CN1214084A - 冷活性蛋白酶cp70 - Google Patents

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CN1214084A
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A·K·M·Q·哈桑
E·坦米雅
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Procter and Gamble Co
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Abstract

这里公开了一种嗜冷蛋白酶,它具有以下物理化学物质:(a)比活和底物专一性:该蛋白酶作用于酪蛋白、明胶、血红蛋白和白蛋白,以酪蛋白、明胶、血红蛋白和白蛋白的顺序特异地分解它们;(b)最适pH:8.0;(c)pH稳定性:该蛋白酶在pH6.5至pH10.0的范围内在30℃稳定1小时;(d)最适温度:大约40℃;(e)温度稳定性:在pH7为1小时,在低于30℃的温度,该酶几乎不失活,但在40℃它失活大约40%,并且在50℃在大约10分钟内完全失活;(f)酶活性:在20℃该蛋白酶具有其最大活性的大约50%或更多;(g)该酶的活性中心是丝氨酸;以及(h)以SDS－PAGE测定,其分子量大约为70kDa。

Description

冷活性蛋白酶CP70
                  发明背景
(ⅰ)发明领域
本发明涉及在低温下具有高活性的一种蛋白酶和它的应用。
(ⅱ)相关技术的描述
长期以来人们已经知道嗜冷细菌，并且在低温环境中可广泛地证实它们的存在。例如，可从土壤、水产品、乳制品以及人工低温环境中分离嗜冷细菌。已经根据食品微生物学的要求进行嗜冷细菌的研究，但主要限于关于微生物种系发生的那些研究。
预期从嗜冷细菌获得的酶是在低温范围内具有最佳温度的冷活性酶。认为可将在低温下有效地作用的冷活性酶能够加入例如即使在低温的水中也可使用的洗涤剂。也认为可应用于在常温下挥发的有机溶剂存在下的化学反应和在食品不会腐败的低温下食品质量的提高。而且，对从嗜冷细菌获得的酶的研究十分有趣地揭示了嗜冷细菌的生理功能和适应低温机制。
                  发明概述
本发明人现已发现，可从大比目鱼黄杆菌P104株培养基的上清液中分离一种蛋白酶，然后纯化，所述分离和纯化的蛋白酶在低温下有活性。本发明基于这种认识。
因此，本发明的目的是提供一种冷活性蛋白酶。
本发明的另一目的是提供利用大比目鱼黄杆菌P104株制备上述冷活性蛋白酶的方法。
本发明的再一目的是提供包含存在于所述冷活性蛋白酶N末端的氨基酸序列的肽。
按照本发明的蛋白酶具有部分或全部的以下物理化学性质。
-比活和底物专一性：该蛋白酶作用于酪蛋白、明胶、血红蛋白和白蛋白，按照酪蛋白、明胶、血红蛋白和白蛋白的次序特异地分解它们。
-最适pH:8.0
-pH稳定性：该蛋白酶在pH6.5至pH10.0的范围内于30℃稳定1小时。
按照本发明的蛋白酶还具有部分或全部以下物理化学性质。
-最适温度：大约40℃
-温度稳定性：在pH7为1小时，该蛋白酶在30℃以下的温度几乎不失活，但在40℃失活大约40％，而在50℃在大约10分钟内完全失活。
-酶活性：该蛋白酶在20℃具有它的最大活性的大约50％或更多的活性。
-该酶的活性中心是丝氨酸。
-用SDS-PAGE测定该蛋白酶的分子量大约为70kDa。
此外，按照本发明的该蛋白酶包括含有部分或全部SEQ ID NO:1所述氨基酸序列的蛋白、或在其N末端含部分或全部SEQ ID NO:1中描述的氨基酸序列的蛋白。
