
ンパク質の一つである。本明細書において、シグナルペ
プチドおよびプロ部分の両方を有するトランスグルタミ
ナーゼ、すなわち、一次翻訳産物を「プレプロトランス
グルタミナーゼ」と称することがあり、またシグナルペ
プチドを有しないがプロ部分を有するトランスグルタミ
ナーゼを「プロトランスグルタミナーゼ」と称すること
がある。プロトランスグルタミナーゼのプロ部分は「プ
ロ構造部」または単に「プロ構造」と称することもあ
り、本明細書においてトランスグルタミナーゼの「プロ
構造部／プロ構造」とタンパク質の「プロ部分」とは互
換的に使用される。従って、「プロトランスグルタミナ
ーゼ」は「プロ構造部を付加したトランスグルタミナー
ゼ」とも称される。

【０００９】本明細書においてプロ部分を「切断除去」
したタンパク質とは、ペプチド結合を切断することによ
ってプロ部分を構成する少なくとも１以上のアミノ酸を
除去したタンパク質をいい、そのＮ末端領域が天然の成
熟型タンパク質のものと完全に一致するタンパク質、お
よび、そのタンパク質の活性を有する限り、天然のタン
パク質に比較してＮ末端にプロ部分に由来する1以上の
余分のアミノ酸を有するものおよび天然の成熟型タンパ
ク質よりもアミノ酸配列が短いタンパク質も含まれる。
また、本明細書において「成熟型トランスグルタミナー
ゼ」と「活性型トランスグルタミナーゼ」は同じ意味で
使用される。

【００１０】本発明に使用される遺伝子構築物は、一般
にプロモーター、プレプロトランスグルタミナーゼをコ
ードする核酸断片、およびストレプトマイセス属細菌中
で目的タンパク質遺伝子を発現させるために必要な制御
配列を含む適切な配列を適切な位置に有するものであ
る。この構築物のために使用できるベクターは特に制限
されず、ストレプトマイセス属細菌中で機能し得るもの
であればよく、プラスミドのように染色体外で自律増殖
するものであっても細菌染色体に組み込まれるものであ
ってもよい。ストレプトマイセス属細菌由来のプラスミ
ドが好ましく、そのようなプラスミドとしては、例えば
pIJ702(J.Gen.Microbiol.,129,2703-2714,(1983))、及
びこれらを改良したプラスミド等が挙げられる。

【００１１】本発明の方法において、ストレプトマイセ
ス属細菌でトランスグルタミナーゼ遺伝子を発現させる
ために利用できるプロモーターは放線菌のトランスグル
タミナーゼ遺伝子の本来のプロモーターである。ただ
し、放線菌においては、Escherichia coliにおけるよう
にプロモーターのコンセンサス配列は明確になっておら
ず、プロモーター領域が必ずしも特定できない場合があ
る。このような場合、トランスグルタミナーゼの構造遺
伝子及びその発現を制御するプロモーター領域を含むの
に十分な長さの5'上流域を包含する遺伝子断片を利用す
ればよい。本発明において利用できるトランスグルタミ
ナーゼ遺伝子は特に限定されないが、ストレプトバーチ
シリウム・シナモニウム(Streptoverticillium cinnamo
neum) IFO 12852、ストレプトバーチシリウム・グリセ
オカルニウム( Streptoverticillium griseocarneum) I
FO 12776、 ストレプトバーチシリウム・モバラエンス
(Streptoverticillium mobaraense) IFO 13819、 スト
レプトマイセス・リディカス(Streptomyces lydicus)(W
O96-06931)等の放線菌由来の分泌型トランスグルタミナ
ーゼ遺伝子が好ましい。ストレプトバーチシリウム・シ
ナモニウムまたはストレプトバーチシリウム・モバラエ
ンス由来のトランスグルタミナーゼ遺伝子が特に好まし
く、それらのトランスグルタミナーゼ遺伝子の本来の
（天然の）プロモーターと共に使用される。配列表配列
番号１に本発明者らが決定したStreptoverticillium ci
nnamoneumIFO12852由来のトランスグルタミナーゼ遺伝
子の5'上流域を一部含む全塩基配列を、および、配列番
号２に該塩基配列にコードされるアミノ酸配列を示す。
アミノ酸配列の１番目から３２番目までがプレ部分の配
列、３３番目から８６番目までがプロ部分の配列、８７
番目から４１６番目までが成熟型トランスグルタミナー
ゼの配列であると推定される。また、配列表配列番号３
にStreptoverticillium mobaraense IFO13819由来のト
ランスグルタミナーゼ遺伝子の5'上流域の一部を含む全
塩基配列を、および、配列番号４に該配列にコードされ
るアミノ酸配列を示す。アミノ酸配列の１番目から３１
番目までがプレ部分の配列、３２番目から７６番目まで
がプロ部分の配列、７７番目から４０７番目までが成熟
型トランスグルタミナーゼの配列である。

【００１２】本発明に使用される遺伝子構築物のストレ
プトマイセス属細菌への導入方法は特に限定されず、通
常よく用いられるプロトプラスト法(Gene, 39, 281-286
(1985)；特開平3-251182)、エレクトロポーレーション
法(Bio/Technology, 7, 1067-1070(1989))等の方法を用
いれば良い。また得られた形質転換体は通常よく用いら
れている方法や条件に従って培養すればよい。例えば、
上記微生物を培養するための培地としては通常の炭素
源、窒素源、無機イオンを含有する通常の培地でよい。
さらに高い増殖性を得るためにはビタミン、アミノ酸等
の有機微量栄養素やポリペプトン、酵母エキス等の天然
素材を添加する事が望ましい。炭素源としては、可溶性
デンプン、グルコースやシュクロース等の炭水化物、有
機酸、アルコール類、その他が適宜使用される。 培養
は好気条件下にｐＨ5.0から8.5、温度を１５℃から３７
℃の適当な範囲に制御しつつ、１日ないし２週間程度培
養を行う。

