JP5515017B2 - 脱色用プロテアーゼを用いる着色成分の脱色方法 - Google Patents
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この様な問題に対処するため、現在では微生物による脱色作用の応用が注目されていきている。
具体的には、リグニン、染料、フミンおよびメラノイジンの着色成分を効率よく脱色する優れたアスペルギルス・フミガタス(Aspergillus fumigatus)による着色溶液の脱色方法が提案されている(特許文献1)。
このアスペルギルス・フミガタスによる脱色の際に前記アスペルギルス・フミガタス自体が着色してくることから、大部分は前記アスペルギルス・フミガタスの吸着による脱色作用であることが示唆されている(特許文献2)。
本発明の目的は人体に対する影響の少ない微生物を用いて、着色溶液等に含まれる着色成分を脱色する作用のある脱色用プロテアーゼを提供することにある。
[1]アスペルギルス レペンス(Aspergillus repens)を培養して得られる脱色用プロ
テアーゼを用いる着色成分の脱色方法であって、
前記アスペルギルス レペンス(Aspergillus repens)が、独立行政法人 製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センターに受託番号NITE P−73菌株として寄託されたものであり、
前記脱色用プロテアーゼが、前記アスペルギルス レペンス(Aspergillus repens)を
、水を含む培地により15〜55℃の範囲で12時間〜12日の間培養し、得られた培養液の不溶分を除去した溶液に含まれるものであり、
前記脱色用プロテアーゼの分子量が、45000〜66000の範囲であり、
前記脱色用プロテアーゼのN末端アミノ酸配列の末端の7個のアミノ酸がAla−Ala−Glu−Gly−Ala−Val−Glyの順に配列し、
前記着色成分が、ヘモグロビンおよびミオグロビンの少なくとも一方であることを特徴とする、着色成分の脱色方法を提供するものである。
また前記脱色用プロテアーゼは鰹節かび菌を培地で培養することにより簡便に得られることから量産性、経済性に優れる。
さらに前記脱色用プロテアーゼは食品用途に応用されている鰹節かび菌により得られることから比較的人体に対する影響が少ないプロセスにより得ることができ、特に食品、化粧品分野等の脱色用途に好適に使用することができる。
前記アスペルギルス レペンスの培養には、鰹節かび菌の培養に用いられている公知の培地用成分を使用することができる。
植物、動物由来のでんぷん、抽出液等、
エタノール、グリセリン等の水酸基含有化合物等を挙げることができる。
また培養に使用する窒素源としては、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、硝酸アンモニウム、尿素等を挙げることができる。
また培養に使用するリン源としては、リン酸アンモニウム、リン酸ナトリウム等を挙げることができる。
また培養に使用するカリウム源としては、塩化カリウム、硝酸カリウム等を挙げることができる。
前記アスペルギルス レペンスの培養を行うときの時間は、12時間〜12日の範囲であることが好ましく、より好ましくは2〜11日の範囲であり、さらに好ましくは3〜10日の範囲である。
前記アスペルギルス レペンスの培養を行うときのpHは、2〜8の範囲の範囲が好ましく、より好ましくは3〜7の範囲であり、さらに好ましくは4〜6の範囲である。
この様にして得られた脱色用プロテアーゼを、ミオグロビン、ヘモグロビン等の着色成分と接触させることにより、前記着色成分を脱色させることができる。
前記着色成分の脱色は、前記脱色用プロテアーゼと前記着色成分とを水溶液中で接触させる方法等により行うことができる。
前記アスペルギルス レペンス(Aspergillus repens)MK82の微生物学上の特徴は次の通りである。
25〜30℃の範囲で良好に生育する。
(2)生育pH
pH3.0〜pH8.0の範囲で生育が可能である。
(3)培地選択性
