DE102007042727A1

DE102007042727A1 - Thermostabile Transglutaminasen

Info

Publication number: DE102007042727A1
Application number: DE200710042727
Authority: DE
Inventors: Markus Pietzsch; Thomas C. Hertel; Christian K. Marx
Original assignee: Martin Luther Universitaet Halle Wittenberg
Current assignee: Martin Luther Universitaet Halle Wittenberg
Priority date: 2007-09-07
Filing date: 2007-09-07
Publication date: 2009-09-24
Also published as: DE112008003024A5; WO2009030211A2; WO2009030211A3

Abstract

Transglutaminasen werden u. a. für die kovalente Vernetzung von Proteinen eingesetzt. Bekannt ist eine mikrobielle Transglutaminase, welche aus Streptomyces mobaraensis hergestellt wird, die eine geringe Stabilität bei höheren Temperaturen aufweist. Die Transglutaminase in Form von Activa WM wird vorwiegend in der Lebensmitteltechnologie eingesetzt. Für Anwendungen außerhalb des Lebensmittelbereiches sind für Vernetzungsreaktionen bei höheren Temperaturen temperaturstabilere und aktivere Transglutaminasen erforderlich. Es Stand somit die Aufgabe, Transglutaminasen herzustellen, die eine höhere Thermostabilität besitzen. Mit Hilfe von radom mutagenese mittels error prone PCR ist es gelungen, veränderte Transglutaminasen herzustellen, die eine verbesserte Thermostabilität aufweisen. Die Gensequenzen dieser Transglutaminasen wurden analysiert und die entsprechende veränderte Aminosäuresequenz abgeleitet. Mit Hilfe dieser Sequenzinformation und der bekannten Kristallstruktur konnten die Bereiche im Protein identifiziert werden, die eine erhöhte Temperaturstabilität gegenüber dem bekannten Enzym aufweisen. Lebensmitteltechnologie, Pharma- und Kosmetikbereich, Polymersynthese.

Description

Transglutaminasen (TG) werden u. a. für die kovalente Vernetzung von Proteinen eingesetzt. Bekannt ist eine mikrobielle Transglutaminase (MTG) [Ando et al., 1990], welche mit einem Wild-typ Mikroorganismus (Streptomyces mobaraensis, frühere Bezeichnung: Streptoverticillium mobaraense) hergestellt wird und unter dem Handelsnamen Activa WM erhältlich ist. Versuche, das Enzym rekombinant herzustellen und eine Expression in löslicher Form in E. coli zu erreichen schlugen bisher fehl. Es wurden stets unlösliche Inclusion Bodies erhalten. Genetische Modifikationen des Enzyms waren aus diesem Grunde unmöglich.
Bekannt ist aber eine veränderte mikrobielle Transglutaminase, die in E. coli rekombinant hergestellt und in löslicher Form exprimiert wird [Marx et al., 2007]. Dieses Enzym besitzt zusätzlich zum Wild-typ Enzym einen Histidin-tag, welcher eine einfache Reinigung mittels Affinitätschromatographie ermöglicht. Das Enzym (FRAP-MTG-His₆) wurde unter Ausnutzung des Histidin-tags mittels Affinitätschromatographie gereinigt und anschließend charakterisiert (Tab. 1).
In der Literatur finden sich unterschiedliche Angaben bezüglich der Stabilität der MTG aus Streptomyces bei höheren Temperaturen (Tab. 1). Die verwendeten Stämme (Streptoverticillium S-8112 [Umezawa et al., 2002], bzw. Streptoverticillium mobaraense WSH-Z2 [Lu et al., 2003]) sind nicht in Stammsammlungen verfügbar.
Zum Vergleich mit dem neuen, rekombinanten Enzym (FRAP-MTG-His₆) wurde die kommerziell erhältliche Enzympräparation Activa WM verwendet (Tab. 1). Das gereinigte, rekombinant hergestellte und bezüglich der Sequenz veränderte Enzym (FRAP-MTG-His₆) besitzt eine geringere Stabilität bei höheren Temperaturen als die kommerzielle Enzympräparation Activa WM. Letztere enthält allerdings nach Herstellerangaben 99% Maltodextrin zur Stabilisierung. Entfernt man das Maltodextrin sinkt die Stabilität signifikant (Tab. 1, Spalte „MTG aus Activa WM nach Reinigung”). Vergleicht man die gereinigten Enzyme, liegen die Eigenschaften bezüglich der Stabilität der MTG aus Activa WM und dem Enzym (FRAP-MTG-His₆) im gleichen Rahmen.
Die Transglutaminase in Form von Activa WM wird überwiegend in der Lebensmitteltechnologie eingesetzt. Für Anwendungen des Enzyms auch außerhalb des Lebensmittelsbereiches wie im Pharma- und Kosmetikbereich sowie der Polymersynthese wäre es günstig, die Vernetzungsreaktionen bei höheren Temperaturen durchführen zu können und somit temperaturstabilere und aktivere Transglutaminasen herzustellen.
