JPH012573A

JPH012573A - カルボキシペプチダーゼの製造方法

Info

Publication number: JPH012573A
Application number: JP62-81377A
Authority: JP
Inventors: 清菱沼; 仁志和気; 梅津　博紀
Original assignee: ぺんてる株式会社
Priority date: 1987-03-09
Filing date: 1987-04-02
Publication date: 1989-01-06
Anticipated expiration: 2010-10-18

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】（産業上の利用分野）本発明は新規なカルボキシペプチダーゼに関する。カル
ボキクペプチダーゼは、ペプチドおよび蛋白質をカルボ
キシル基末端よ〕順次遊離させる性質をもつ酵素である
。この酵素は、単独又はプロティナーゼ等との併用によ
り食品。

消化剤等の医薬品への利用、工業的にはアミノ酸混合物
製造への利用、生化学試薬として蛋白質のアミノ酸配列
の決定への利用、更に、苦味ペプチドの除去への利用な
ど、ますます重要な酵素となっている。

（従来の技術）従来、カルボキシペプチダーゼとしては９例えば、牛の
膵臓より抽出されたカルボキシペプチダーゼＡ（メソッ
ズ・イン・工ンザイモロジ−Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅ
ｎｚｙｍｏｌｏｇｙ　１９巻４７５頁）Ｉ豚の膵臓より
抽出されたカルボキシペプチダーゼＢ（メソッズ・イン
・工ンザイモロジーＭｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍ
ｏｌｏｇｙ　１９巻５０４頁）、また、植物においては
柑橘類の果皮のカルボキシペプチダーゼＣ（ネイチａｔ
　−Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄｏｎ）２０１巻６１３頁１
９６４年）、柑橘類の葉のカルボキシペプチダーゼ（ホ
ッベーザイラーズ・ツアイトシェリフト・フェール・フ
ィジオロギッシ晶・ケミストリーＨｏｐｐｅ　−８ｅｙ
ｌｅｒｓ　Ｚ。

Ｐｈｙｓｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　５５２巻、１５２４頁
、１９７１年）９４７７７１７葉の酵素（ジャーナル魯
オプ・バイオロジカル・ケミストリーＪ　、　Ｂｉｏｌ
。

Ｏｈｅｍ、　２４７巻、５５７３頁、１９７２年）。

発芽大麦の酵素（ヨーロピアン・ジャーナル・オプ・バ
イオケミストリー１ｉ１１１．　Ｊ　、　Ｂｉｏｃｈｅ
ｍ。

７巻、１９３頁、　　１９６９年）１発芽小麦の酵素（
プラント・フィジオロジーＰｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏｔ
。

５８巻、５１６頁、１９７６年）２発芽綿実の酵素（ジ
ャニナル・オプ・バイオロジカル拳ケミ　ス　ト　リ　
−　Ｊ　　、　　Ｂｉｏｌ、　　Ｃｈｅｍ、　　２　４
　７　　巻、　　　５０３４頁、５０４１頁、１９７２
年）、トマトの酵素（アグリカルチユラル・バイオロジ
カル・ケミス　ト　リ　−　Ａｇｒｉｃ、　　Ｂｉｏｌ
、　　Ｏｈｅｍ、　　　３　８　　巻、　　　　１９０
１頁、１９７４年）、スイカの酵素（アグリカルチユラ
ル・バイオロジカル・ケミストリーＡｇｒｉｃ、　Ｂｉ
ｏｌ、　Ｏｈｅｍ、　５８巻、　　１８９１頁、１９７
４年）及びプロタライン粉末中の酵素（ジャーナル・オ
プ・バイオケミストリーＪ＊　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒ
ｙ７５巻、８８１頁、１９７４年）が知られている。

しかしながら、上述せるカルボキシペプチダーゼは、そ
の原料が資源的に工業的規模の生産には適していないた
め、資源的に問題のない糸状菌からカルボキシペプチダ
ーゼを得ることがなされている。例えば、−島等による
アスペル素（ビオキミカΦビオフィジカ・アクタＢｉｏ
ｃｈｉｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ａｃｔａ　２５８巻、
２７４頁。