寒天培地上で、ツァペック・ドッグス培地、PDA培地(ポテトデキストロース寒天培地)、MY20培地(ぶどう糖200g、ペプトン5g、麦芽エキス3g、酵母エキス3gおよび蒸留水1リットルの組成)、サブロー培地で生育が可能であったが、コーンミール培地で生育させることはできなかった。
(4)顕微鏡を使用した形態観察結果
ホウキ状に配列した梗子をもち、その先端に分生子の数珠上の連鎖を生じる形態が観察された。
(5)MY20寒天培地上でのコロニーの様子
観察開始初期には白色の毛足の長いコロニーを形成した。その後、次第に黒褐色の毛足の短いコロニーへと変化することが確認された。
(1−1)前培養の工程
表1に示す液体培地7.0mlを培養チューブに入れ、アスペルギルス レペンス(Aspergillus repens)MK82を白金耳により一回植菌し、30℃の温度で2日間振盪培養した。この際の振盪速度は210rpmとした。
前培養により得られた前記培養チューブ3本を、表1に示す液体培地400mlを含む3リットルフラスコに添加し30℃で振盪培養した。この際の振盪速度は140rpmとした。培養後、培養液を遠心分離(8000×g、10分、4℃)して不溶分を除去し、得られた上清を脱色用プロテアーゼ溶液として以後使用した。
ミオグロビン溶液(1.2mg / ml)、ヘモグロビン溶液(1.2mg/ml)0.75mlに、前記脱色用プロテアーゼ溶液0.11mlを添加し撹拌した。24時間後、反応溶液を遠心分離(13000×g、10分)し、上澄み液を希釈して吸光度を測定した。ミオグロビンの場合は408nmで、ヘモグロビンの場合は404nmにおいて吸光度を測定した。脱色反応は25℃、24時間反応させた。
1unit = (K‐S)× 希釈倍率×1/0.11
K:コントロールの吸光度
S:培養液を添加した反応溶液の吸光度
前培養により得られた前記培養チューブ3本を、表1に示す液体培地400mlを含む3リットルフラスコで培養し、培養液を経時的に無菌でサンプリングし、13000rpm、4℃、10分の条件で遠心した。
前記遠心分離の際の速度は6000〜20000rpmの範囲が好ましく、8000〜16000rpmの範囲であればより好ましい。
得られた上清を脱色活性測定に用いた。結果を図1に示す。
(2−1)ゲル濾過クロマトグラフィーによる精製
脱色用プロテアーゼ溶液を濃縮してからゲル濾過クロマトグラフィーを行い、前記脱色用プロテアーゼを精製した。
まず脱色用プロテアーゼ溶液をエバポレーターにより減圧下に濃縮し、濃縮液を0.2M NaClを含む酢酸緩衝液(pH5、20mM、以下「buffer A」という。)により平衡化した商品名TOYOPEARL HW−55F(東ソー社製)を充填したカラム(4.0×33cm)により分離した。
前記buffer Aを用いて流速20ml/hで前記脱色用プロテアーゼを溶出した。各フラクション(2.5 ml/tube)の前記脱色用プロテアーゼの活性を測定し,高活性画分(ピーク時の活性の50%以上の活性を持つ画分)を集めた。これをフラクション1とする。
前記フラクション2を前記buffer A 1リットルに対して1回目は3時間、2回目は12時間透析した。前記buffer Aで平衡化したDE−52 cellulose(Whatman Chemical Separation社製、商品名Clifton、米国)を充填したカラム(1.6×12.5cm)により分離した。buffer Aでカラムを洗浄した後、0〜0.5M NaClを含むbuffer Aを用いてリニアグラジエント法により、流速40 ml/hで脱色用プロテアーゼを溶出した。各フラクション(3.0 ml/tube)の脱色活性活性を測定した。結果を図2に示す。
脱色用プロテアーゼ溶液に、30%、50%、80%飽和となるように硫酸アンモニウムを添加した。各段階で得られた沈殿を酢酸緩衝液(pH5.0、20mM)で溶解し、透析した後脱色測定を行った。その結果、脱色用プロテアーゼの活性は見られなかった。
脱色用プロテアーゼ溶液を透析したのち、DE−52 カラムクロマトグラフィーに供することによって脱色用プロテアーゼの活性の精製を行った。その結果、脱色用プロテアーゼの活性はDE−52に吸着し、NaClを含む酢酸緩衝液で溶出されたが、活性は非常に低い値となった。