按照本发明的另一方面，我们提供在20℃具有其最大活性的大约50％或更多活性的蛋白酶。
按照本发明的其它方面，我们提供一种蛋白酶，它包括含部分或全部SEQ ID NO:1中描述的氨基酸序列的蛋白、或在其N末端含部分或全部SEQ ID NO:1中描述的氨基酸序列的蛋白。
按照本发明制备上述蛋白酶的方法，包括培养大比目鱼黄杆菌P104(FERM BP-5006)用来产生蛋白酶，然后从其培养基中收集该蛋白酶的步骤。
                 附图简述
图1图示按照本发明的酶的纯化结果。
图2图示测定按照本发明的酶的分子量的标准曲线。
图3图示pH对按照本发明的酶的酶促反应的影响。每个黑色圆圈代表在pH7.0下按照本发明的酶，每个黑色三角形代表在pH10下按照本发明的酶，以及每个白色方块在pH7下的Savinase。
图4图示按照本发明的酶的pH稳定性。每个黑色圆圈代表在10℃的测定值，每个黑色三角形代表在20℃的测定值，每个黑色方块代表在30℃的测定值，每个白色圆圈代表在40℃的测定值，每个白色三角形代表在50℃的测定值，以及每个白色方块代表在60℃的测定值。
图5图示温度对按照本发明的酶的酶促反应的影响。
图6图示按照本发明的酶的温度稳定性。
                    本发明的详细描述酶的特征
按照本发明的酶的特征如下：
(1)比活和底物专一性
按照本发明的酶作用于酪蛋白、明胶、血红蛋白和白蛋白以特异地分解它们。该酶的底物专一性以酪蛋白、明胶、血红蛋白和白蛋白的次序减低。
(2)最适pH
按照本发明的酶的最适pH是8.0。而且，在pH6.5至pH9.5范围内该酶保持最大活性的大约90％或更多。
(3)pH稳定性
按照本发明的酶在pH6.5至pH10.0范围内，在30℃稳定1小时。
(4)最适温度
按照本发明的酶的最适温度在pH10和pH7为40℃。在30℃温度，在pH10该酶保持大约80％的最大活性，而在pH7该酶保持大约90％的最大活性。在50℃温度，在pH10该酶保持大约10％的最大活性，而在pH7该酶保持大约80％的最大活性。
关于市售酶savinase，它的最适温度是60℃。另外，关于大多数已知的嗜冷酶，它们的最适温度为大约40℃。因此，可认为按照本发明的酶是一种嗜冷酶。
(5)温度稳定性
在pH7下1小时，按照本发明的酶在低于30℃的温度下几乎不失活，但它在40℃失活大约40％，而在50℃在大约10分钟内完全失活。因此，可认为按照本发明的酶是一种嗜冷酶。
(6)酶活性
按照本发明的酶在20℃具有其最大活性的大约50％或更多。
结果，按照本发明的另一方面，我们提供在20℃具有其最大活性的大约50％或更多的蛋白酶。
(7)活性的抑制
任何胃蛋白酶抑制剂、L-反式-环氧琥珀酰亮氨酸酰氨基-4-胍基丁烷(E-64)、碘乙酰氨和1,10-菲咯啉都不能抑制按照本发明的酶的蛋白酶活性，但它可被苯甲磺酰氯(PMSF)和乙二胺四乙酸(EDTA)明显抑制。鉴于这个事实，可以提议按照本发明的酶是一种丝氨酸蛋白酶。因此，可认为按照本发明的酶的活性中心是丝氨酸。
(8)分子量
按照本发明的酶以SDS-PAGE测定，具有大约70kDa的分子量。
(9)N末端的氨基酸序列
在SEQ ID NO:1中描述了按照本发明的酶的N末端氨基酸序列。关于按照本发明的酶的N末端氨基酸序列，利用数据库“Entrez”检查了与已知蛋白的每个氨基酸序列的同源性，结果，显然所述N末端氨基酸序列与已知蛋白的任何氨基酸序列没有同源性。因此，按照本发明的蛋白酶可以包括含部分或全部SEQ ID NO:1中描述的氨基酸序列的蛋白，或包括在其N末端含部分或全部SEQ ID NO:1中描述的氨基酸序列的蛋白。