１９７２年）、中台等によるアスペルギルス・リカルチ
エラル・バイオロジカル・ケミストリー　Ａｇｒｉｃ、
　Ｂｉｏ、　Ｏｈｅｍ、　５６巻、　　１３４３頁。

１４７４頁、１４８１頁、１９７２年、３７巻。

１２３７頁、１９７３年）、森原等によるアメ４フー２
５３８２号公報）、横巾等によるベニ４８−５５０８４
号公報）、熊谷等によるアメ５１−９５１８２号公報）
、ホフマン等によるペニシリウム・ジャンチネラム（Ｐ
ｅｎ１ｃｉｌ目ｕｍ−ゼＳ−１とベニシロカルボキシペ
プチダーゼ５−２（メソッズ・イン・工ンザイモロジ−
Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ　４５巻
ｔ５８７頁）が知られている。

（発明の目的）本発明は、新規なカルボキシペプチダーゼを得ることを
目的とする。

（目的を達成するための手段）本願出願人は１種々の糸状菌についてスクリーニングを
した結果、パエシロマイセス属ボキシベブチダーゼを生
産することを見い出しついに本発明を完成したものであ
る。

即ち９本発明は、パエシロマイセス属に属する糸状菌か
ら得られるカルボキシペプチダーゼを要旨とするもので
ある。

以下、詳述する。

本発明に利用できるパエシロマイセス属に属する糸状菌
としては１例えば、パエシロマイセス・カルネクス（Ｐ
ａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ　ｃａｒｎｅｕｓ　）、パｅｌ
ｅｇａｎｓ　）　、パエシロマイセス・ファリノサスｒ
ｏａｅｕｓ　）　、パエシロマイセスｅイサリオイデス
（Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ　１ｓａｒｉｏｉｄｅｓ　
）　、パエシｏ−（イ七スｅジャパニクス（Ｐａｅｃｉ
ｌｏｍｙｃｅｓ　ｊａｖａｎｉｃｕｓ）。

パエシロマイセス・マルクアンディ（Ｐａｅｃｉ　ｌｏ
ｍｙｃｅｓス拳バシリスボラス（Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃ
ｅｓ　ｂａｃｉｌｌｉｓｐｏｒｕｓ）＋ｃａｎａｄｅｎ
ｓｉｓ　）　、ノモエシロマイセス・クラビスボマイセ
ス・クレメオーロセイ（Ｐａｅｃ　ｉ　Ｉｏｍｙｃｅｓ
エチロモルフイス（Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓｄａｃｔ
ｙｌｅｔｈｒｏｍｏｒｐｈｉｓ）　、パエシロマイセス
・フシスポラス（Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ　ｆｕｓｉ
ｓｐｏｒｕｓ　）　２　パエシロマイセス働グリスオビ
リティスイセス・フミコラ（Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ　ｈｕｍ
ｉｃｏｌａ　）　。

パエシロマイセスーインフラッス（Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ　１ｎｆｌａｔｕｓ　）　
、　パエシロマイセス・バリオティ・バライアティ・ア
ンティビオティクス（Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ　ｖａ
ｒｉｏｔｉ　Ｖａｔ。

ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｕｓ　）　、ノ（エシロマイセス
・）くリオティ・バライアティ・プランネオルムｖｉｒｉｄｉｓ　）＋　　ハエシロマイセス・リラシネ
スパエシロマイセス・ペルシシヌスハエシロマイセス・ストリアティスホラスパエシロマイ
セス串バリアヒリｘ　（Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓｖａ
ｒｉａｂｉｌｉｓ　）などが挙けられるが、糸状菌パエ
シロマイセス属に属するものであればその変種や変異種
に限ることなく利用でき、カルボキシペプチダーゼの生
産能の点でパエシロマイセましい。

また、カルボキシペプチダーゼは、大量に得る上で、上
記糸状菌を培養して得るが、その培養方法としては、固
体培養であっても液体培養であってもよく、固体培養を
行なう場合には。

