JP3592795B2 - 低温至適アルカリプロテアーゼ、これを生産する微生物及び当該アルカリプロテアーゼの製造法 - Google Patents
低温至適アルカリプロテアーゼ、これを生産する微生物及び当該アルカリプロテアーゼの製造法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP3592795B2 JP3592795B2 JP13505895A JP13505895A JP3592795B2 JP 3592795 B2 JP3592795 B2 JP 3592795B2 JP 13505895 A JP13505895 A JP 13505895A JP 13505895 A JP13505895 A JP 13505895A JP 3592795 B2 JP3592795 B2 JP 3592795B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- temperature
- medium
- protease
- low
- optimum
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
Images
Landscapes
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Detergent Compositions (AREA)
Description
【産業上の利用分野】
本発明は、新規な低温至適アルカリプロテアーゼ、これを生産する微生物及び当該低温至適アルカリプロテアーゼの製造法に関する。
【0002】
【従来の技術】
プロテアーゼは、ペプチド結合の加水分解を触媒する酵素群の総称で、微生物、動物及び植物中に広く分布している。その応用範囲としては、衣料用洗剤、自動食器洗浄機用洗剤、コンタクトレンズ洗浄剤、浴用剤、角質除去用化粧料、食品の改質剤(製パン、肉の軟化、水産加工)、ビールの清澄剤、皮革なめし剤、写真フィルムのゼラチン除去剤、消化助剤あるいは消炎剤があり、多分野で盛んに利用されてきた。
【0003】
その中で最も大量に工業生産され、市場規模が大きいのは洗剤用プロテアーゼであり、例えばアルカラーゼ、サビナーゼ(ノボ・ノルディスク社製)、マクサカル(ギスト・ブロケイデス社製)、API−21(昭和電工社製)、ブラップ(ヘンケル社製)及びプロテアーゼK(KAP;花王社製)などが知られている。
【0004】
しかしながら、これらの大半は最適温度が高温側にあるため、水道水をそのまま用いて低温領域で衣料等の洗浄を行う場合には、その酵素特性が充分に発揮されているとは言いがたい。また、前述のプロテアーゼは、その応用分野のほとんどにおいて、体温、室温又は低温条件下で使用されるため、高温至適酵素の使用はなじまない。加えて、高温至適酵素を用いて高温処理工程を行うことは、省エネルギーの観点からも好ましいとは言えない。一方、低温至適プロテアーゼは、反応系に熱を加えられないようなケース、すなわちチーズの熟成や肉の軟化等の食品の改質に有効であると思われる。
【0005】
近年、洗剤をはじめとしてプロテアーゼの商品への配合や工業的プロセスなどにおける利用が考えられているが、この場合、室温から低温領域で有効に作用する酵素を見出すことは、省エネルギー化に加えて酵素の機能を十分発揮させるうえで、必須の条件である。これまでに、寒冷地土壌等の寒冷環境に棲息する生物、海水あるいは冷蔵中のミルク等から分離されたプロテアーゼ生産菌及び生産されるプロテアーゼに関しては数多くの報告例がある。すなわち、シュードモナスエスピー(Pseudomonas sp.)No.548株(Agric. Biol. Chem.,36巻,1185頁、1970年)、エシェリヒア フロインディ(Eschreichia freundii)(Eur. J. Biochem., 44巻,87頁,1974年)、キサントモナスマルトフィラ(Xanthomonas maltophila)047/08株(FEMS Microbiol. Lett., 79巻,257頁,1991年)、シュードモナス フルオレセンス(Pseudomonas fluorescens)T16が(Appl. Environ. Microbiol.,46巻,333頁,1983年)、シュードモナス フルオレセンス(Pseudomonas fluorescens)AFT36株(Biochim. Biophys. Acta, 717巻,376頁,1982年)、シュードモナス エスピー(Pseudomonas sp.)145−2株(Microbios.,36巻,7頁,1982年)、アエロモナス サルモニシダ(Aeromonas salmonicida)(J. Appl. Bacteriol., 53巻,289頁,1983年)、シュードモナス パウシモビリス(Pseudomonas paucinomobilis)、バチルス エスピー(Bacillus sp.)