【００１３】窒素源としては、アンモニアガス、アンモ
ニア水、アンモニウム塩、その他が用いられる。 無機
イオンとしては、マグネシウムイオン、燐酸イオン、カ
リウムイオン、鉄イオン、その他が必要に応じ適宜使用
される。そのような条件下で形質転換体を培養すること
により、プレプロトランスグルタミナーゼが菌体内で多
量に生産され、プロトランスグルタミナーゼとして菌体
外に分泌され、その後、ストレプトマイセス属細菌自身
がこの培養条件下で分泌生産するプロテアーゼによって
培地中で切断され、成熟型（活性型）トランスグルタミ
ナーゼが多量に培養液中に蓄積する。本発明により分泌
生産されたトランスグルタミナーゼはそれぞれの特性に
応じ、当業者によく知られた方法に従って、培養後の培
地から分離精製することができる。例えば、菌体の遠心
除去等を行った後、硫酸アンモニウムやエタノール沈殿
をはじめ、イオン交換カラムクロマトグラフィー、アフ
ィニティークロマトグラフィー、高速液体クロマトグラ
フィー、等電点電気泳動、ゲル濾過等の適切な既知の方
法により、またはこれらを組み合わせることにより分
離、精製すれば良い。

【００１４】

【実施例】実施例１．Streptoverticillium cinnamoneu
m IFO 12852のトランスグルタミナーゼ遺伝子の取得 ストレプトバーチシリウム・シナモニウム(Streptovert
icillium cinnamoneum) CBS683.68のトランスグルタミ
ナーゼ遺伝子の配列は既に決定されている(Biochimie.,
80, 313-319(1998))。この配列を参考にして、配列番
号５と配列番号６に示したプライマーを合成し、斉藤、
三浦の方法(Biochem. Biophys. Act., 72,619(1963))に
より調製したStreptoverticillium cinnamoneum IFO 12
852の染色体ＤＮＡから成熟トランスグルタミナーゼ配
列をコードする領域をＰＣＲ法にて増幅した。ＰＣＲ反
応にはPyrobest DNA polymerase(宝酒造社製)を用い、
反応条件はこれのプロトコールに従った。 （配列番号５）5'-TCCGATGACCGGGAAACTCCTCCCGCCGAG-3' （配列番号６）5'-CGGCCAGCCTTGCTCCACCTTGGCGGGGGC-3' ［配列表フリーテキスト］ 配列番号５：ストレプトバーチシリウム・シナモニウム
由来のトランスグルタミナーゼ遺伝子増幅用PCRプライ
マー 配列番号６：ストレプトバーチシリウム・シナモニウム
由来のトランスグルタミナーゼ遺伝子増幅用PCRプライ
マー

【００１５】次に増幅した約960bpのＤＮＡ断片を、Ran
dom Primer DNA Labeling Kit Ver.2(宝酒造社製)と[α
-³²P]dCTPを用いて、添付のプロトコールに従って反応さ
せ、ＤＮＡプローブを作製した。作製したプローブとStr
eptoverticillium cinnamoneum IFO 12852の染色体ＤＮ
Ａを用いて、Molecular Cloning 第２版(J. SambrookE.
F. Fritsch and T. Maniatis, Cold Spring Harbor La
boratory Press, p9.31(1989))に記載されているような
一般的方法に従って、サザンブロットハイブリダイゼー
ションを行ったところ、制限酵素BamHIで切り出される
約3.5ｋｂの断片にトランスグルタミナーゼ遺伝子が存
在していることが確認できた。そこでStreptoverticill
ium cinnamoneum IFO 12852の染色体DNAをBamHIで消化
した約3.5ｋｂの断片をEASYTRAP Ver.2（宝酒造社製）
を用いてアガローズゲル電気泳動により回収し、これを
pUC18のBamHI部位に挿入した後、Escherichia coli JM1
09（宝酒造社製）のコンピテントセルに導入し、ライブ
ラリーを作製した。先に作製したトランスグルタミナー
ゼのＤＮＡプローブを用いて、Molecular Cloning 第２
版（J. Sambrook E. F. Fritsch and T. Maniatis, Col
d Spring Harbor Laboratory Press, p1.90(1989)）に
記載されるような一般的手順に従ったコロニーハイブリ
ダイゼーションにより、ライブラリーのスクリーニング
を行い、トランスグルタミナーゼ遺伝子断片がクローン
化されたプラスミドを保持する菌株を取得し、これより
プラスミドを回収し、pB3.5と名付けた。

【００１６】pB3.5にクローン化されている断片の塩基
配列を決定したところ、Streptoverticillium cinnamon
eum IFO 12852のトランスグルタミナーゼ遺伝子は、Str
eptoverticillium cinnamoneum CBS683.68のトランスグ
ルタミナーゼ遺伝子とほぼ同じ塩基配列を有することが
確認された。またトランスグルタミナーゼ遺伝子はpUC1
8のマルチクロ−ニングサイトのEcoRIからHindIIIの方
向に転写されるように挿入されている。塩基配列の決定
はダイターミネーターサイクルシークエンシングキット
（ＰＥアプライドバイオシステムズ社製）とＤＮＡシー
クエンサー３７３Ａ（ＰＥアプライドバイオシステムズ
社製）を用いて行った。決定された塩基配列と該塩基配
列にコードされるアミノ酸配列をそれぞれ配列表配列番
号１および２に示す。アミノ酸配列の１番目から３２番
目までがプレ部分の配列、３３番目から８６番目までが
プロ部分の配列、８７番目から４１６番目までが成熟型
トランスグルタミナーゼの配列であると推定される。

【００１７】実施例２．トランスグルタミナーゼ遺伝子
発現用プラスミドの構築 プラスミドベクター(pIJ702)の取得 pIJ702の調製は[J.Bacteriol.,162,406-412(1985); J.B
acteriol.,169,1929-1937(1987)]に従い行った。具体的
にはストレプトマイセス・リビダンス(Streptomyces li
vidans) 66をpIJ702で形質転換したStreptomyces livid
ans 3131(ATCC 35287)(J.Gen.Microbiol., 129, 2703-2
714(1983))を以下の培地条件で30℃、２日間培養した。 [YEME培地＋0.5%グリシン＋50μg/mlチオストレプトン] ３％ イースト・エキストラクト ５％ ペプトン ３％ マルト・エキストラクト １％ 塩化マグネシウム ０％ グルコース ３４．０％ サッカロース ５％ グリシン １％ 50mg/mlチオストレプトン溶液 （シグマ：ジメチルスルホキシド溶液）(pH7.0)