Obwohl verschiedene Screeningverfahren auf unterschiedliche Mikroorganismen mit TG-Aktivität durchgeführt wurden, bei denen eine ganze Reihe weiterer Quellen für Transglutaminasen beschrieben wurden ([Kaupeinen et al., 2002; Schaefer et al., 2001], wurde bisher kein Enzym beschrieben, das die gewünschten Eigenschaften besitzt. Kashiwagi et al. [Kashiwagi et al., 2002a] beschreiben eine Methode zur site-directed mutagenese der MTG auf Basis der Kristallstrukturdaten [Kashiwagi et al., 2002b]. Allerdings wurde diese Methode nur angewendet, um die Substratspezifität des Enzyms zu verändern. Dazu musste das extrem zeitaufwändige Verfahren verwendet werden, das Enzym zunächst in unlöslicher Form als Inclusion bodies zu produzieren, und diese anschließend in die aktive Enzymkonformation zu falten.
Aufgabe der Erfindung war es somit, Transglutaminasen herzustellen, die eine höhere Thermostabilität besitzen. Das Problem wurde dadurch gelöst, dass mit Hilfe von random mutagenese mittels error prone PCR veränderte Transglutaminasen hergestellt wurden. Diese wurden in einem Screening auf Thermostabilität identifiziert und die verbesserten Enzyme anschließend charakterisiert. Die Gensequenzen der Transglutaminasen, die verbesserte Eigenschaften aufwiesen, wurden analysiert und die entsprechende veränderte Aminosäuresequenz abgeleitet. Mit Hilfe dieser Sequenzinformationen und der bekannten Kristallstrukturen ist es gelungen, die Bereiche im Protein zu identifizieren, die eine erhöhte Temperaturstabilität gegenüber dem wild-typ Enzym bzw. dem veränderten histidingetaggten Enzym aufweisen (hot spots).
Die Erfindung wird durch nachfolgende Beispiele näher beschrieben.
Ausführungsbeispiele
Beispiel 1: Kultivierung von E. coli in Mikrotiterplatten (MTP) und Expression der Pro-MTG-His₆
Deepwell-Mikrotiterplatten (MTP, Nr. 0030502.310, Eppendorf, Hamburg) wurden mit 500 μl LB Amp – Medium (10 g/L Trypton/Pepton, 10 g/L NaCl, 5 g/L Hefeextrakt, pH 7,5, 100 μg/mL Ampicillin) pro Well befüllt. Jedes Well wurde mittels eines sterilen Zahnstochers mit Zellen von einer einzelnen E. coli-Kultur von der Agarplatte angeimpft (Herstellung der Agarplatte s. Beispiel 5C. Die MTP wurden mit zwei sterilen Klebefolien verschlossen, erst mit BreathSeal (Nr. 676050, Greiner Bio-One, Solingen), dann zusätzlich mit Gaspermeable Adhesive Seal (Nr. AB-0718, Abgene Germany, Hamburg). Die Platten wurden in einem Schüttelinkubator (Innova 4230, New Brunswick Scientific, Edison, USA) bei 400 rpm, 37°C und 2,5 cm Schüttelradius für 16–18 Stunden inkubiert.
Anschließend wurden jeweils 20 μl der Kultur in eine neue MTP übertragen, die pro Well 480 μl LB Amp ONEx-Medium enthielt (LB Amp wie beschrieben, zusätzlich 0,05% Glucose, 0,5% Glycerin, 0,2% Lactose, 25 mM KH₂PO₄, 25 mM Na₂HPO₄, 2 mM MgSO₄ Bestandteile des ONEx-Medium entsprechend [Studier, 2005]). Diese MTP wurden in einem Schüttelinkubator (Multitron, Infors HT, Bottmingen, Switzerland) bei 300 rpm, 28°C und 5cm Schüttelradius für 24 Stunden inkubiert, anschließend bei 4000 rpm für 20 Minuten zentrifugiert (Zentrifuge 5403, Eppendorf, Hamburg). Der Überstand wurde verworfen und das Pellet bei –80°C bis zum Zellaufschluss gelagert.
Beispiel 2: Zellaufschluss und Aktivierung der Pro-MTG-His₆ mittels Dispase
Für den Zellaufschluss wurden zur MTP mit den eingefrorenen Zellpellets (s. Beispiel 1) pro Well 300 μL Lysepuffer (50 mM Tris/HCl, 2 mM MgCl₂, pH 8,0, 1 mg/mL Lysozym (8259.2, Carl Roth GmbH & Co. KG, Karlsruhe), 10 U/ml Benzonase (Nr. 1.01695.0001, Merck KGaA, Darmstadt)) zugegeben und das Pellet durch Auf- und Abpipettieren mit einer Mehrkanalpipette resuspendiert. Die MTP wurde anschließend bei 650 rpm und 37°C für 1 Stunde in einem Thermomixer (Eppendorf, Hamburg) inkubiert. Nichtaufgeschlossene Zellen und Zelltrümmer wurden bei 400 rpm für 20 Minuten abzentrifugiert und 180 μL des Überstands in eine neue MTP (Nr. 267245, Nunc GmbH & Co. KG, Wiesbaden) übertragen. Die Aktivierung der Pro-MTG-HIS₆ erfolgte durch die Zugabe von 20 μL Dispase (1 U/mL Endkonzentration, Nr. 354235, BD Biosciences, Heidelberg) pro Well und anschließender Inkubation bei 37°C für 20 min in einem Thermomixer.