而且，按照本发明的其它方面，我们提供包括含部分或全部SEQID NO:1中描述的氨基酸序列的蛋白的蛋白酶，以及包括在其N末端含部分或全部SEQ ID NO:1中描述的氨基酸序列的蛋白的蛋白酶。这种蛋白酶可以具有在上述(1)至(8)描述的这类特征。
这里，“含部分或全部SEQ ID NO:1中描述的氨基酸序列的蛋白”包括其中部分或全部SEQ ID NO:1中描述的氨基酸序列的N末端和/或C末端加入一个任选的氨基酸序列的蛋白。
蛋白酶的制备方法
利用微生物可生产按照本发明的蛋白酶。生产微生物属于产黄菌属，并且任何微生物都可用，只要它们具有产生蛋白酶的能力。
具有生产按照本发明的蛋白酶的能力的微生物的优选实施例是大比目鱼黄杆菌P104株。该菌株是由本发明人从鲑鱼的肠中分离的微生物，并且于1995年2月17日将它们保藏在工业科学技术局，生物技术研究所，保藏号为FERM BP-5006。
在培养可用于本发明的菌株中，培养基可以是液体或固体，但通常使用用液体培养基的震荡培养或通气旋转培养。
作为这里培养微生物的培养基，可用任何培养基，只要它可生产蛋白酶。也就是说，作为碳源，可使用例如葡萄糖、海藻糖、果糖、麦芽糖、蔗糖、淀粉和麦芽寡糖。作为氮源，可使用例如胨、酵母提取物、麦芽提取物、肉膏、大豆粉、棉子粉、球果浆、各种氨基酸和它们的盐、以及硝酸盐。可用于本发明的合成培养基或天然培养基适当地含上述碳源和氮源、无机盐(如磷酸镁、钙盐、钠盐、钾盐、铁盐和锰盐)以及其它需要的营养物。
可适当地改变培养条件，诸如pH和培养基的培养温度，只要它们允许蛋白酶产生，但在震荡培养或通气旋转培养的情况下，最好pH为大约中性，并且培养温度为10℃至20℃。
本发明的蛋白酶存在于细菌的细胞壁、所述细菌细胞和培养基的上清液中，并且它可以以任何形式使用，诸如细菌细胞、从所述细菌细胞或所述培养基上清液获得的粗品酶或提取并纯化的酶。另一方面，也可使用通过已知方法固定化的蛋白酶。
为了从培养基收集和纯化本发明的蛋白酶，可将已知的纯化方法单独使用或与其联合使用。
因为按照本发明的蛋白酶主要分泌到细胞外，即进入培养基，因此通过借助于过滤或离心除去所述细菌细胞可容易地获得粗品酶。可以通过通过已知的纯化方法进一步纯化该粗品酶。已知的优选纯化方法的实例包括用盐(如硫酸胺)的盐析法、用有机溶剂(如甲醇、乙醇或丙酮)的沉淀法、用粗制淀粉的吸收法、超滤法和各种层析方法，诸如凝胶过滤层析和离子交换层析。优选纯化方法的典型实施方案将在以下实施例中描述。
酶的应用
按照本发明的嗜冷蛋白酶具有在低温范围内的最适温度。因此，本发明的嗜冷蛋白酶允许蛋白的分解反应在低温环境中进行。例如，可通过将按照本发明的蛋白酶加入用于衣物的洗涤剂组合物，制备即使在低温中也可使用的洗涤剂。除了加入按照本发明的嗜冷蛋白酶外，可根据常规方法制备该洗涤剂组合物。也就是说，可通过将本发明的蛋白酶与普通洗涤剂成分(诸如用于洗涤剂的表面活性剂、漂白剂、助洗剂等)混合形成该洗涤剂。
而且，按照本发明的嗜冷蛋白酶能够使所述反应在低温下进行。因此，即使在所述反应系统中存在一种在常温下挥发的有机溶剂，在有机溶剂成分不挥发的低温下也可进行所述反应。此外，当尝试利用按照本发明的嗜冷蛋白酶提高食品的质量时，反应在低温下有利地进行，由此可有效地阻止食物腐败。另外，因为提供了按照本发明的嗜冷蛋白酶，预期可促进嗜冷细菌的生理机制和它们应用于低温机制的阐明。
在N末端具有氨基酸序列的蛋白
按照本发明的另一方面，我们提供由部分或全部SEQ ID NO:1中描述的氨基酸序列组成的肽、包含部分或全部SEQ ID NO:1中描述的氨基酸序列的蛋白以及在其N末端包含部分或全部SEQ ID NO:1中描述的氨基酸序列的蛋白。该蛋白可以具有蛋白酶活性。