適当な固体培地の原料９例えば、小麦皺、脱脂大豆、米
糠、菜種粕、小麦、米等から単独もしくは複数併用して
適宜選択すればよく、必要に応じて適当な栄養源を添加
してもよいものである。この原料に水を加えて蒸気加圧
殺菌後放冷し、これに糸状菌を接種して培養を行なう。

培養条件としては、糸状菌の増殖可能な温度で１５〜３
５°Ｃ１好ましくは、２０〜２５℃付近がよく、培養日
数は３〜１０日間でカルボキシペプチダーゼ生産能が最
大に達した時に培養を終了する。また、液体培養を行な
う場合には。

適当な炭素源、窒素源９例えば、小麦麩、脱脂大豆、米
糠、菜種粕、澱粉、ブドウ糠等を単独もしくは複数併用
して適宜選択したものを含有し、さらに糸状菌の生育に
必要な諸成分１例えば、リン酸塩などの無機塩、微量金
属塩を含有した培地に水を加えて、蒸気加圧殺菌後放冷
し。

これに糸状菌を接種して培養を行なう。培養条件として
は、使用菌や培地により、カルボキシペプチダーゼ生産
能が最大になるように調整され、一般に、培地のｐＨは
２．０〜６．０．培養温度は１５〜３５°Ｃで、３〜１
０日間培養を行なうのが好ましく、カルボキシペプチダ
ーゼ生産能が最大に達した時に培養を終了する。尚、液
体培養は、静置、振盪、攪拌１通気培養などいずれの培
養法を用いてもよい。

更に、固体培養をしたものでは、培養物に。

例えば、水又は適当な塩溶液、緩衝液等を加えて抽出し
た後濾過等によって処理した溶液を粗酵素液とする。液
体培養をしたものは、培養物を濾過等によって処理した
溶液な粗酵素液とすればよい。この粗酵素液は有機溶剤
等を添加することにより酵素が沈澱の形となシ、さらに
凍結乾燥等により粗酵素標品の形とするとともできる。

このようにして得た粗酵素液又は粗酵素標品は、限外濾
過等による濃縮、透析膜等を用いる透析、硫酸アンモニ
ウム、塩化ナトリウム等による塩析、各種のイオン交換
物質による吸着および溶出９分子量の差により分けるゲ
ル濾過などによって精製することができる。尚、精製法
は単独もしくは併用してもよい。

次に、このようにして得られたカルボキシペプチダーゼ
（以下本酵素と称す。）の性質について述べる。尚１本
酵素は、精製によってメイン部分である低分子型とマイ
ナ一部分である高分子型の２種・類の酵素が存在するこ
とが明らかになった。以下の性質は、低分子型の酵素に
ついて述べたものである。

（１）　　酵素活性の測定測定条件により適当に希釈した酵素液０．５艷に基質と
してカルボベンゾキシ−グルタミル−チロシンを１／２
０Ｍ酢酸ソーダー塩酸緩衝液（ｐＨ３，０）に１０−３
Ｍとなるように溶解した基質溶液０．５ｍＩ！を加え、
３０°Ｃで２０分間反応させる。その後、ニンヒドリン
試薬１．０ｍＪを加え反応を停止させる。更に。

１７２Ｍクエン酸ソーダークエン酸緩衝液。

（ｐＨ５，０）を３．０ｍｌ加え、１００℃で１５分間
加熱し９発色させた後氷水中で急冷した後２分光光度計
を用いて、５７０ｎｍの波長で吸光度を測定した。対照
は酵素液にニンヒドリン試薬を加え、その後基質を加え
、以後同様の操作をして吸光度を測定した。ニンヒドリ
ン試薬は、メチルセロソルブ１１８ｍｌ！に１／１００
Ｍ青酸カリ２ｍｌを加え、更にニンヒドリン１ｇを溶解
させ調整したものを用いた。基質から遊離するアミノ酸
量の算定標準として各測定毎に１０−４Ｍチロシン溶液
１０ｍ１にニンヒドリン試薬１．０ｍ／を加え、以後同
様の操作をして吸光度測定した。酵素活性単位は、上記
条件で１秒間に１モルの遊離チロシンを生成することの
できる酵素を１酵素活性率位１カタール（１ｋａｔ）と
した。尚。