Beispiel 3: Aktivitätstest auf FRAP-MTG-His₆ Aktivität bzw. deren Mutanten im Mikrotiterplattenformat
Der Test auf MTG-Aktivität erfolgte mittels Hydroxamat-Test [Folk and Cole, 1966] und wurde auf MTP Format adaptiert. Zu 50 μl Überstand, der das jeweilige aktivierte Enzym enthielt (s. Beispiel 2 bzw. Beispiel 4C), wurden 90 μl Hydroxamat-Testlösung gegeben (Endkonzentrationen: 0,2 M Tris, 100 mM Hydroxylamin, 10 mM reduziertes Glutathion, 30 mM Z-Gln-Gly, pH 6,0). Nach einer Inkubation bei 37°C für 10 Minuten in einem Thermomixer wurde die Reaktion mit 160 μL Reagenz A (1 Volumenteil 3 M HCl, 1 Volumenteil 12% Trichloressigsäure, 1 Volumenteil 5% FeCl₃·6 H₂O (in 0,1 M HCl)) gestoppt. 200 μl wurden in eine transparente MTP (Nr. 701304, Brand GmbH & Co. KG, Wertheim) übertragen und die Extinktion bei 525 nm im Mikrotiterplatten-Reader (FluoStar, BMG Labtech GmbH, Offenburg) gemessen.
Beispiel 4: Herstellung von FRAP-MTG-His₆ und deren Mutanten
A. Produktion von Biomasse für die Herstellung von FRAP-MTG-His₆
E. coli BL21(DE3) pDJ1-3 wurde im Bioreaktor kultiviert. Dazu wurden die Autoinduktionsmethode, die in der Literatur beschrieben wurde, auf den 15 L Maßstab angepasst [Marx et al., 2007]. 5 mL einer Vorkultur I (LB Amp – Medium) wurden mit einer Einzelkolonie E. coli BL21(DE3) pDJ 1-3 angeimpft. Nach 18 Stunden Wachstum bei 37°C und 200 rpm wurden 100 mL LB Amp – Medium mit 3 mL der Vorkultur I angeimpft und für 7 Stunden bei 37°C und 120 rpm inkubiert (Vorkultur II). 500 mL Vorkultur III (LB Amp – Medium) wurden mit Vorkultur II so angeimpft, dass eine Start-OD₆₀₀ von 0,02 resultierte und über Nacht bei 37°C und 80 rpm bis zu einer OD₆₀₀ von 2,8 wachsen gelassen. 14,73 L Fermentationsmedium (siehe unten) wurden mit 270 mL Vorkultur III angeimpft. Die Bioreaktor-Kultivierung wurde in einem 20 L Biostat C durchgeführt bei einer Temperatur von 28°C, einer Rührerdrehzahl von 300 rpm und einer Begasungsrate von 4,0 L/min.
Während der Fermentation wurde der pH-Wert gemessen, aber nicht geregelt. Als Antischaummittel wurde Silikonöl verwendet.
Nach 19 h wurden die Zellen durch Zentrifugation geerntet (4°C, 6000 g, ZK 630, Eppendorf, Hamburg).
Die Biomasse wurde in 0,9% NaCl-Lösung resuspendiert, erneut zentrifugiert und als Platten mit einer Dicke von ungefähr 0,5 cm bei –80°C gelagert.
Aus 15 L Kulturvolumen wurden 238 g Biofeuchtmasse geerntet.
Fermentationsmedium
Für die Herstellung von 15 L ONEx-Medium wurden 135 g Trypton (Endkonzentration 9 g/L), 67,5 g Hefeextrakt (4,5 g/L) und 135 g NaCL (9 g/L) in 13,5 L entionisiertem Wasser gelöst, in einen 20 L Biostat-C-Bioreaktor (Braun Melsungen, Germany) überführt und sterilisiert. Folgende Lösungen wurden separat sterilisiert und zum Bioreaktor zugegeben: 7,5 g Glucose, 75 g Glycerin, 30 g Lactose in 300 mL Wasser, 51 g KH₂PO₄, 53,25 g Na₂HPO₄ in 750 mL Wasser, 7,40 g MgSO₄·7 H₂O in 15 mL Wasser, and 1,5 g Ampicillin in 30 mL Wasser. Die Endkonzentrationen betrugen 0,5 g/L Glucose, 5 g/L Glycerin, 2 g/L Lactose, 25 mM KH₂PO₄, 25 mM Na₂HPO₄, 2 mM MgSO₄, and 100 μg/mL Ampicillin. Der pH-Wert wurde mit NaOH auf 7,5 eingestellt. Vor dem Animpfen wurde das Volumen mit sterilem Wasser auf 14,73 L aufgefüllt.