这种肽或蛋白由部分或全部存在于按照本发明的酶N末端的氨基酸序列组成、或包含部分或全部的氨基酸序列(最好在N末端)。因此，在形成抗按照本发明的酶的抗体中，上述肽或蛋白作为抗原是有用的。
参考实施例，将以更详细地描述本发明，但本发明的范围不应限于这些实施例。
测试方法
用Bio-rad蛋白分析(Bio-Rad Co.，Ltd)，通过蛋白染色方法进行蛋白的定量分析。
而且，通过测定蛋白在280nm的紫外吸收进行通过色谱分离蛋白的检测。
通过以下方法(a)或(b)测定蛋白酶的活性。
(a)对偶氮酪蛋白的蛋白分解活性
将0.05ml样品酶溶液加入0.3ml的含1％(W/V)偶氮酪蛋白的67mM磷酸缓冲液(pH7)中，然后将该混合物在30℃保持30分钟。此后，用1ml 6％三氯醋酸溶液终止反应。在室温静置大约15分钟后，将该反应溶液离心(15,000rpm，室温，10分钟)。利用分光光度计在340nm测定得到的上清液的吸收。一个AU定义为在所述条件下，吸光度每30分钟增加1.0。
(b)苯酚试剂方法
将20μl样品酶溶液加入130μl含1％(W/V)底物溶液的100mM甘氨酸-氯化钠缓冲液(pH10)，并且将混合物在30℃保持1小时。此后，通过加入150μl三氯醋酸溶液(0.11M三氯醋酸、0.22M醋酸钠和0.33M醋酸)终止反应。在室温静置30分钟后，将反应液离心(10,000rpm，室温，10分钟)，并且将500μl 0.5M碳酸钠溶液和100μl用蒸馏水稀释两倍的苯酚溶液加入100μl得到的上清液中。将溶液在室温静置1小时后，测定在660nm的溶液的吸光度。
实施例1(得自大比目鱼黄杆菌P104株的蛋白酶的纯化)
(1)细菌菌株的培养
为了使细菌的生长活性稳定，将细菌菌株接种在150ml下述培养基中(分别倒入6个100ml三角锥瓶中)，并且利用三层摇床(triple shaker)NR-80(Tietec Co.,Ltd.)以140rpm在10℃进行旋转震荡培养48小时。作为主培养，将150ml预培养基接种到3升下述培养基中，并且利用实验室发酵器LS-5(Oriental Yeast Co.,Ltd.)以140rpm在10℃旋转培养75小时。
培养基
多种蛋白胨        3g/l
酵母提取物       2.5g/l
酪蛋白钠         2.5g/l
Na2HPO4_12H2O  3g/l
MgSO4_7H2O     0.2g/l
(pH 7.0)
将所述培养基等用高压灭菌器在1.2 kgf/cm2(表压)(121℃)，用高压蒸汽灭菌15分钟。
(2)通过本发明纯化酶
每种蛋白酶在4℃纯化。
(a)离子交换层析
通过离心(7,200×g,4℃,30分钟)澄清在上述(1)获得的培养基。得到的上清液作为粗品酶溶液经过离子交换层析。用填满2升DEAE琼脂糖(Sephalose)快速流动阴离子交换剂的INdEX 100柱(ParmaciaBiotec Co.,Ltd.)作为柱子。将20 mM tris缓冲液(pH7.0)以150cm/小时的线性速率导入上述柱子，以凝胶体积的5倍或更多(10升)平衡柱子。
以100cm/小时的线性速率将粗品酶溶液导入柱子。通过用分别含0.2M、0.4M和0.6MNaCl的tris缓冲液(pH7.0)以100cm/小时的线性速率进行洗脱，并且只将用UV计检测到蛋白的部分分段分离。
(b)超滤
用设置一个Diaflo膜PM30(可分级分离分子量不低于30,000的物质)的新型搅拌型细胞8400(Amicon Co.,Ltd.)，处理以上获得的分离部分，由此将分子量不低于30,000的蛋白浓缩。