(J. Basic Microbiol., 31巻,377頁,1991年)、ビブリオ エスピー(Vibrio sp.)SA 1株(Antonie van Leeuwenhoek,44巻,157頁,1978年)、シュードモナス フルオレセンス(Pseudomonas fluorescens)NCDO 2085株(J. Dairy Res., 53巻,457頁,1986年)、シュードモナス フルオレセンス(Pseudomonas fluorescens)(J. Dairy Res.,53巻,97頁,1986年)、シュードモナス フルオレセンス(Pseudomonas fluorescens)GR83株(Lebensm.−Wiss. u.−Technol., 23巻,106頁,1990年)、ペシロミセス マルクアンディ(Paecilomyces mairuandii)(WO 88/03948)及びキサントモナス エスピー(Xanthomonas sp.)S−1(特開平5−211868号)等などの低温で生育できる微生物が種々のプロテアーゼを生産する。また、好冷細菌(psychrotroph)が生産するプロテアーゼに関しては、Fairbainらが要領よく総説にまとめている(J. Dairy Res., 53巻,139頁,1986年)。しかしこれらのプロテアーゼについても、低温域における作用は、必ずしも満足できるものではない。
【0006】
【発明が解決しようとする課題】
従って、本発明の目的は、低温条件下においても高い活性を保持するプロテアーゼ及びこれを生産する微生物を提供するものである。
【0007】
【課題を解決するための手段】
そこで本発明者らは、斯かる問題点を解決するため、低温領域において充分作用するプロテアーゼを自然界に求め、探索してきた。その結果、北洋に生息するタラの腸から、10℃という低温条件下においても良好な生育を示す細菌を分離し、これらの中で菌体外に、低温領域においても活性を有するプロテアーゼを分泌する微生物を見出し、更に得られたプロテアーゼは低温領域で優れた活性を有するだけでなく、アルカリ側に至適pHを有するものであることを見出し、本発明を完成した。
【0008】
すなわち、本発明は、次の酵素学的性質を有する低温至適アルカリプロテアーゼ、これを生産する微生物及び当該アルカリプロテアーゼの製造法を提供するものである。
【0009】
1)作用温度及び最適温度
0〜50℃で作用し、最適温度は約20℃にある。Ca2+イオンが存在すると作用最適温度は40℃に移行する。0℃(氷水中)でも最適温度活性値の約35%の活性を保持する。
2)温度安定性
pH9.0、15分間の処理条件で20℃まで安定であり、Ca2+イオンが存在すると40℃まで安定である。
3)作用pH及び最適pH
作用pH範囲は5〜11であり、最適pHは10近傍にある。
4)pH安定性
20℃、15分間の処理条件でpH6.3〜9.5までの各pHで安定である。
5)分子量
ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法による推定分子量は、31,000±1,000である。
6)基質特異性
天然基質であるカゼイン、ジメチルカゼイン、アゾカゼイン、ヘモグロビン、尿素変性ヘモグロビン、ケラチン、コラーゲン及びアゾアルブミンに対して作用する。
7)金属イオンの影響
CO2+、Cu2+、Zn2+及びHg2+イオンによって若干阻害される。
8)阻害剤
EDTA、o−フェナントロリンによって強く阻害を受け、ジチオスレイトール(DTT)によって阻害を受ける。フェニルメタンスルフォニルフルオライド(PMSF)、キモスタチン、p−クロロマーキュリー安息香酸(PCMB)、N−エチルマレイミド(NEM)及び5,5′−ジチオ−ビス(2−ニトロ安息香酸)(DTNB)によって阻害を受けない。
9)界面活性剤の影響
アルカン硫酸ナトリウム(SAS)、α−オレフィン硫酸ナトリウム(AOS)、ポリオキシエチレンアルキル硫酸ナトリウム(ES)、ソフタノール70H、α−スルホ脂肪酸エステル(α−SFE)及びドデシル硫酸ナトリウム(SDS)に対して極めて安定である。
【0010】
本発明の低温至適アルカリプロテアーゼは、例えばフラボバクテリウム(Flavobacterium)属に属するプロテアーゼ生産菌を培養し、その培養物から採取することにより製造することができる。
【0011】
かかるフラボバクテリウム属に属する本発明プロテアーゼ生産菌としては、フラボバクテリウム属に属し、上記の本発明プロテアーゼを生産する限り特に制限されないが、例えば次の分類学的性質を示すKSM−N43株が挙げられる。
本発明のプロテアーゼ生産菌の分類に用いられる培地を以下に示す。
【0012】
使用培地の組成(重量%で表示)
培地1. ニュートリエントブロス,0.8;寒天末(和光純薬社製),1.5
培地2. ニュートリエントブロス,0.8
培地3. ニュートリエントブロス,0.8;ゼラチン,2.0;寒天末(和光純薬社製),1.5
培地4. バクトリトマスミルク,10.5
培地5. ニュートリエントブロス,0.8;KNO3,0.1
培地6. バクトペプトン,0.7;NaCl,0.5;ブドウ糖,0.5
培地7. SIM寒天培地(栄研化学社製),指示量
培地8. TSI寒天培地(栄研化学社製),指示量
培地9. バクトペプトン,1.5;酵母エキス,0.5;可溶性澱粉,2.0;K2HPO4,0.1;MgSO4・7H2O,0.02;寒天末(和光純薬社製),1.5
培地10.Koserの培地(栄研化学社製)、指示量
培地11.Christensenの培地(栄研化学社製)、指示量
培地12.