B. Produktion von Biomasse der FRAP-MTG-His₆-Mutanten:
5 ml LB_amp-Medium wurde mit E. coli BL21(DE3) mit den Plasmiden, die mutierte FRAP-MTG-Gensequenzen enthielten (Durchführung der random mutagenese siehe Beispiel 5), angeimpft und ca. 6 Stunden bei 37°C und 200 rpm inkubiert. Mit 3 ml der Vorkultur wurde jeweils ein 500 mL Erlenmeyerkolben mit Schikanen mit 100 mL Autoinduktionsmedium (siehe unten), angeimpft und ca. 20 Stunden bei 28°C und 120 rpm inkubiert, bis die stationäre Wachstumsphase erreicht war.
Die Zellen wurden mittels Zentrifugation (20 min bei 3000 g) abgetrennt und bei –80°C bis zur weiteren Verwendung gelagert.
Das Autoinduktionsmedium wurde wie folgt hergestellt. Zu 93 ml LB-Medium wurden folgende, einzeln sterilisierte Lösungen zugegeben: 200 μl Ampicillin (50 mg/ml), 2 ml Autoinduktions-Lösung 1 (Endkonzentration 0,5 g/L Glucose, 5 g/L Glycerin, 2 g/L Lactose), 5 ml Autoinduktions-Lösung 2 (Endkonzentration 25 mM KH₂PO₄, 25 mM Na₂HPO₄) und 100 μl Autoinduktions-Lösung 3 (Endkonzentration 2 mM MgSO₄).
C. Aufschluß, Aktivierung und Reinigung
Jeweils 0,5 g Biofeuchtmasse von E. coli BL21(DE3) aus der Bioreaktorkultivierung (s. Beispiel 4A) bzw. der einzelnen Mutanten nach Beispiel 4B wurden in 10 ml Puffer (50 mM Tris/HCl, pH 8,0, 2 mM MgCl₂, 1 mg/mL Lysozym, 10 U/mL Benzonase) resuspendiert und anschließend für 60 min bei 37°C aufgeschlossen. Nach einer Zentrifugation für 20 min bei 20000 g wurden zum Überstand 400 μl TAMEP (Protease aus Streptomyces mobaraensis, Eigenproduktion analog zu [Zotzel et al., 2003]) zugegeben und 60 min bei 37°C inkubiert, um die Pro-MTG-His₆ zu aktivieren (aktivierter Rohextrakt).
Nach Zugabe von 666 μl 4,8 M NaCl und 400 μl Elutionspuffer (s. u.) zu 10 mL aktiviertem Rohextrakt (Endkonzentrationen: 300 mM NaCl, 20 mM Imidazol) wurden 10 mL davon mit 0,5 ml/min auf eine Streamline Chelating Sepharose FF 5 × 5 Säule (GE Healthcare, Freiburg) aufgetragen, mit Bindingpuffer (50 mM Tris/ HCl, 300 mM NaCl, 20 mM Imidazol, pH 8) gewaschen und mit Elutionspuffer (50 mM Tris/HCl, 300 mM NaCl, 500 mM Imidazol pH 8) eluiert. Die Fraktionen 0,5 ml mit einer Aktivität über 5 U/mL (Hydroxamattest) wurden gepoolt.
Die Charakterisierung der gereinigten Enzyme erfolgte wie in Beispiel 7 beschrieben.
Beispiel 5: Optimierung der Error-frone PCR Bedingungen für die random mutagenese
A. Plasmid, Plasmidisolierung und Sequenzierung
Als Ausgangsplasmid wurde das bereits beschriebene Plasmid pDJ1-3 verwendet [Marx et al., 2007]. Die Plasmidisolierung erfolgte nach Herstellerangaben mittels GeneJET Plasmid Miniprep Kit (Nr. K0503, Fermentas, St. Leon-Rot). Die Sequenzierung wurde von der Firma MWG, Ebersberg durchgeführt.
B. Error-frone PCR Bedingungen
Die Mutagenese des FRAP-MTG-Gens wurde durchgeführt mittels GeneMorph II EZClone Domain Mutagenesis Kit (Stratagene, Amsterdam, Niederlande). 500 ng Ziel-DNA (MTG-Gen in isoliertem pDJ1-3) wurden für die error-prone-PCR eingesetzt, die Annealingtemperatur betrug 60°C und es wurden 25 Zyklen durchgeführt (Whatman Biometra Thermocycler, Göttingen, Deutschland). Die verwendeten Primer lagen am Beginn und am Ende des MTG-Gens ohne Pro-Sequenz (Forward-Primer: 5'-GACTCCGACGACAGGGTCACC-3', Reverse-Primer: 5'-GAGCGGCCAGCCCTGCTTTAC). Anschließend erfolgte die Auftragung auf ein Agarose-Gel. Die Bande, die dem amplifizierten MTG-Gen entsprach, wurde ausgeschnitten und mittels MinElute Gel Extraction Kit (Qiagen, Hilden) aufgereinigt. Für die EZClone-Reaktion wurden 50 ng Template-Plasmid pJ1-3 und 250 ng mutiertes MTG-Gen als Megaprimer eingesetzt. Das Template-Plasmid wurde anschließend mit Dpnl verdaut und die resultierenden Plasmide mit mutiertem MTG-Gen in der Transformation eingesetzt.
C. Transformation
Elektrokompetente Zellen von E. coli BL21 Gold(DE3) (Stratagene) wurden hergestellt wie beschrieben [Marx et al., 2007].