１ナノカタール（Ｉｎｋａｔ）は１０−９カタールであ
る。

（２）　　作用酸性下で蛋白質及びペプチドのカルボキシル末端のペプ
チド結合を加水分解し、アミノ酸を逐次遊離する。

（３）　　基質特異性第１表に、カルボベンゾキシジペプチド類及びベンゾイ
ル−グリシル−リシンのカルボベンゾキシ−グルタミル
−チロシンに対する相対酵素活性を示した。

第１表　基質特異性 ※）各種アミノ酸はＬ型アミノ酸である。

各基質の濃度は１反応時に１ｍＭとなるように調整した
。

（４）　　最適作用ｐＨ第１図及び第２図に示すように１本酵素をンを基質とし
、ｐＨ２〜７の範囲で作用させたところ最適作用ｐＨは
両基質に対しても。

ｐ　Ｈ４，０であった。

（５）ｐＨ安定性第５図に示すように９本酵素は３０℃、≠１２０分間の
処理後ｐＨ２〜８の間で安定であった。

（６）　　各種阻害剤および金属塩の影響第２表に各種
阻害剤及び金属塩の影響を示した。フェニルメチルフル
オロスルホン酸（ＰＭＳ　Ｆ　）で１００％阻害され、
ペプスタチンＡで阻害をうけないことがらセリンカルボ
キシペブチダーゼであることがわかった。

尚、セリン力ルポキ７ペプチダーゼは２国際生化学連合
の命名委員会により命名されており、工ンザイムノウメ
ンクレイチャー（Ｅｎｚｙｒｎｅ　Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ、ｅｄ、
ｂｙ　ＮｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅＣｏｍｍｉｔｔｅｅ　
ｏｆ　ｔｈｒ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｕｎｉｏ
ｎ　ｏｆＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、Ａｃａｄｅｍｉｃ
　Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ。

１９８４、Ｐ２Ｏ３）に記載されている。また９本酵素
は、パラクロロマーキュリ−安息香酸により１００％阻
害されることから、酵素活性にチオール基が関与してい
るものと思われる。

第２表　各種阻害剤及び金属塩の影響（７）分子量本酵素は分子量はアントリウスの方法に準シセフ１デッ
クスａ−ｔｏｏ（ファルマシアファインケミカル社製）
のゲル濾過法により求めると第４図に示すように約４５
．０００（低分子型）であった。また、高速液体クロマ
トグラムによるＴＳＫ−ＧＥＬＧ− ５０ＱＱＳＷ（東洋曹達工業■製）カラムを用いたゲル
ろ過法により求めると、約４７、　ＯＯＯであった。ちなみに、マイナ一部分であ
る高分子型はセファデックスＱ−１００のゲル濾過法に
より求めると約９　！Ｓ、ＯＯＯであった。

（８）　　等電点フ１ルマライトＺ５〜５．０（スウェーデン。

ファルマシアファインケミカル社製）を用いた等電点電
気泳動法により２本酵素の等電点はｐ　Ｉ　４．０であ
った。

（９）　　吸光係数本酵素を凍結乾燥し２重量を測定後、２８０ｎｍにおけ
る吸光度を測定し吸光係数を求めたところＡｔ’は１４
．８であった。

（１０）反応速度論的解析第３表にカルボベンゾキシジペプチド及びベンゾイル−
グリシル−リシンを基質として用いた時の本酵素の反応
速度定数を示した。

第５表　反応速度定数＊ラインウェバーバノク（Ｌｉｎｅｗｅａｖｅｒ−Ｂｕ
ｒｋ）プロットより求めた。

（１１）ディスク電気泳動本酵素をポリアクリルアミドゲルｐ　Ｈ４，５。

ゲル濃度７．５％を用いて１本のゲル当＃）５ｍＡで、
４℃４時間電気泳動を行ない２次いでクーマシーブリリ
アントプルーＲ２５０で染色した。その結果、第５図に
示すように原点（陽極端）より、陰極側約α７ｃｍの所
に単一のバンドとして認められ２本酵素は電気泳動的均
一標品であることが明らか−になった。