脱色用プロテアーゼの活性が、低分子有機化合物でアミン類、またはカルボン酸類、フェノール類・中性物質に由来するものであるかどうかを検討するために溶媒抽出を行った。
脱色用プロテアーゼ溶液をジエチルエーテルにより抽出し、このエーテル抽出液を用いて公知の方法によりアミン類、カルボン酸類、フェノール類・中性物質へと分類する操作を行った。
脱色用プロテアーゼ溶液を透析して脱色活性を測定した結果、残存活性は50%であった。
(3−1)ディスクポリアクリルアミドゲル電気泳動(PAGE)
Davisらの方法(B. J.Davis:Disk electrophoresis. ll. Method and application to human serum proteins.Ann. N.Y. Acad. Sci.,404-427(1964))により、7.5%(w/v)ポリアクリルアミドゲル(pH8.0)、Tris−glycine(pH8.3)の泳動用緩衝液を用いて、2.5mA/tubeの条件で3.0時間泳動した。タンパク質の染色は0.25%(w/v)Coomassie brilliant blue R−250/エタノール−酢酸−水(9:2:9)溶液で1時間行い、エタノール−酢酸−水(25:8:65)溶液に3時間浸漬して脱色後、エタノール−酢酸−水(10:15:175)溶液中に保存した。
結果を図3(a)に示す。単一なタンパク質のバンドが得られた。
脱色用プロテアーゼを12%(w/v)ポリアクリルアミドゲルおよび0.1%(w/v)SDS−Tris−glycine(pH8.3)の泳動用bufferを用いて、200Vの条件で40分間泳動した。分子量マーカーとして、Low Molecular Weight [LMW] Calibration kit(Amarsham Pharmacia Biotech、Uppsala)を使用した。すなわち、α‐ラクトアルブミン(分子量14,400)、トリプシンインヒビター(分子量20,100)、カルボニックアンヒドラーゼ(分子量30,000)、オブアルブミン(分子量45,000)、ウシ血清アルブミン(分子量66,000)、ホスホリラーゼb(分子量97,000)である。染色および脱色は、B. J.Davis:Disk electrophoresis. ll. Method and application to human serum proteins.Ann. N.Y. Acad. Sci.,404-427(1964)、生化学実験講座1 タンパク質の化学1(東京化学同人)に記載の方法に従った。
結果を図3(b)に示す。分子量45,000〜66,000の範囲内にある単一なタンパク質のバンドが得られた。
実施例2のゲル濾過法の結果を図4に示す。脱色用プロテアーゼの分子量は45,000であった。
また実施例3のスラブSDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS−PAGE)の結果、分子量は54,000であった。
以上より、前記脱色用プロテアーゼの分子量は好ましくは45,000〜54,000の範囲内にああることが判明した。
紫外線吸光度測定装置 HITACHI U−2800A spectrophtometerにより脱色用プロテアーゼ248μg/mlの吸収スペクトルを測定したところ、276nmで極大吸収がみられた。結果を図5に示す。
(6−1)脱色用プロテアーゼに与えるpHの影響
50mM酒石酸−酒石酸カリウム・ナトリウム緩衝液(pH2.5〜3.0)、50mM酢酸ナトリウム緩衝液(pH4.0〜5.0)および50mMリン酸カリウム−ナトリウム緩衝液(pH6.0〜8.0)を用いて、ミオグロビン、ヘモグロビンのpHを調製し、24時間脱色活性反応を行なった。結果を図6に示す。
なお脱色用プロテアーゼのタンパク質量は0.38μgである。
脱色用プロテアーゼはpH2.0〜4.0において最も高い脱色活性を示した。
20mM酢酸緩衝液(pH5.0)を用いて,20〜90℃の各温度で15時間脱色活性反応を行なった。結果を図7に示す。