1 μl Plasmid wurde in 40 μl kompetente Zellen transformiert. Die Transformation wurde mehrmals wiederholt und der Transformationsansatz auf insgesamt 30 Agar-Platten mit LB Ampicillin Medium ausplattiert. Die Platten wurden bei 37°C inkubiert und anschließend bei 4°C gelagert. Ca. 30 Platten mit jeweils ca. 200 Klonen wurden produziert.
Beispiel 6: Screening nach verbesserten Transglutaminasen
Von den Agar-Platten wurden mittels steriler Zahnstocher einzelne Kulturen gepickt und damit Medium in MTP beimpft und die Kultivierung durchgeführt wie in Beispiel 1 beschrieben. Anschließend erfolgte die Ernte, der Zellaufschluss und die Aktivierung der FRAP-MTG-His₆ bzw. deren Mutanten wie in Beispiel 2 beschrieben.
Kontrollen
In der letzten Spalte jeder MTP wurden jeweils die ersten vier Wells mit E. coli BL21(DE3) pDJ1-3 angeimpft, die letzten vier Wells blieben frei als Blank.
Screening auf thermostabile FRAP-MTG-His₆
Zum Screening auf thermostabile FRAP-MTG-His₆ wurden 50 μL des Überstandes nach der Aktivierung bei 55°C für 30 min im Wasserbad vorinkubiert. Anschließend wurde der Standardaktivitätstest wie in Beispiel 3 beschrieben durchgeführt.
Ergebnis:
Von ca. 5500 getesteten Klonen zeigten 12 eine höhere Stabilität, davon hatten 10 genau einen Aminosäure-Austausch. Von diesen 10 Mutanten zeigten 7 Mutanten Aminosäureaustausche an verschiedenen Positionen. Je eine Mutanten mit erhöhter Stabilität besaß einen doppelten bzw. einen dreifachen Aminosäureaustausch.
Beispiel 7: Detaillierte Charakterisierung von Activa WM, MTG aus Activa WM, FRAP-MTG-His₆ und FRAP-MTG-His₆ Mutanten
A. Bestimmung der Nucleinsäure bzw. Aminosäureaustausche
Von den positiven Klonen aus dem Screening (s. Beispiel 6) wurden die Plasmide isoliert und das Gen der FRAP-MTG-His₆ amplifiziert und sequenziert (entsprechend Beipiel 5).
Ergebnis:
Es wurden überwiegend einzelne Nucleotidaustausche gefunden, die in einigen Fällen zu Austauschen in den Aminosäuren führten. Die gefundenen Sequenzen für die thermostabilen Mutanten sind in Sequenzprotokoll Nr. 3–9 zusammengestellt.
B. Bereitstellung von Activa WM, MTG aus Activa WM, FRAP-MTG-His₆ und FRAP-MTG-His₆ Mutanten
100 mg Activa WM (Ajinomoto Europe Sales GmbH, Hamburg, Deutschland) wurden in 1 ml 50 mM Tris/HCl, 300 mM NaCl, 20 mM Imidazol pH 8,0 gelöst.
MTG aus Activa WM wurde entsprechend Beispiel 9 von Maltodextrin befreit und für die Charakterisierungsversuche bereitgestellt.
E. coli Mutanten von FRAP-MTG-His₆ wurden unter den gleichen Bedingungen wie der Stamm mit dem unveränderten Plasmid kultiviert [Marx et al., 2007]. Die jeweilige Pro-MTG-His₆ wurde mittels TAMEP aktiviert und mittels Affinitätschromatographie gereinigt wie in Beipiel 4 beschrieben..
Die so gereinigten Enzyme waren laut SDS-PAGE rein und wurden für die Charakterisierung eingesetzt.
C. Charakterisierung von Activa WM, MTG aus Activa WM, FRAP-MTG-His₆ und FRAP-MTG-His₆-Mutanten bezüglich der Thermostabilität.
Die isolierten Enzyme (je 30 μL) wurden im PCR-Gefäß und unter Verwendung eines PCR Thermocyclers (Whatman Biometra, Göttingen, Deutschland) bei 60°C für 10 min vorinkubiert. Anschließend wurde die Aktivität mit der MTP Version des Standardtestes nach Folk und Cole [Folk and Cole, 1966] bestimmt (s. Beispiel 7E). Die Inaktivierungskurven von Activa WM, MTG aus Activa WM, FRAP-MTG-His₆ und die ausgewählter Mutanten sind in 1 gezeigt. Die Ergebnisse für alle Mutanten sind in Tab. 6 zusammengefasst. – Thermische Stabilität von Activa WM (enthält 99% Maltodextrin), gereinigter MTG aus Activa WM, gereinigter FRAP-MTG-His₆ und zwei ausgewählten (gereinigten) FRAP-MTG-His₆ Mutanten (pCM201 (SEQ. ID N° 3), pCM203 (SEQ. ID N° 4)). 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 und 10 min Vorinkubation bei 60°C. Danach Standardaktivitätstest nach Folk und Cole [Folk and Cole, 1966].