(c)用硫酸胺盐析
将硫酸胺加入在冰上冷却的浓缩溶液，使得用硫酸胺可将该溶液饱和至50％。在0℃缓慢搅拌4小时后，通过离心(27,000×g,4℃,20分钟)将该溶液沉淀，以获得0至50％的饱和的部分。硫酸胺的加入量是在25℃得到饱和浓度需要的量。
(d)凝胶过滤
接着，通过HiLoad 16/60 Superdex 200 prep grade柱(ParmaciaBiotec Co.,Ltd.)进行凝胶过滤。用HiLoad系统50(Parmacia Biotec Co.,Ltd.)作为仪器。
将Bis-tris缓冲液(pH 7)以大约60 cm/小时的线性速率流过HiLoad16/60 Superdex 200制备级(prep grade)柱以平衡柱子，Bis-tris缓冲液的量是凝胶体积的3倍或更多(400ml)。此后，将已经过硫酸胺盐析的5ml样品酶溶液通过用Superloop导入柱子。然后，以60cm/小时的线性速率，用Bi-tris缓冲液(pH7)进行洗脱，以每5ml分部收集分离部分。
(e)接着，用HiLoad 16/10 Q琼脂糖HP柱进行离子交换层析。将20 mM Bis-tris缓冲液(pH 7)以大约150cm/小时的线性速率导入柱子，以凝胶体积的5倍或更多(100ml)平衡柱子。
将通过凝胶过滤洗脱的蛋白酶活性部分的样品酶溶液以90cm/小时的线性速率，用Superloop导入柱子。接着，以90cm/小时的线性速率用含1 MNaCl的150ml Bis-tris缓冲液(pH7)，按照线性离子强度增加梯度(0至1M)进行洗脱，以每5ml收集分离部分。
上述纯化的结果显示在表1。
                                     表1
                              (蛋白酶纯化的结果)
总量(ml) 蛋白(mg) 酶活性(AU)
    培养基DEAE琼脂糖超滤用硫酸胺盐析凝胶过滤(Superdex 200pg)Q琼脂糖     1930185025741610     67.843.04.984 930.3740.299     53025759.017.19.536.55
                                  表1(续)
    比活(×103AU mg-1) 回收率(％) 纯化程度(倍)
培养基DEAE琼脂糖超滤用硫酸胺盐析凝胶过滤Q琼脂糖     4.063.2246.18705932192     10048.511.1321     10.79411.4215393540
实施例3(按照本发明的纯化酶的纯度和分子量测定)
利用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)测定按照本发明的纯化酶的纯度和分子量。
用厚度为1mm的10％聚丙烯酰胺凝胶作为支持物。通过对凝胶施加20mA的电流进行电泳，直至溴酚蓝(BPB)到达下端。将凝胶板用含0.02％考马斯亮蓝R250的30％甲醇-10％乙酸水溶液染色1小时，并且然后用脱色剂(30％甲醇和10％乙酸溶液)脱色过夜。
SDS-PAGE的结果和标准曲线分别显示在图1和图2。
实施例4(pH对酶促反应的影向)