なお脱色用プロテアーゼのタンパク質量は0.65μgである。
50℃において最大活性を示した。また90℃以上においては活性を示さなかった。
脱色用プロテアーゼをそれぞれ50 mM酒石酸−酒石酸カリウム・ナトリウム緩衝液(pH2.0〜3.0)、50mM酢酸ナトリウム緩衝液(pH4.0〜5.0)および50mMリン酸カリウム−ナトリウム緩衝液(pH6.0〜8.0)で、4℃、24時間透析処理後、処理前のpHに戻して残存する脱色活性をpH5.0で測定した。結果を図8に示す。
脱色用プロテアーゼはpH2.0〜5.0では、4℃で24時間処理しても高い残存活性を示した。またpH3.0〜5.0の処理において最も安定であった。脱色用プロテアーゼはpH8.0で完全に失活した。
20mM酢酸緩衝液(pH5.0)を用いて、脱色用プロテアーゼを20〜75℃の各温度で20分間加熱処理した後、24時間脱色活性反応を行い残存する活性を測定した。結果を図9に示す。
脱色用プロテアーゼに与える金属イオン、システインプロテアーゼ阻害試薬、金属プロテアーゼ阻害試薬、セリンプロテアーゼ阻害試薬および酸性プロテアーゼ阻害試薬の影響を調べた。脱色用プロテアーゼに終濃度が1.0mMとなるように各種試薬溶液を添加して25℃で24時間反応させ、これら各種試薬存在下で脱色活性を測定した。
脱色用プロテアーゼの脱色活性はHg2+によって促進された。Fe2+、Fe3+およびCu2+は脱色用プロテアーゼの脱色活性を阻害した。また、Papstatinも脱色用プロテアーゼの脱色活性を阻害した。
結果を表2に示す。
BSA、卵白アルブミン、チトクロームc、ペルオキシダーゼ、フェリチンに対する凝集(脱色)活性測定を行なった。BSA、卵白アルブミンは反応後0時間と24時間後の上清の278nmにおける吸光度とタンパク質濃度を測定した。
上記実施例1〜7により使用したヘモグロビンはウシ由来である。ブタ由来、ヒト由来のヘモグロビンに対する脱色活性について調べた。
結果を表3に示す。
脱色用プロテアーゼ溶液を各塩濃度に調製し脱色活性を測定した。
結果を図10に示す。
異なる基質濃度で脱色用プロテアーゼの脱色活性を測定した。基質濃度の単位はmg/mlである。反応液のpH5.0で、ミオグロビン、ヘモグロビンとも基質濃度0.8mg/ml以上では活性に変化が見られなかった。結果を図11〜図13に示す。
脱色用プロテアーゼ29μgを、プロティアンミニ II(商品名Bio−Rad、Richmond社製)を用いたスラブゲル‐ポリアクリルアミドゲル電気泳動に供した。電気泳動後、BIO−RADミニトランスブロット(Bio−Rad社製)を用いて、スラブゲルから脱色用プロテアーゼをポリビニリデンジフルオライド(PVDF)膜(商品名GVHP304FO、ミリポア社製)に転移した。
PVDF膜を、0.1%(w/v)クマシーブリリアントブルーR−250を含む50%(v/v)メタノール溶液で染色した後、メタノール−酢酸−水(5:1:4)の溶液で脱色した。PVDF膜上で染色した脱色用プロテアーゼを膜ごと切り出し、N末端配列の分析に用いた。N末端アミノ酸配列は、プロテインシーケンサーPPSQ−10(嶋津社製)を用い、自動エドマン分解の各サイクルで生成したPTH−アミノ酸を高速液体クロマトグラフィーで同定することにより分析した。
脱色用プロテアーゼのN末端アミノ酸配列はAla−Ala−Glu−Gly−Ala−Val−Glyであった。
詳細は配列表に記載の通りである。
プロテアーゼ活性は、カゼインを基質とし、pH5.0にて酵素反応後にカゼインから遊離したペプチドをFolin法を用いて発色させ、600nmにおける吸光度の増加に基づいて定量することにより測定した。
この結果、プロテアーゼ活性を有していることが確認できた。
脱色活性とプロテアーゼ活性には相関性があった。
最も脱色活性の高かったフラクションは、プロテアーゼ活性においても最も高い活性を示した。
結果を図14に示す。
なお、これらの実施には次の文献を参照した。
・Folin,O.&Ciocalteau,V.:Tylosine and tryptophan determination in proteins.