【００１８】上記条件下で培養した培養培地２００ｍｌ
を遠心分離(12,000g, 4℃, 10分間)し、50mM Tris-HCl
(pH8.0)-5mM EDTA-50mM NaClで洗浄後、得られた菌体を
50mMTris-HCl(pH8.0)-10mM EDTA-25% Sucrose（以下「T
E-Sucrose」という。）１０ｍｌに懸濁した。次に30mg/
mlのリゾチーム（シグマ）を含むTE-Sucrose 2mlおよび
0.25M EDTA 4mlを加え、37℃で３０分間インキュベート
後、20% SDS 2mlを加え、さらに5M NaCl 5mlを加えて穏
やかに攪拌した後、0℃で１晩インキュベートした。次
に遠心分離(100,000g, 4℃, 40分間)により得られた上
清に30%ポリエチレン6000を終濃度10%になるように加
え、0℃で4.5時間インキュベートした。その後、遠心分
離(900 g, 4℃, 5分間)し、沈殿を10mM Tris-HCl(pH8.
0)-1mM EDTA-50mM NaClに溶かした。次に、塩化セシウ
ム16.8gおよび10mg/mlの濃度にエチジウムブロマイドを
10mM Tris-HCl(pH8.0)-1mM EDTA（以下「TE」とい
う。）に溶かし調製した溶液1.2mlを加え、遠心分離(1,
300 g, 室温, 15分間)により、残さを取り除いた後、遠
心分離（230,000 g, 20℃, 12時間）を行った。遠心
後、紫外線照射下でプラスミドDNA層を分離抽出し、TE
で飽和したブタノールによる抽出操作を３回繰り返し行
いエチジウムブロマイドを除いた。さらにTEで4℃で１
晩透析した後、TE飽和フェノールで１回、クロロホルム
・イソアミルアルコールで２回の抽出操作を行い、水層
を回収した。次に1/10容量の3M酢酸ナトリウム(pH5.2)
溶液と２倍容量のエタノールを加え、-80℃に30分間静
置し、遠心分離（12,000 g, 4℃, 15分間）により沈殿
を回収し、70%エタノールで洗浄後、乾燥し、TE200μl
に溶かした。約10μgのプラスミドDNAが得られた。

【００１９】２）発現用プラスミド構築 まず、放線菌Streptomycesと大腸菌(Escherichia coli)
の両方の宿主で複製可能なシャトルベクターを作製し
た。放線菌多コピープラスミドのpIJ702（約5.8kb）をS
acIとPstIで切断し、mel（チロシナーゼ遺伝子）プロモ
ーター領域を除去した5.1kbの大きい断片を調製した。
次にプロテアーゼインヒビターSSI(Streptomyces subti
lisin inhibitor)と抗菌ペプチド（アピデシン）遺伝子
の融合体が組み込まれたpOSΔB-Ap1（約7.9kb）（Appl.
Environ.Microbiol., 60, 3566-3572(1994)）をHindIII
とPstIで切断し、約2kbの断片を調製した。さらにEsche
richia coliの多コピー型プラスミドpUC18（宝酒造社
製）をEcoRIで切断し、T4 DNAポリメラーゼ（宝酒造社
製）で平滑末端化してセルフライゲイションを行い、Ec
oRIで切断されないプラスミドを選択し、さらにSacIとH
indIII切断した2.7kbの断片を調製した。

【００２０】次にpIJ702のSacI-PstI 5.1kb断片とpOSΔ
B-Ap1のHindIII-PstI 2kb断片、およびpUC18のSacI-Hin
dIII 2.7kb断片の３者ライゲイションを行い、シャトル
ベクターpUJS（約9.8kb）を構築した。さらにpUJSをHin
dIIIとEcoRI切断して大断片8.6kbを回収した。（１）で
クローン化したStreptoverticillium cinnamoneum IFO
12852のトランスグルタミナーゼ遺伝子を搭載したpB3.5
（約6.2kb）をHindIIIとEcoRIで切断し、3.5kbのHindII
I-EcoRI断片を回収した。この3.5kbのHindIII-EcoRI断
片をpUJSのHindIIIとEcoRIサイトに挿入したpUJ-MTG
（約12.1kb）を構築した。以上の構築手順を図１に示
す。pUJ-MTGを形質転換して得られた形質転換体Escheri
chia coli AJ13669は工業技術院微生物工業技術研究所
に寄託されている（受託番号FERM P-17602、寄託日平成
11年10月14日）。

【００２１】実施例３．Streptomyces lividans TK24へ
の形質導入 Streptomyces lividans TK24はStreptomyces lividans
66に由来する株であり、ストレプトマイシン耐性が付与
されている(GENETIC MANIPULATION OF STREPTOMYCES, A
LABORATORY MANUAL: D.A.Hopwood et al., p266, 198
5, The john InnesFoundation Norwich)。本菌株はD.A.
Hopwood(John Innes Institute, Colney Lane, Norwich
NR4 7UH, U.K.)より提供されたものであり、D.A. Hopw
ood研究室より入手可能である。Streptomyces lividans
TK24を[特開平3-251182、Hunter,I.S. "DNA Cloning"A
Practical Approarch 2, Glover,D.M.(Ed.) IRL Press
(1985)、GENETIC MANIPULATION OF STREPTOMYCES, A LA
BORATORY MANUAL: D.A.Hopwood et al., p104,1985, Th
e john Innes Foundation Norwich]の方法に従って、プ
ロトプラスト化し形質導入した。具体的にはStreptomyc
es lividans TK24をYEME培地＋0.5%グリシンで30℃、２
日間培養した。培養液200mlを遠心分離(1,300 g, 室
温、10分間)し、得られた菌体を0.35Mサッカロース72ml
に懸濁した。次に、この懸濁液を遠心分離(1,300 g, 室
温、10分間)し、菌体を1mg/mlのリゾチーム（シグマ）
を含むＰ緩衝液60mlに再懸濁し、これを30℃、2.5時間
インキュベートし、脱脂綿で濾過し、残さを取り除い
た。得られた濾液を遠心分離（1,300 g, 室温、10分
間）し、Ｐ緩衝液25mlで洗浄を２回繰り返した後、沈殿
をＰ緩衝液1mlに懸濁し、プロトプラスト懸濁液とし
た。