用本发明的酶在各种pH值下分解偶氮酪蛋白。反应溶液的缓冲液的浓度为100mM浓度，它们是乙酸钠-乙酸缓冲液(pH4.0-5.5)、MES(2-吗啉代乙磺酸一水化物)缓冲液(pH5.5-6.5)、MOPS(3-吗啉代丙磺酸)缓冲液(pH6.5-8.0)、TAPS(N-三(羟甲基)甲基-3-氨基丙磺酸)缓冲液(pH8.0-9.0)、CHES(N-环己基-2-氨基乙磺酸)缓冲液(pH9.0-10.0)、CAPS(N-环己基-3-氨基丙磺酸)缓冲液(pH10.0-11.0)和甘氨酸-氯化钠-氢氧化钠缓冲液(pH11.0-13.0)。
结果显示在图3。
在pH6.5至pH9.5范围内，在最适pH的pH8.0下该酶的相应活性保持大约90％或更多。因此，显然本发明的酶在以中性pH为中心的相当宽的范围内作用。然而，在不高于pH5.0的酸性pH范围内和不低于pH11.0的碱性pH范围内该酶不充分作用，并且在pH13.0该蛋白酶失活。
实施例5(按照本发明的酶的pH稳定性)
将按照本发明的酶在30℃在每个上述缓冲液中维持1小时，并且然后检查剩余的蛋白酶活性。结果显示在图4。
发现按照本发明的酶在30℃在pH6.5至pH10.0的范围内稳定1小时，但在同样条件下，在pH4.0和pH11.0失活。
实施例6(温度对酶促反应的影响)
用按照本发明的酶在不同的温度下，在67mM磷酸缓中液(pH7)和100mM甘氨酸-氯化钠(pH10)中分解偶氮酪蛋白。反应温度从5℃至70℃变化。此外，对于一种市售酶Savinase(Novonordisc Co.,Ltd.)，测定在pH7下温度的影响。结果显示在图5。
按照本发明的酶的最适温度在pH10和pH7下为40℃。在30℃的温度，本发明的酶在pH10可保持大约80％的活性，在pH7可保持大约90％的活性。在50℃的温度，本发明的酶在pH10可保持大约10％的活性，在pH7可保持大约80％的活性。市售Savinase的最适温度是60℃，该温度大大高于按照本发明的酶的最适温度。
实施例7(按照本发明的酶的温度稳定性)
将按照本发明的酶在10℃至60℃维持1小时。其活性随时间的变化显示在图6。
在10℃、20℃和30℃1小时，按照本发明的酶几乎不失活。然而，在40℃它失活至大约60％的蛋白酶活性，并且以后，它逐渐失活。在50℃和60℃，该酶快速失活，并且在10分钟内完全失活。
实施例8(抑制剂对按照本发明的酶的影响)
用作用于天冬氨酸蛋白酶的胃蛋白酶抑制剂、作用于半胱氨酸蛋白酶的L-反式-环氧琥珀酰亮氨酸酰氨基-4-胍基丁烷(E-64)和碘乙酰氨、作用于丝氨酸蛋白酶的苯甲磺酰氯(PMSF)、作用于金属蛋白酶和金属依赖的蛋白酶的1,10-菲咯啉和乙二胺四乙酸(EDTA)作为抑制剂。将这些抑制剂加入酶促反应系统以便形成各种终浓度，然后将该反应系统维持在30℃0.5至1小时以检查剩余的蛋白酶活性。结果显示在表2。
胃蛋白酶抑制剂、L-反式-环氧琥珀酰亮氨酸酰氨基-4-胍基丁烷(E-64)、碘乙酰氨和1,10-菲咯啉不能抑制按照本发明的酶的蛋白酶活性，但苯甲磺酰氯(PMSF)和乙二胺四乙酸(EDTA)明显抑制按照本发明的酶的蛋白酶活性。从这些结果，暗示按照本发明的酶是活性中心为丝氨酸的丝氨酸蛋白酶。
实施例9(蛋白酶的底物专一性)
用苯酚试剂法测定该蛋白酶对作为底物蛋白的酪蛋白、血红蛋白、白蛋白和明胶的蛋白酶解活性。结果显示在表3。
                               表3
                           (底物专一性)
    底物     特殊的酶活性
    酪蛋白明胶血红蛋白白蛋白     100513013
按照本发明的酶在低温下特异性地作用于酪蛋白，并且该酶的底物专一性以明胶、血红蛋白和白蛋白的次序减低。
实施例10(N末端氨基酸序列的测定)
在按照本发明的酶中，测定了其N末端氨基酸序列的30个残基。结果显示在SEQ ID NO:1.