１００　ｍ／三角フラスコ中で小麦皺３ｇに水２．１ｄ
を加えてよく練り、１２０℃２０分間加圧殺菌し放冷後
、予め線棒培養しておいた各種のパエシロマイセス属の
スラントカルチャーから１白金耳接種した。これを２４
℃で１日に２回振盪してフラスコ中の糸状菌をよくほぐ
し通気させ、７日間静置培養した。培養後、固体培養物
に１／２０Ｍ酢酸ノーグー塩酸緩衝液（ｐＨ五〇）５０
ｍｌを添加して激しく振盪し４℃で２時間放置後、濾過
を行ないこの戸液を粗酵素液とした。得られた粗酵素液
の酵素活性を測定し九結果を第４表に示す。

※１）醗酵研究所から入手（ＬＩＳＴ　０ＦＣＵＬＴＵ
ＲＥＳ　７ｔｈ　ｅｄ　（１９８４）記載）※２）抽出
液１ｄ当たりの酵素単位実施例２（液体培養による生産）５００　ｍｌの坂ロフラスコに、小麦瞭３ｇと脱脂大豆
１ｇにリン酸１カリウム１２ｇを含む水道水５　ｍｌを
加えてよ〈練シ、９５ｍ１の水道水を追加して、１Ｍ酒
石酸Ａ　５　ａｔでｐＨを五〇に調整後、１２０℃２０
分間加圧殺菌し放冷後、予χ ゝ０．で７日間振盪培養した。酵素の抽出は、培養物；
ンを轟２の東洋濾紙（東洋濾紙■製）で濾過を行ない、こ
のＦ液を粗酵素液とした。得られた粗酵素液の酵素活性
を測定した結果を第５表に示す。

第５表 ※１）醗酵研究所から入手（ＬＩＳＴ　０ＦＣＵＬＴＵ
ＲＥＳ　７ｔｈ　ａｄ　（１９８４）記載）※２）抽出
液１　ｍｅ当たりの酵素単位実施例５（カルボキシペプ
チダーゼの精製）小麦斂９０ｇと水道水６５ｍ１をよく
練った後１を三角フラスコ３本に分注し、１２０℃で２
０分間殺舊し培地とした。パエシロマイセス・カルネウ
ス（Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ　ｃａｒｎｅｕｓ）　Ｉ
　Ｆ　０７０１２を約１ｃｄずつ切り取った後無菌的に
細かく砕いて培地に接種し２４℃で７日間静置培養を行
なった。培養中、１日に２回振盪してフラスコ中の糸状
菌をよくほぐし通気した。培養後、培養物に１／２０Ｍ
酢酸ソーダー酢酸緩衝液（ｐ　Ｈ４，０）　９００履ｊ
を加え激しく振盪後。