【００２２】 [Ｐ緩衝液] TES[N-Tris(hydroxymethyl)methyl-2-aminoethane sulphonic acid] 5.73g サッカロース 103g 塩化マグネシウム 2.03g 硫酸カリウム 0.5g 塩化カルシウム 3.68g 微量元素溶液 2ml/L(pH7.4) なお、1%リン酸１カリウム溶液を別調製し、使用直前に
100ml Ｐ緩衝液当たり1mlを加えた。 [微量元素溶液] 1L中、以下のものを含む。 塩化亜鉛 40mg 塩化第二鉄 200mg 塩化第二銅 10mg 塩化マンガン 10mg 四硼酸ナトリウム 10mg モリブデン酸アンモニウム 10mg

【００２３】次に、トランスグルタミナーゼ遺伝子発現
プラスミドpUJ-MTG（約12.1kb）のStreptomyces livida
ns TK24のプロトプラスト懸濁液への形質導入を以下の
ように行った。 DNA溶液(0.2μg/μl) 20μl Streptomyces lividans TK24のプロトプラスト懸濁液 100μl 0.35M サッカロース 20μl 20%ポリエチレングリコール1000を含むＰ緩衝液 1.5ml を穏やかに混和し、室温で２分間静置する。遠心分離
(1,700 g、室温、10分間)し、ペレットを集め、Ｐ緩衝
液で２回洗浄を繰り返し、Ｐ緩衝液1mlに懸濁した後に2
00μlずつを以下のR-2寒天培地に塗布した。

【００２４】 [R-2寒天培地] 1)R-2/A 硫酸カリウム 0.5g/l 塩化マグネシウム 20.2g/l 塩化カルシウム 5.9g/l グルコース 20.0g/l プロリン 6.0g/l カザミノ酸 0.2g/l 微量元素溶液 4 ml 寒天 44.0g/l 2)R-2/B TES 11.5g/l イースト・エキストラクト 10.0g/l サッカロース 203 g/l (pH7.4) 3)１％ KH₂PO₄ 1)2)3)をそれぞれ別調製し、プレート培地作製時にR-2/
AおよびR-2/Bを混合し、さらに１％ KH₂PO₄溶液を最終
容量200ml当たり1mlの割合で混合した。

【００２５】形質転換体が塗布されたR-2寒天培地を30
℃で18時間インキュベートした後、200μg/mlのチオス
トレプトンを含むＰ緩衝液1mlを加え、寒天の全表面を
覆い、さらに30℃で７日間インキュベートし、コロニー
を得た。得られたコロニーからプラスミドを調製して目
的のプラスミドが導入されていることを確認した。

【００２６】実施例４．トランスグルタミナーゼ遺伝子
の発現と分泌生産 形質転換体pUJ-MTG/Streptomyces lividans TK24をチオ
ストレプトン10μg/mlを含むトリプトン・ソーヤ・ブロ
ス(DIFCO社製)液体培地4mlで３０℃、３日間培養し、こ
の1mlを100mlの上記液体培地（500ml容坂口フラスコ）
にシードし、３０℃で２週間培養した。経時的に培養液
をサンプリングして、その培養上清液１０μｌをＳＤＳ
−ＰＡＧＥに供してから、特開平6-046855記載の抗トラ
ンスグルタミナーゼ抗体を用いて、Molecular Cloning
第２版(J. Sambrook E. F. Fritsch and T. Maniatis,
Cold Spring Harbor Laboratory Press, p18.60(1989))
に記載されるような一般的条件でウエスタンブロットを
行った。その結果、培養７〜１０日目頃まではプロ構造
部の付加したトランスグルタミナーゼ（プロトランスグ
ルタミナーゼ）の分泌生産（約40-50mg/l）が認めら
れ、さらに培養を継続するとプロトランスグルタミナー
ゼがプロセッシングを受けた成熟トランスグルタミナー
ゼとほぼ同じ分子量を有するトランスグルタミナーゼの
生成量が増大し、２週間目頃には約40-50mg/lの成熟型
トランスグルタミナーゼが蓄積した。

【００２７】プロ構造部の付加したトランスグルタミナ
ーゼ（プロトランスグルタミナーゼの分泌生産量の多い
時期の培養上清を用いて、SDS-PAGE後、PVDF膜にセミド
ライブロッティングした（「遺伝子クローニングのため
のタンパク質構造解析」、東京化学同人（1993））。ブ
ロッティング後、PVDF膜をクマシーブリリアントブルー
で染色し、脱染、風乾した。プロトランスグルタミナー
ゼの部分を切り取り、プロテインシークエンサー（モデ
ル476A、パーキンエルマー社製）でＮ末端アミノ酸配列
の解析を行った。その結果、プロトランスグルタミナー
ゼのＮ末端アミノ酸配列の10アミノ酸配列（Gly-Asp-Gl
y-Glu-Glu-Lys-Gly-Ser-Tyr-Ala-）が確認された。この
アミノ酸配列はBiochimie., 80, 313-319(1998)で示さ
れたプロ領域の配列とは異なっており、実施例１で決定
したアミノ酸配列（配列番号２）と一致した。

【００２８】

【発明の効果】本発明により、ストレプトマイセス属細
菌にトランスグルタミナーゼを生産させ、培養液中にト
ランスグルタミナーゼを多量に得ることができる。本発
明の方法によって培養液中に蓄積するトランスグルタミ
ナーゼは、ストレプトマイセス属細菌自身によって生産
されるプロテーゼによって切断された成熟型トランスグ
ルタミナーゼであるため、簡便かつ大規模に培地から成
熟型トランスグルタミナーゼを回収することができる。