测定了在按照本发明的酶的N末端氨基酸序列，并且利用数据库“Entrez”检查了其与已知氨基酸序列的同源性。结果，显然没有同源性。因此，由于按照本发明的酶与已知蛋白的任何氨基酸序列没有同源性，已证实按照本发明的酶在N末端具有新的氨基酸序列。序列表序列号：1序列长度：30序列类型：氨基酸链型：单链拓扑学：线性分子类型：肽片段类型：N末端来源：
有机体：大比目鱼黄杆菌
菌株：P104株序列描述：Asp Thr Arg Gln Leu Leu Asn Ala Asn Ser Asp Leu Leu Asn Thr Thr1                5                   10                  15Gly Asn Val Thr Gly Leu Thr Gly Ala Phe Asn Gly Glu Asn
         20                 25                   30

Claims (13)

1．在20℃具有其最大活性的大约50％活性或更多的蛋白酶。
2．具有以下物理化学性质的蛋白酶：
(a)比活和底物专一性：所述蛋白酶作用于酪蛋白、明胶、血红蛋白和白蛋白以特异地分解它们，并且所述底物专一性以酪蛋白、明胶、血红蛋白和白蛋白的次序降低；
(b)最适pH:8.0；以及
(c)pH稳定性：所述蛋白酶在pH6.5至pH10.0的范围内在30℃稳定1小时。
3．按照权利要求2的蛋白酶，它还具有以下物理化学性质：
(d)最适温度：大约40℃；
(e)温度稳定性：在pH7为1小时，在低于30℃的温度，该酶几乎不失活，但在40℃它失活大约40％，并且在50℃在大约10分钟内完全失活；以及
(f)酶活性：在20℃所述蛋白酶具有其最大活性的大约50％或更多。
4．按照权利要求2或3的蛋白酶，其中所述酶的活性中心是丝氨酸。
5．按照权利要求2或3的蛋白酶，以SDS-PAGE测定，其分子量大约为70kDa。
6．按照权利要求1至5的任一项的蛋白酶，它由含部分或全部SEQ ID NO:1中描述的氨基酸序列的蛋白组成。
7．按照权利要求1至5的任一项的蛋白酶，它由在N末端含部分或全部SEQ ID NO:1中描述的氨基酸序列的蛋白组成。
8．由含部分或全部SEQ ID NO:1中描述的氨基酸序列的蛋白组成的蛋白酶。
9．由在N末端含部分或全部SEQ ID NO:1中描述的氨基酸序列的蛋白组成的蛋白酶。
10．制备在权利要求1至9的任一项中描述的蛋白酶的方法，包括培养大比目鱼黄杆菌P104(FERM BP 5006)以产生在权利要求1至9的任一项中描述的蛋白酶、然后从其培养基中收集权利要求1至9的任一项中描述的蛋白酶的步骤。
11．由部分或全部SEQ ID NO:1中描述的氨基酸序列组成的肽。
12．由部分或全部SEQ ID NO:1中描述的氨基酸序列组成的蛋白。
13．在其N末端包含部分或全部SEQ ID NO:1中描述的氨基酸序列的蛋白。
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