Ergebnis:
Es wurden thermostabile Varianten gefunden, die eine deutlich langsamere Abnahme der Aktivität bei Inkubation bei 60°C als das Enzym vor der Mutation (FRAP-MTG-His₆) und auch als die aus kommerzieller Activa WM isolierte MTG. Offensichtlich stabilisiert das in der kommerziell erhältlichen Activa WM-Präparation enthaltene Maltodextrin das Enzym, da die Stabilität für dieses Enzympräparation höher ist als, für das gereinigte, maltodextrinfreie Enzym.
Die Inkubationszeit, nach der noch die halbe Ausgangsaktivität vorhanden war, konnte von 1,7 Minuten bei der FRAP-MTG-His₆ bis auf 4,6 Minuten für das Enzym pCM203(S2P) (SEQ. ID N° 4) erhöht werden. Auch die Restaktivität nach 10 Minuten Inkubation bei 60°C wurde deutlich erhöht.
D. Bestimmung der spezifischen Aktivität
Die spezifische Aktivität der Enzyme nach Beispiel 7B wurde mit dem Standardaktivitätstest nach Folk und Cole [Folk and Cole, 1966]) bestimmt.
Zu 100 μl Überstand, der das jeweilige aktivierte Enzym enthielt (s. Beispiel 4C), wurden 700 μl Hydroxamat-Testlösung gegeben (Endkonzentrationen: 0,2 M Tris, 100 mM Hydroxylamin, 10 mM reduziertes Glutathion, 30 mM Z-Gln-Gly, pH 6,0). Nach einer Inkubation bei 37°C für 10 Minuten in einem Thermomixer wurde die Reaktion mit 750 uL Reagenz A (1 Volumenteil 3 M HCl, 1 Volumenteil 12% Trichloressigsäure, 1 Volumenteil 5% FeCl₃·6 H₂O (in 0,1 M HCl)) abgestoppt. Die Extinktion wurde nach Zentrifugation bei 525 nm gemessen.
Die Proteinkonzentration der gereinigten Enzymfraktionen wurde mittels Absorption bei 280 nm bestimmt. Die Proteinkonzentration wurde bestimmt durch Messung der UV-Absorption bei 280 nm (∊^1% _{280 nm} = (5500·n_W + 1490·n_Y + 125·n_C)/(MW·10)) [Pace and Schmid, 1997]. Wobei n_W = Anzahl der Tryptophanreste, n_Y = Anzahl der Tyrosinreste und n_C = Anzahl der Cysteinreste. Die Ergebnisse für alle Enzyme sind in Tab. 6 zusammengefasst.
Ergebnis:
Die spezifische Aktivität des Ausgangsenzyms (FRAP-MTG-His₆) war mit 23 U/mg Protein ebenso hoch, wie die der MTG aus Streptomyces mobaraensis (22.6 U/mg Protein [Ando et al., 1989]. Die kommerzielle MTG Präparation (Activa WM) besitzt laut Herstellerangaben eine spezifische Aktivität von 80–140 U/g Feststoff und enthält 1% Protein und 99% Maltodextrin (entsprechend 8–14 U/mg Protein). Die gereinigte MTG aus Activa WM besaß mit 7,6 U/mg eine geringfügig höhere spezifische Aktivität als die kommerzielle Präparation.
Einige Mutanten besitzen eine verringerte spezifische Aktivität gegenüber dem Enzym aus Streptomyces mobaraensis (z. B. SEQ. ID N° 3: CM201 (Y24N) mit 18 U/mg) während eine Mutante überraschenderweise eine deutlich erhöhte Aktivität besitzt (SEQ. ID N° 4: pCM203 (S2P) mit 46,1 U/mg).
E. Charakterisierung von Activa WM, MTG aus Activa WM, FRAP-MTG-His₆ und FRAP-MTG-His₆ Mutanten bezüglich des Temperaturoptimums.
Enzymproben, die nach Beispiel 7D charakterisiert worden waren, wurden auf ca. 5 U/mL verdünnt. Anschließend wurde die Aktivität mit der MTP Version des Standardtestes nach Folk und Cole [Folk and Cole, 1966] bei verschiedenen Temperaturen (10, 20, 30, 37, 40, 50, 60, 70 und 80°C) bestimmt (s.. Je 140 μL Substratlösung wurden jeweils 2 Minuten bei der jeweiligen Temperatur unter Verwendung eines PCR Thermocyclers (Whatman Biometra, Göttingen, Deutschland) vortemperiert, bevor die Reaktion durch Zugabe von 10 μL der Enzymlösung gestartet wurde. Nach 10 min Reaktionszeit wurde die Reaktion durch Zugabe von 150 μL Reagenz A (s. Beipiel 3) abgestoppt.
In 2 ist die Abhängigkeit der Aktivität von der Reaktionstemperatur für die Activa WM, die gereinigte MTG aus Activa WM, FRAP-MTG-His₆ und für ausgewählte Mutanten dargestellt. – Spezifische Aktivität bei verschiedenen Temperaturen von Activa WM, gereinigter MTG aus Activa WM, FRAP-MTG-His₆ (SEQ. ID N° 2), der thermostabilen und aktiveren Mutante pCM203 (SEQ. ID N° 4) sowie der thermostabilen Mutante pCM224 (SEQ. ID N° 8). 2 min Vorinkubation der Substratlösung bei der jeweiligen Temperatur, dann 10 min Reaktionszeit bei 10, 20, 30, 37, 40, 50, 60, 70 und 80°C. [Folk and Cole, 1966].