【００２９】

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> Ajinomoto Co. Inc. <120> A method of producing microbial transglutaminase <130> Y1G806 <140> <141> <150> JP 11-295649 <151> 1999-10-18 <160> 6 <170> PatentIn Ver. 2.0 <210> 1 <211> 1461 <212> DNA <213> Streptoverticillium cinnamoneum <220> <221> CDS <222> (151)..(1398) <400> 1 cggcggcagc cctccttgcc gccggcgcag cgacgcagga cggcgcggcc aaggccctga 60 gcggcagctc gtcgcaaacc cctccatcgc gtcgtgctct cacatgccct cgtttcacga 120 ggcttcacca caagggagtt attgatttcc atg cac aaa cgt cgg aga ctt ctc 174 Met His Lys Arg Arg Arg Leu Leu 1 5 gcc ttc gcc act gtg ggt gcg gtc ata tgc acc gca gga ttc aca cct 222 Ala Phe Ala Thr Val Gly Ala Val Ile Cys Thr Ala Gly Phe Thr Pro 10 15 20 tcg gtc agc cag gcc gcc agc agt ggc gat ggg gaa gag aag ggg tcc 270 Ser Val Ser Gln Ala Ala Ser Ser Gly Asp Gly Glu Glu Lys Gly Ser 25 30 35 40 tac gcc gaa acg cac ggc ctg acg gcg gat gac gtc gag agc atc aac 318 Tyr Ala Glu Thr His Gly Leu Thr Ala Asp Asp Val Glu Ser Ile Asn 45 50 55 gca ctg aac gaa aga gct ctg act ctg ggc caa cct ggc aag cct ccg 366 Ala Leu Asn Glu Arg Ala Leu Thr Leu Gly Gln Pro Gly Lys Pro Pro 60 65 70 aag gaa tta cct ccg agc gcc agc gcg ccc tcc cgg gcc ccc tcc gat 414 Lys Glu Leu Pro Pro Ser Ala Ser Ala Pro Ser Arg Ala Pro Ser Asp 75 80 85 gac cgg gaa act cct ccc gcc gag ccg ctc gac agg atg cct gag gcg 462 Asp Arg Glu Thr Pro Pro Ala Glu Pro Leu Asp Arg Met Pro Glu Ala 90 95 100 tac cgg gcc tac gga ggc agg gcc act acg gtc gtc aac aac tac ata 510 Tyr Arg Ala Tyr Gly Gly Arg Ala Thr Thr Val Val Asn Asn Tyr Ile 105 110 115 120 cgc aag tgg cag cag gtc tac agt cac cgc gac gga aag aaa cag caa 558 Arg Lys Trp Gln Gln Val Tyr Ser His Arg Asp Gly Lys Lys Gln Gln 125 130 135 atg acc gaa gag cag cga gaa aag ctg tcc tac ggt tgc gtt ggc gtc 606 Met Thr Glu Glu Gln Arg Glu Lys Leu Ser Tyr Gly Cys Val Gly Val 140 145 150 acc tgg gtc aac tcg ggc ccc tac ccg acg aac aga ttg gcg ttc gcg 654 Thr Trp Val Asn Ser Gly Pro Tyr Pro Thr Asn Arg Leu Ala Phe Ala 155 160 165 tcc ttc gac gag aac aag tac aag aac gac ctg aag aac acc agc ccc 702 Ser Phe Asp Glu Asn Lys Tyr Lys Asn Asp Leu Lys Asn Thr Ser Pro 170 175 180 cga ccc gat gaa acg cgg gcg gag ttc gag ggt cgc atc gcc aag ggc 750 Arg Pro Asp Glu Thr Arg Ala Glu Phe Glu Gly Arg Ile Ala Lys Gly 185 190 195 200 agt ttc gac gag ggg aag ggt ttc aag cgg gcg cgt gat gtg gcg tcc 798 Ser Phe Asp Glu Gly Lys Gly Phe Lys Arg Ala Arg Asp Val Ala Ser 205 210 215 gtc atg aac aag gcc ctg gaa aat gcc cac gac gag ggg act tac atc 846 Val Met Asn Lys Ala Leu Glu Asn Ala His Asp Glu Gly Thr Tyr Ile 220 225 230 aac aac ctc aag acg gag ctc acg aac aac aat gac gct ctg ctc cgc 894 Asn Asn Leu Lys Thr Glu Leu Thr Asn Asn Asn Asp Ala Leu Leu Arg 235 240 245 gag gac agc cgc tcg aac ttc tac tcg gcg ctg agg aac aca ccg tcc 942 Glu Asp Ser Arg Ser Asn Phe Tyr Ser Ala Leu Arg Asn Thr Pro Ser 250 255 260 ttc aag gaa agg gac ggc ggc aac tac gac ccg tcc aag atg aag gcg 990 Phe Lys Glu Arg Asp Gly Gly Asn Tyr Asp Pro Ser Lys Met Lys Ala 265 270 275 280 gtg atc tac tcg aag cac ttc tgg agc ggg cag gac cag cgg ggc tcc 1038 Val Ile Tyr Ser Lys His Phe Trp Ser Gly Gln Asp Gln Arg Gly Ser 285 290 295 tcc gac aag agg aag tac ggc gac ccg gaa gcc ttc cgc ccc gac cag 1086 Ser Asp Lys Arg Lys Tyr Gly Asp Pro Glu Ala Phe Arg Pro Asp Gln 300 305 310 ggt acc ggc ctg gtc gac atg tcg aag gac aga agc att ccg cgc agt 1134 Gly Thr Gly Leu Val Asp Met Ser Lys Asp Arg Ser Ile Pro Arg Ser 315 320 325 ccg gcc aag ccc ggc gaa ggt tgg gtc aat ttc gac tac ggt tgg ttc 1182 Pro Ala Lys Pro Gly Glu Gly Trp Val Asn Phe Asp Tyr Gly Trp Phe 330 335 340 ggg gct caa aca gaa gcg gat gcc gac aaa acc aca tgg acc cac ggc 1230 Gly Ala Gln Thr Glu Ala Asp Ala Asp Lys Thr Thr Trp Thr His Gly 345 350 355 360 gac cac tac cac gcg ccc aat agc gac ctg ggc ccc atg cac gta cac 1278 Asp His Tyr His Ala Pro Asn Ser Asp Leu Gly Pro Met His Val His 365 370 375 gag agc aag ttc cgg aag tgg tct gcc ggg tac gcg gac ttc gac cgc 1326 Glu Ser Lys Phe Arg Lys Trp Ser Ala Gly Tyr Ala Asp Phe Asp Arg 380 385 390 gga gcc tac gtg atc acg ttc ata ccc aag agc tgg aac acc gcc ccc 1374 Gly Ala Tyr Val Ile Thr Phe Ile Pro Lys Ser Trp Asn Thr Ala Pro 395 400 405 gcc aag gtg gag caa ggc tgg ccg tgacaggctg gtactacgac ctctgctgat 1428 Ala Lys Val Glu Gln Gly Trp Pro 410 415 ttctgcccgg tcagtccacg cctctcgacg cga 1461 <210> 2 <211> 416 <212> PRT <213> Streptoverticillium cinnamoneum <400> 2 Met His Lys Arg Arg Arg Leu Leu Ala Phe Ala Thr Val Gly Ala Val 1 5 10 15 Ile Cys Thr Ala Gly Phe Thr Pro Ser Val Ser Gln Ala Ala Ser Ser 20 25 30 Gly Asp Gly Glu Glu Lys Gly Ser Tyr Ala Glu Thr His Gly Leu Thr 35 40 45 Ala Asp Asp Val Glu Ser Ile Asn Ala Leu Asn Glu Arg Ala Leu Thr 50 55 60 Leu Gly Gln Pro Gly Lys Pro Pro Lys Glu Leu Pro Pro Ser Ala Ser 65 70 75 80 Ala Pro Ser Arg Ala Pro Ser Asp Asp Arg Glu Thr Pro Pro Ala Glu 85 90 95 Pro Leu Asp Arg Met Pro Glu Ala Tyr Arg Ala Tyr Gly Gly Arg Ala 100 105 110 Thr Thr Val Val Asn Asn Tyr Ile Arg Lys Trp Gln Gln Val Tyr Ser 115 120 125 His Arg Asp Gly Lys Lys Gln Gln Met Thr Glu Glu Gln Arg Glu Lys 130 135 140 Leu Ser Tyr Gly Cys Val Gly Val Thr Trp Val Asn Ser Gly Pro Tyr 145 150 155 160 Pro Thr Asn Arg Leu Ala Phe Ala Ser Phe Asp Glu Asn Lys Tyr Lys 165 170 175 Asn Asp Leu Lys Asn Thr Ser Pro Arg Pro Asp Glu Thr Arg Ala Glu 180 185 190 Phe Glu Gly Arg Ile Ala Lys Gly Ser Phe Asp Glu Gly Lys Gly Phe 195 200 205 Lys Arg Ala Arg Asp Val Ala Ser Val Met Asn Lys Ala Leu Glu Asn 210 215 220 Ala His Asp Glu Gly Thr Tyr Ile Asn Asn Leu Lys Thr Glu Leu Thr 225 230 235 240 Asn Asn Asn Asp Ala Leu Leu Arg Glu Asp Ser Arg Ser Asn Phe Tyr 245 250 255 Ser Ala Leu Arg Asn Thr Pro Ser Phe Lys Glu Arg Asp Gly Gly Asn 260 265 270 Tyr Asp Pro Ser Lys Met Lys Ala Val Ile Tyr Ser Lys His Phe Trp 275 280 285 Ser Gly Gln Asp Gln Arg Gly Ser Ser Asp Lys Arg Lys Tyr Gly Asp 290 295 300 Pro Glu Ala Phe Arg Pro Asp Gln Gly Thr Gly Leu Val Asp Met Ser 305 310 315 320 Lys Asp Arg Ser Ile Pro Arg Ser Pro Ala Lys Pro Gly Glu Gly Trp 325 330 335 Val Asn Phe Asp Tyr Gly Trp Phe Gly Ala Gln Thr Glu Ala Asp Ala 340 345 350 Asp Lys Thr Thr Trp Thr His Gly Asp His Tyr His Ala Pro Asn Ser 355 360 365 Asp Leu Gly Pro Met His Val His Glu Ser Lys Phe Arg Lys Trp Ser 370 375 380 Ala Gly Tyr Ala Asp Phe Asp Arg Gly Ala Tyr Val Ile Thr Phe Ile 385 390 395 400 Pro Lys Ser Trp Asn Thr Ala Pro Ala Lys Val Glu Gln Gly Trp Pro 405 410 415 <210> 3 <211> 1809 <212> DNA <213> Streptoverticillium mobaraense <220> <221> CDS <222> (578)..(1798) <400> 3 gtcgacgcgg gccgggaggg ggtgcggcgg cgcccttcgg ctgtgtggac gaagcgtcgg 60 gtcggagggg cggccggata tcgtccttgg ggcggggtgg ccggaattgc cgccatggtg 120 ttgccgggga atcgacccga agacatgatc acttctcgta tccacccgat cacgtatccg 180 ggagtcgaga agtgttacgc cgtgcccctg tccgcgtcct cacccctgtc gccgtgacag 240 cgacccgcgt tcttccactc gcacggacgg ccccacagga cctttcggcc cgggctcgcc 300 ccgccgcctc ggtgacggcc tccgaataac gcggccgccg gggcctcggc cggttgaccg 360 atccgggtca cgcgccccgc cgggcgggcg gccacgtccg gtctcgcccc gcccgacatc 420 ggctgcgact gccttcgctc gcacttcttc ccgcctcccg gccgcgtttt tccgccgccg 480 aaggtgcggc gacgcgtacc gaatccccct tcatcgcgac gtgcttccgc acggccgcgt 540 tcaacgatgt tccacgacaa aggagttgca ggtttcc atg cgc ata cgc cgg aga 595 Met Arg Ile Arg Arg Arg 1 5 gct ctc gtc ttc gcc act atg agt gcg gtg tta tgc acc gcc gga ttc 643 Ala Leu Val Phe Ala Thr Met Ser Ala Val Leu Cys Thr Ala Gly Phe 10 15 20 atg ccg tcg gcc ggc gag gcc gcc gcc gac aat ggc gcg ggg gaa gag 691 Met Pro Ser Ala Gly Glu Ala Ala Ala Asp Asn Gly Ala Gly Glu Glu 25 30 35 acg aag tcc tac gcc gaa acc tac cgc ctc acg gcg gat gac gtc gcg 739 Thr Lys Ser Tyr Ala Glu Thr Tyr Arg Leu Thr Ala Asp Asp Val Ala 40 45 50 aac atc aac gcg ctc aac gaa agc gct ccg gcc gct tcg agc gcc ggc 787 Asn Ile Asn Ala Leu Asn Glu Ser Ala Pro Ala Ala Ser Ser Ala Gly 55 60 65 70 ccg tcg ttc cgg gcc ccc gac tcc gac gac agg gtc acc cct ccc gcc 835 Pro Ser Phe Arg Ala Pro Asp Ser Asp Asp Arg Val Thr Pro Pro Ala 75 80 85 gag ccg ctc gac agg atg ccc gac ccg tac cgt ccc tcg tac ggc agg 883 Glu Pro Leu Asp Arg Met Pro Asp Pro Tyr Arg Pro Ser Tyr Gly Arg 90 95 100 gcc gag acg gtc gtc aac aac tac ata cgc aag tgg cag cag gtc tac 931 Ala Glu Thr Val Val Asn Asn Tyr Ile Arg Lys Trp Gln Gln Val Tyr 105 110 115 agc cac cgc gac ggc agg aag cag cag atg acc gag gag cag cgg gag 979 Ser His Arg Asp Gly Arg Lys Gln Gln Met Thr Glu Glu Gln Arg Glu 120 125 130 tgg ctg tcc tac ggc tgc gtc ggt gtc acc tgg gtc aat tcg ggt cag 1027 Trp Leu Ser Tyr Gly Cys Val Gly Val Thr Trp Val Asn Ser Gly Gln 135 140 145 150 tac ccg acg aac aga ctg gcc ttc gcg tcc ttc gac gag gac agg ttc 1075 Tyr Pro Thr Asn Arg Leu Ala Phe Ala Ser Phe Asp Glu Asp Arg Phe 155 160 165 aag aac gag ctg aag aac ggc agg ccc cgg tcc ggc gag acg cgg gcg 1123 Lys Asn Glu Leu Lys Asn Gly Arg Pro Arg Ser Gly Glu Thr Arg Ala 170 175 180 gag ttc gag ggc cgc