J.Biol.Chem.73,627-650(1927)
・Lowry,O.H.,Rosebrough,N.J.,Farr,A.L.&Randall,R.J.:Protein measurement with the Folin phenol reagent.
J.Biol.Chem.193,265-275(1951)
・参考文献:新・タンパク質精製法 理論と実際
(Springer シュプリンガー・フェアラーク東京)
基質にカゼイン、ヘモグロビン、ミオグロビンを用いて各基質に対するプロテアーゼ活性pH依存性について調べた。結果を図15および図16に示す。
カゼイン、ミオグロビンはpH2、ヘモグロビンはpH2.6のとき最も高い活性を示した。また、酸性側で活性がみられた。
脱色用プロテアーゼに酸性プロテアーゼ阻害剤を終濃度で1.0mMとなるように添加しプロテアーゼ活性を測定した。基質はカゼイン(pH2.0)を用いた。
プロテアーゼ活性はPepstatinによって阻害された。また、Pepstatin存在下で脱色活性反応を行った結果、脱色活性は示さなかった。
結果を表4に示す。
脱色用プロテアーゼの替わりに各種プロテアーゼを用いて脱色活性反応を行い、各種プロテアーゼが脱色作用を持つのか調べた。脱色活性は各プロテアーゼの最適pHの条件下で測定した。
各種プロテアーゼは脱色活性を示したが、その相対活性は脱色用プロテアーゼに比べ極めて低かった。
サーモライシン、α−キモトリプシンはミオグロビンの上清の吸光度を減少させたが、沈殿は形成しなかった。ヘモグロビンは沈殿を形成した。
基質にカゼインを用いてプロテアーゼ活性を測定した結果を表5に示す。
結果を表6に示す。
結果を表7に示した。結果は相対活性で示した(U/mg)。
加えてこれまで鰹節の生産には原料の鰹の血合部分を事前に除去することにより製造される鰹節の色調の改善が図られてきたが、本発明により得られる脱色用プロテアーゼを使用することにより、前記除去工程を省略することも可能となることから鰹節の生産工程を簡略化することができ、単位時間当たりの生産量を増加させることが可能となる。
また鰹、鮪等を原料とする缶詰の製造には血合部分を事前に除去する工程が必要となるが、本発明の脱色用プロテアーゼを用いることによりこの除去工程が不要となる。このため鰹、鮪等を原料とする缶詰の生産効率を向上させることができる。
また衣服や手足に付着した血液汚れを効率的に脱色させることが可能となることから、医療業務等や動物の解体作業等に従事する際に生じる血液汚れを落とす洗剤用途等にも応用することができる。
2 ミオグロビン
3 カゼインを用いたプロテアーゼ活性
Claims (1)
- アスペルギルス レペンス(Aspergillus repens)を培養して得られる脱色用プロテアーゼを用いる着色成分の脱色方法であって、
前記アスペルギルス レペンス(Aspergillus repens)が、独立行政法人 製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センターに受託番号NITE P−73菌株として寄託されたものであり、
前記脱色用プロテアーゼが、前記アスペルギルス レペンス(Aspergillus repens)を、水を含む培地により15〜55℃の範囲で12時間〜12日の間培養し、得られた培養液の不溶分を除去した溶液に含まれるものであり、
前記脱色用プロテアーゼの分子量が、45000〜66000の範囲であり、
前記脱色用プロテアーゼのN末端アミノ酸配列の末端の7個のアミノ酸がAla−Ala−Glu−Gly−Ala−Val−Glyの順に配列し、
前記着色成分が、ヘモグロビンおよびミオグロビンの少なくとも一方であることを特徴とする、着色成分の脱色方法。
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