Die Ergebnisse für alle Enzyme sind in Tab. 6 zusammengefasst. Die Werte für die spezifischen Aktivitäten bei 37°C liegen teilweise höher als die vergleichbaren Werte, die nach Beispiel 7D gemessen wurden. Diese Unterschiede liegen vermutlich an den sehr kleinen Volumina, die im MTP-Test verwendet wurden.
Ergebnis:
Bei thermostabilen Mutanten zeigt sich eine teilweise deutlich erhöhte Aktivität bei Temperaturen oberhalb von 50°C gegenüber

i. dem Ausgangsenzym (FRAP-MTG-His₆),
ii. der literaturbeschriebenen MTG aus Streptomyces mobaraensis ([Ando et al., 1989] und Tab. 1)
iii. der kommerziellen Enzympräparation Activa WM und
iv. gegenüber der gereinigten Form der MTG aus Activa WM.

Beispiel 8: Identifizierung von „hot spots” in der dreidimensionalen Struktur der FRAP-MTG-His₆ für die Thermostabilität
Die FRAP-MTG-His₆-Mutanten wurden entsprechend Beispiel 7 charakterisiert. Die Ergebnisse der Sequenzierung sind in 3 zusammengefasst. Es sind die Aminosäureaustausche hervorgehoben, die in thermostabilen Mutanten gefunden wurden. Primärsequenz der FRAP-MTG-His₆ aus Streptomyces mobaraensis. Markiert sind die veränderten Aminosäuren, die in thermostabilen Mutanten (grau hinterlegt) gefunden wurden.
Überraschenderweise wurde gefunden, dass sich die Mutationen in bestimmten Bereichen der Primärstruktur häufen. Sämtliche Mutationen, die zu verbesserten Eigenschaften führen liegen dabei in der linken Seitenwand bzw. am Boden der Spalte, die nach Kashiwagi, 2002 das Aktive Zentrum bildet („active site cleft) [Kashiwagi et al., 2002b](s. 4) – Kristallstruktur der FRAP-MTG aus Streptomyces mobaraensis (pdb 1iu4) [Kashiwagi et al., 2002b]. Durch „Spacefill-Darstellung” sind die veränderten Aminosäuren hervorgehoben, die in thermostabilen Mutanten gefunden wurden. Das Cys64 im aktiven Zentrum ist ebenfalls dargestellt.
Beispiel 9: Isolierung von MTG aus Activa WM
Um die Stabilität der MTG zu bestimmen, die nur zu 1% in dem kommerziellen Activa WM – Präparat enthalten ist, musste dieses Enzym zuvor von den ebenfalls enthaltenen 99% Maltodextrin befreit werden.
Dazu wurden 800 mg Activa WM (Ajinomoto Europe Sales GmbH, Hamburg, Deutschland) in 4 mL Chromatographiepuffer (50 mM Tris, 0,3 M NaCl, 20 mM Imidazol, pH 8) gelöst (Ausgangslösung Activa WM). 1 mL dieser Lösung wurde auf eine kommerzielle Gelfiltrationssäule (Superdex^TM 75 (1 cm Durchmesser, 30 cm Länge), GE Healthcare, Freiburg, Deutschland) aufgetragen.
Dabei wurde die Abreicherung von Maltodextrin mittels Reaktion mit Dinitrosalicylsäurereagenz (DNS) quantitativ verfolgt, mit dem die reduzierenden Zucker nachgewiesen werden können [Miller, 1959].
Das Elutionschromatogramm mit den Ergebnissen der Maltodextrinbestimmung und der Volumetrischen Aktivität für die MTG ist in 5 dargestellt. – Chromatogramm der Gelchromatographie (Superdex 75) zur Entfernung von Maltodextrin aus einer Lösung von Activa WM. Die Bedingungen wurden in Beispiel 9 beschrieben. Der Standardaktivitätstest erfolgte nach Folk und Cole [Folk and Cole, 1966], die Konzentration an Maltodextrin wurde mittels DNS-Reagenz nach [Miller, 1959] quantitativ bestimmt.
Die aktiven Fraktionen (je 0.5 mL) im Bereich des Elutionsvolumens von 10.00 bis 11.50 mL wurden gepoolt und für die Charakterisierung entsprechend Beispiel 7 eingesetzt.
Ergebnis:
Mittels Gelchromatographie konnte das DNS-positive Maltodextrin um 95,8% abgereichert werden.
Die so gereinigte MTG aus Activa WM wurde wie die anderen Enzyme charakterisiert (s. Beispiel 7.
Tab. 2: Gen- und Proteinsequenz der Transglutaminase Pro-MTG-His₆, mit Markierung der Primer-Positionen für die error-prone PCR (kursiv und unterstrichen).
Tab. 3: Gen- und Proteinsequenz der Transglutaminase (FRAP-MTG-His₆), die für die Mutageneseexperimente verwendet wurde.