gtc gcg aag gag agc ttc gac gag gag aag ggc 1171 Glu Phe Glu Gly Arg Val Ala Lys Glu Ser Phe Asp Glu Glu Lys Gly 185 190 195 ttc cag cgg gcg cgt gag gtg gcg tcc gtc atg aac agg gcc ctg gag 1219 Phe Gln Arg Ala Arg Glu Val Ala Ser Val Met Asn Arg Ala Leu Glu 200 205 210 aac gcc cac gac gag agc gct tac ctc gac aac ctc aag aag gaa ctg 1267 Asn Ala His Asp Glu Ser Ala Tyr Leu Asp Asn Leu Lys Lys Glu Leu 215 220 225 230 gcg aac ggc aac gac gcc ctg cgc aac gag gac gcc cgt tcc ccg ttc 1315 Ala Asn Gly Asn Asp Ala Leu Arg Asn Glu Asp Ala Arg Ser Pro Phe 235 240 245 tac tcg gcg ctg cgg aac acg ccg tcc ttc aag gag cgg aac gga ggc 1363 Tyr Ser Ala Leu Arg Asn Thr Pro Ser Phe Lys Glu Arg Asn Gly Gly 250 255 260 aat cac gac ccg tcc agg atg aag gcc gtc atc tac tcg aag cac ttc 1411 Asn His Asp Pro Ser Arg Met Lys Ala Val Ile Tyr Ser Lys His Phe 265 270 275 tgg agc ggc cag gac cgg tcg agt tcg gcc gac aag agg aag tac ggc 1459 Trp Ser Gly Gln Asp Arg Ser Ser Ser Ala Asp Lys Arg Lys Tyr Gly 280 285 290 gac ccg gac gcc ttc cgc ccc gcc ccg ggc acc ggc ctg gtc gac atg 1507 Asp Pro Asp Ala Phe Arg Pro Ala Pro Gly Thr Gly Leu Val Asp Met 295 300 305 310 tcg agg gac agg aac att ccg cgc agc ccc acc agc ccc ggt gag gga 1555 Ser Arg Asp Arg Asn Ile Pro Arg Ser Pro Thr Ser Pro Gly Glu Gly 315 320 325 ttc gtc aat ttc gac tac ggc tgg ttc ggc gcc cag acg gaa gcg gac 1603 Phe Val Asn Phe Asp Tyr Gly Trp Phe Gly Ala Gln Thr Glu Ala Asp 330 335 340 gcc gac aag acc gtc tgg acc cac gga aat cac tat cac gcg ccc aat 1651 Ala Asp Lys Thr Val Trp Thr His Gly Asn His Tyr His Ala Pro Asn 345 350 355 ggc agc ctg ggt gcc atg cat gtc tac gag agc aag ttc cgc aac tgg 1699 Gly Ser Leu Gly Ala Met His Val Tyr Glu Ser Lys Phe Arg Asn Trp 360 365 370 tcc gag ggt tac tcg gac ttc gac cgc gga gcc tat gtg atc acc ttc 1747 Ser Glu Gly Tyr Ser Asp Phe Asp Arg Gly Ala Tyr Val Ile Thr Phe 375 380 385 390 atc ccc aag agc tgg aac acc gcc ccc gac aag gta aag cag ggc tgg 1795 Ile Pro Lys Ser Trp Asn Thr Ala Pro Asp Lys Val Lys Gln Gly Trp 395 400 405 ccg tgatgtgagc g 1809 Pro <210> 4 <211> 407 <212> PRT <213> Streptoverticillium mobaraense <400> 4 Met Arg Ile Arg Arg Arg Ala Leu Val Phe Ala Thr Met Ser Ala Val 1 5 10 15 Leu Cys Thr Ala Gly Phe Met Pro Ser Ala Gly Glu Ala Ala Ala Asp 20 25 30 Asn Gly Ala Gly Glu Glu Thr Lys Ser Tyr Ala Glu Thr Tyr Arg Leu 35 40 45 Thr Ala Asp Asp Val Ala Asn Ile Asn Ala Leu Asn Glu Ser Ala Pro 50 55 60 Ala Ala Ser Ser Ala Gly Pro Ser Phe Arg Ala Pro Asp Ser Asp Asp 65 70 75 80 Arg Val Thr Pro Pro Ala Glu Pro Leu Asp Arg Met Pro Asp Pro Tyr 85 90 95 Arg Pro Ser Tyr Gly Arg Ala Glu Thr Val Val Asn Asn Tyr Ile Arg 100 105 110 Lys Trp Gln Gln Val Tyr Ser His Arg Asp Gly Arg Lys Gln Gln Met 115 120 125 Thr Glu Glu Gln Arg Glu Trp Leu Ser Tyr Gly Cys Val Gly Val Thr 130 135 140 Trp Val Asn Ser Gly Gln Tyr Pro Thr Asn Arg Leu Ala Phe Ala Ser 145 150 155 160 Phe Asp Glu Asp Arg Phe Lys Asn Glu Leu Lys Asn Gly Arg Pro Arg 165 170 175 Ser Gly Glu Thr Arg Ala Glu Phe Glu Gly Arg Val Ala Lys Glu Ser 180 185 190 Phe Asp Glu Glu Lys Gly Phe Gln Arg Ala Arg Glu Val Ala Ser Val 195 200 205 Met Asn Arg Ala Leu Glu Asn Ala His Asp Glu Ser Ala Tyr Leu Asp 210 215 220 Asn Leu Lys Lys Glu Leu Ala Asn Gly Asn Asp Ala Leu Arg Asn Glu 225 230 235 240 Asp Ala Arg Ser Pro Phe Tyr Ser Ala Leu Arg Asn Thr Pro Ser Phe 245 250 255 Lys Glu Arg Asn Gly Gly Asn His Asp Pro Ser Arg Met Lys Ala Val 260 265 270 Ile Tyr Ser Lys His Phe Trp Ser Gly Gln Asp Arg Ser Ser Ser Ala 275 280 285 Asp Lys Arg Lys Tyr Gly Asp Pro Asp Ala Phe Arg Pro Ala Pro Gly 290 295 300 Thr Gly Leu Val Asp Met Ser Arg Asp Arg Asn Ile Pro Arg Ser Pro 305 310 315 320 Thr Ser Pro Gly Glu Gly Phe Val Asn Phe Asp Tyr Gly Trp Phe Gly 325 330 335 Ala Gln Thr Glu Ala Asp Ala Asp Lys Thr Val Trp Thr His Gly Asn 340 345 350 His Tyr His Ala Pro Asn Gly Ser Leu Gly Ala Met His Val Tyr Glu 355 360 365 Ser Lys Phe Arg Asn Trp Ser Glu Gly Tyr Ser Asp Phe Asp Arg Gly 370 375 380 Ala Tyr Val Ile Thr Phe Ile Pro Lys Ser Trp Asn Thr Ala Pro Asp 385 390 395 400 Lys Val Lys Gln Gly Trp Pro 405 <210> 5 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:PCR primer for amplification of transglutaminase gene from S.cinnamoneum <400> 5 tccgatgacc gggaaactcc tcccgccgag 30 <210> 6 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:PCR primer for amplification of transglutaminase gene from S.cinnamoneum <400> 6 cggccagcct tgctccacct tggcgggggc 30