２時間静置し抽出を行なった。培養物と抽出液は、ム２
東洋Ｆ紙（東洋濾紙■製）にて濾過を行ない分離した。

このＦ液に硫酸アンモニウムを４０７ｇ加えて溶解（８
０％飽和）後、１晩放置し塩析を行なった（８０％硫安
塩析）。次に遠心分離（１４，０００Ｘｇ／　１０ｍ１
ｎ　）より本酵素が沈殿として２．５２ｇ得られた。こ
の沈殿をｔ／２０Ｍ酢酸ソーダー酢酸緩衝液（ｐＨ４，
０）に溶解後、透析チューブに入れ１／２０゛：、１０
　ｍｉｎ　）　Ｌ上清液ａ　２　ａｔを得た。ここでの
本、！酵素回収率は、培養抽出物液の７２．７％となっ
た。この上清液をセファデックスＧ−１００カラム（１
，８φｘ７２ｃｍ、１／２０Ｍ酢酸ソーダー酢酸緩衝液
（ｐ　Ｈ４−０）　）でゲル濾過を行なったところ第６
図に示す如くマイナ一部分である分子量的９４０００の
高分子型、メイン部分である分子量４５．０００の低分
子型のカルボキシペプチダーゼ画分に分かれた。メイン
部分である低分子型の酵素活性を測定したところ１０９
ｎ　ｋ　ａ　ｔ　／　ｒｓｌ　、比活性７４．７　ｎ　
ｋ　ａ　ｔ　／　Ｒ１であった。この低分子画分は５１
Ｍ／得られ１回収率は４５．２％であった。次に、得ら
れた低分子画分を、１／２０Ｍ酢酸ノーグー酢酸緩衝液
（ｐＨ４，５）で透析後、透析液をＤＥＡＥ−セルロー
ス（ＤＥ３２）（イギリス、ワットマシ社製）力２ム（
１，８φｘ　４１　ａｎ　、　１　／　２０　Ｍ酢酸ノ
ーグー酢酸緩衝液（ｐ　Ｈ４−５）　）に吸着させた後
。

上記緩衝液ｐ　Ｈ４，５で１／２０Ｍより１／２Ｍまで
の濃度勾配させて、イオン交換クロマトグラムを行なっ
た。（第７図にＤＥＡＥ−セルロース（ＤＥ５２）によ
るイオン交換クロマトグラムの溶出パターンを示した。

）得られたメイン画分は５５ｄであり、酵素活性は５＆
７ｎｋａｔ／　ｍｅ　、比活性は２４５　ｎｋａｔ　／
　Ａ２８０　、回収率は２４．０％であった。更に、Ｄ
ＥＡＥ−セル′ロース（ＤＥ３２）カラムを用いた再ク
ロマトグラムを行なった。カラムは１．８φＸ　４１　
ｃｍ　。

１／２０Ｍ酢酸ソーダー酢酸緩衝液（ｐ　Ｈ４，５であ
らかじめ平衡化しておき　　ｍ　　　−÷杢゛　　　　
　　　　　上記後漬液（ｐ　Ｈ４，５）で１１５Ｍよシ１／２Ｍまでの濃
度勾配溶出を行ない、カルボキシペプチダーゼ活性のメ
イン画分を精製酵素標品として増得した。この操作よシ
、酵素活性４６．７　ｎｋａｔ／ｍｌ　、比活性５１５
　ｎｋａｔ／　Ａ２８０の酵素液５０ｍ／を得た。（第
８図にＤＥＡＥ−セルロース（ＤＥ３２）によるイオン
交換クロマトグラムの溶出パターンを示した。）尚、抽
出工程以後の作業はすべて４℃で行なった。

（発明の効果）以上の如く本発明によれば、パエシロマイセス属に属す
る糸状菌から、新規なカルボキシペプチダーゼを得るこ
とができる。また、原料として糸状菌を用いていること
から、大量生産するための培養が容易であり工業的規模
の生産に適している。

【図面の簡単な説明】

第１図は、カルボベンゾキシ−グルタミル−チロシンを
基質としたときの本酵素の作用ｐＨ範囲を示す図、第２
図は、カルボベンゾキシ−フェニルアラニル−アラニン
を基質としたときの本酵素の作用ｐＨ範囲を示す図、第
５図は本酵素の安定ｐＨ範囲を示す図、第４図は２本酵
素の分子量を示す図、第５図は２本酵素のディスク電気
泳動の図、第６図は２本酵素のセファデックスＱ−１０
０によるグル濾過の溶出パターンを示す図、第７図は２
本酵素のＤＥＡＥ−セルロースによるイオン交換クロマ
トの溶出パターンを示す図、第８図は２本酵素のＤＥＡ
Ｅ−セルロースによるイオン交換再クロマトの溶出パタ
ーンを示す図である。

Claims

【特許請求の範囲】

パエシロマイセス属に属する糸状菌から得られるカルボ
キシペプチダーゼ。