Tab. 4: Übersicht über die Gensequenzen veränderter Transglutaminasen mit erhöhter Thermostabilität verursacht durch genau einen Aminosäureaustausch. Veränderte Nucleotide sind in fett, solche Austausche, die zu veränderten Aminosäurensequenzen führen in fett+kursiv hervorgehoben.

Tab. 5: Übersicht über die Gensequenzen veränderter Transglutaminasen mit erhöhter Thermostabilität verursacht durch mindestens zwei Aminosäureaustausche. Veränderte Nucleotide sind in fett, solche Austausche, die zu veränderten Aminosäurensequenzen führen in fett+kursiv hervorgehoben.
Erläuterung zu Abbildungen
1: Thermische Stabilität von Activa WM (enthält 99% Maltodextrin), gereinigter MTG aus Activa WM, gereinigter FRAP-MTG-His₆ und zwei ausgewählten (gereinigten) FRAP-MTG-His₆ Mutanten (pCM201 (SEQ. ID N° 3), pCM203 (SEQ. ID N° 4)). 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 und 10 min Vorinkubation bei 60°C. Danach Standardaktivitätstest nach Folk und Cole [Folk and Cole, 1966].
2: Spezifische Aktivität bei verschiedenen Temperaturen von Activa WM, gereinigter MTG aus Activa WM, FRAP-MTG-His₆ (SEQ. ID N° 2), der thermostabilen und aktiveren Mutante pCM203 (SEQ. ID N° 4) sowie der thermostabilen Mutante pCM224 (SEQ. ID N° 8). 2 min Vorinkubation der Substratlösung bei der jeweiligen Temperatur, dann 10 min Reaktionszeit bei 10, 20, 30, 37, 40, 50, 60, 70 und 80°C. [Folk and Cole, 1966].
3: Primärsequenz der FRAP-MTG-His₆ aus Streptomyces mobaraensis. Markiert sind die veränderten Aminosäuren, die in thermostabilen Mutanten (grau hinterlegt) gefunden wurden.
4: Kristallstruktur der FRAP-MTG aus Streptomyces mobaraensis (pdb 1 iu4) [Kashiwagi et al., 2002b]. Durch „Spacefill-Darstellung” sind die veränderten Aminosäuren hervorgehoben, die in thermostabilen Mutanten gefunden wurden. Das Cys64 im aktiven Zentrum ist ebenfalls dargestellt.
5: Chromatogramm der Gelchromatographie (Superdex 75) zur Entfernung von Maltodextrin aus einer Lösung von Activa WM. Die Bedingungen wurden in Beispiel 9 beschrieben. Der Standardaktivitätstest erfolgte nach Folk und Cole [Folk and Cole, 1966], die Konzentration an Maltodextrin wurde mittels DNS-Reagenz nach [Miller, 1959] quantitativ bestimmt.
ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Nicht-Patentliteratur

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Claims

Thermostabile Transglutaminasen gekennzeichnet dadurch, dass in der Aminosäuresequenz der Pro-Transglutaminase aus Streptomyces mobaraensis (SEQ. ID N° 1) einzelne oder mehrfache Mutationen in Form von Aminosäureaustauschen erzeugt werden.
Thermostabile Transglutaminasen nach Anspruch 1 gekennzeichnet dadurch, dass die Mutanten eine Veränderung des N- und/oder des C-Terminus aufweisen können.
Thermostabile Transglutaminasen nach Anspruch 1 gekennzeichnet dadurch, dass der Austausch von Aminosäuren gegen irgendeine der proteinogenen Aminosäuren in dem jeweils genannten Sequenzbereich oder gegen ein Codon auf Genebene, welches für irgendeine Aminosäure codiert, stattfindet.
Thermostabile Transglutaminasen nach Anspruch 1 bis 3 gekennzeichnet dadurch, dass die Mutation im N-Terminalen Bereich (Position –4 bis 30) oder im C-terminalen Bereich (Position 251 bis 297) liegt.
Thermostabile Transglutaminasen nach Anspruch 1 bis 4 gekennzeichnet dadurch, dass die Mutation bevorzugt im Bereich –3 bis 24 bzw. 254 bis 294 liegt.
Thermostabile Transglutaminasen nach Anspruch 1 bis 5 gekennzeichnet dadurch, dass die Mutation besonders bevorzugt an den Positionen –3; 2, 23, 24, 257, 269, 289 und 294 liegt.
Thermostabile Transglutaminasen nach Anspruch 1 bis 6 gekennzeichnet dadurch, dass die Doppelmutation im Bereich 184 bis 294 liegt.
Thermostabile Transglutaminasen nach Anspruch 1 bis 7 gekennzeichnet dadurch, dass drei Mutationen einerseits im N-terminalen Bereich (Position –4 bis 30) und gleichzeitig im C-terminalen Bereich (Position 221 bis 297) liegt.
Thermostabile Transglutaminasen nach Anspruch 1 bis 8 gekennzeichnet dadurch, dass der Austausch von Aminosäuren die Kombination der Austausche und deren Kumulierung einschließt.
Thermostabile Transglutaminasen nach Anspruch 1 bis 9 gekennzeichnet dadurch, dass durch die Mutation eine höhere spezifische Aktivität des Enzyms erzielt wird.