【図面の簡単な説明】

【図１】 発現用プラスミドpUJ-MTGの構築手順を示
す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） (Ｃ１２Ｎ 9/10 Ｃ１２Ｒ 1:19） Ｃ１２Ｒ 1:19） Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｆターム(参考） 4B024 AA03 AA05 BA10 CA03 CA09 DA08 EA04 GA11 GA19 GA21 GA27 HA13 HA14 HA20 4B050 CC01 CC03 DD02 EE01 LL02 LL05 4B065 AA01Y AA50X AB01 AC14 AC15 BB01 BC01 BC03 BC26 BD50 CA29 CA41 CA50

Claims (7)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 放線菌由来のトランスグルタミナーゼ遺
   伝子配列及び当該トランスグルタミナーゼ遺伝子の発現
   を制御しているプロモーター配列を含む遺伝子構築物を
   導入したストレプトマイセス属細菌。
2. 【請求項２】 放線菌がストレプトバーチシリウム・シ
   ナモニウムである請求項１に記載のストレプトマイセス
   属細菌。
3. 【請求項３】 ストレプトマイセス・リビダンスである
   請求項１または２に記載のストレプトマイセス属細菌。
4. 【請求項４】 請求項１〜３のいずれか１項に記載のス
   トレプトマイセス属細菌を培養し、放線菌由来のプロト
   ランスグルタミナーゼを培地中に分泌させることを特徴
   とする、プロトランスグルタミナーゼの製造法。
5. 【請求項５】 請求項１〜３のいずれか１項に記載のス
   トレプトマイセス属細菌を培養し、放線菌由来のプロト
   ランスグルタミナーゼを培地中に分泌させ、前記ストレ
   プトマイセス属細菌由来のプロテアーゼによって前記プ
   ロトランスグルタミナーゼのプロ構造部を切断除去し、
   放線菌由来の成熟型トランスグルタミナーゼを回収する
   ことを特徴とする、成熟型トランスグルタミナーゼの製
   造法。
6. 【請求項６】 プロトランスグルタミナーゼが配列番号
   ２の３３番目のグリシン残基から４１６番目のプロリン
   残基に至るアミノ酸配列を有する、請求項４に記載の方
   法。
7. 【請求項７】 成熟型トランスグルタミナーゼが配列番
   号２の８７番目のセリン残基から４１６番目のプロリン
   残基に至るアミノ酸配列を有する、請求項５に記載の方
   法。