(1)酵母エキス,0.05;ブドウ糖,1.0;KH2PO4,0.1;Na2SO4,0.1
(2)酵母エキス,0.05;ブドウ糖,1.0;KH2PO4,0.1;MgSO4・7H2O,0.02;CaCl2・2H2O,0.05;FeSO4・7H2O,0.001;MnSO4・4−6H2O,0.001;窒素源としては、硝酸ナトリウム、亜硝酸ナトリウム、塩化アンモニウム及びリン酸アンモニウムを各々0.25,0.2,0.16,0.2%となるように、上記(1)及び(2)の培地に加えて用いた。
培地13.キングA培地“栄研”(栄研化学社製),指示量
培地14.キングB培地“栄研”(栄研化学社製),指示量
培地15.尿素培地“栄研”(栄研化学社製),指示量
培地16.チトクロム・オキシダーゼ試験紙濾紙(日水製薬社製)
培地17.3%過酸化水素水
培地18.バクトペプトン,1.5;酵母エキス,0.5;KH2PO4,0.1;ブドウ糖,1.0;MgSO4・7H2O,0.02
培地19.バクトペプトン,2.7;NaCl,5.5;ブドウ糖,0.5;K2HPO4,0.1;ブロムチモールブルー,0.06;寒天末,(和光純薬社製),1.5
培地20.(NH4)2HPO4,0.1;KCl,0.02;MgSO4・7H 2O,0.02;酵母エキス,0.05;糖1.0
培地21.カゼイン,0.5;酵母エキス,0.05;ブドウ糖,1.0;KH2PO4,0.1;MgSO4・7H2O,0.02;寒天末,(和光純薬社製),1.5
【0013】
KSM−N43株の分類学的性質を以下に示す。
【0014】
〔分類学的性質〕
(a)顕微鏡的観察結果:
菌体の大きさは、0.5〜0.6μm×1.0×3.0μmの桿菌であり、運動性はない。
(b)グラム染色性:
陰性。
(c)各種培地における生育状態:
(1)肉汁寒天平板培養(培地1);
生育状態は良い。集落の周縁は葉状あるいは樹根状である。また、集落の色調は、黄色である。
(2)肉汁寒天斜面培養(培地1);
生育する。
(3)肉汁液体培養(培地2);
生育は良好。
(4)肉汁ゼラチン穿刺培養(培地3);
生育状態は良い。ゼラチンの液化が認められる。
(5)リトマスミルク培地(培地4);
液化が認められる。
(d)生理学的性質
(1)硝酸塩の還元及び脱窒反応(培地5);
硝酸塩の還元及び脱窒反応は陰性。
(2)MRテスト(培地6);
陰性。
(3)VPテスト(培地6);
陰性。
(4)インドールの生成(培地7);
陽性。
(5)硫化水素の生成(培地8);
陰性。
(6)澱粉の加水分解(培地9);
陰性。
(7)クエン酸の利用(培地10、11);
陰性。
(8)無機窒素源の利用(培地12);
硝酸塩及びアンモニウム塩の利用は認められない。
(9)色素の生成(培地13、14);
淡黄色あるいは淡茶色の色素を産生する。
(10)ウレアーゼ(培地15);
陰性。
(11)オキシダーゼ(培地16);
陽性。
(12)カタラーゼ(培地17);
陽性。
(13)生育の範囲(培地18);
生育の温度範囲は2〜35℃である。
生育のpH範囲は6〜12である。
(14)酸素に対する態度(培地19);
好気的。
(15)O−Fテスト(培地20);
酸化型。
(16)糖の利用性;
D−ガラクトース、シュクロース、D−グルコース、D−フラクトース、マルトース、D−マンノース、ラフィノース、トレハロース、グリセリン、メリビオース及び可溶性澱粉を利用することができる。
(17)食塩含有培地における生育(培地1中);
食塩濃度5%では生育できない。
(18)カゼインの分解(培地21);
陽性。
【0015】
以上の分類学的性質に関する検討に基づき、バージーズ・マニュアル・オブ・システマティク・バクテリオロジー(Bergey’s Mannual of Systematic Bacteriology)第8版を参照し、比較検討した結果、本菌株は、低温で生育可能なフラボバクテリウム属に近縁な新種と判断された。
【0016】
従って、本菌株をフラボバクテリウム エスピー(Flavobacterium sp.)KSM−N43と命名し、生命工学FERM P−14862号として工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託した。
【0017】
上記の菌株を用いて、本発明のプロテアーゼを得るには、培地に菌株を接種し、常法に従って培養すればよい。
【0018】
培養に用いる培地中には、資化しうる炭素源及び窒素源を適当量含有せしめておくことが望ましい。この炭素源及び窒素源は特に制限されないが、例えば炭素源として可溶性澱粉、ブルコース、マンノース、ガラクトース、フラクトース、シュクロース、マルトース、ラフィノース、トレハロース、グリセリン、メリビオース及び可溶性澱粉を利用や資化しうる有機酸、例えばクエン酸などが挙げられる。また、窒素源としては、コーングルテンミール、大豆粉、コーンスティプリカー、カザミノ酸、酵母エキス、フーマメディア、肉エキス、トリプトン、ソイトン、ポリペプトン、ソイビーンミール、綿実油粕やカルチベータなどの有機窒素源が有効である。更に、燐酸塩、マグネシウム塩、カルシウム塩、マンガン塩、亜鉛塩、コバルト塩、ナトリウム塩及びカリウム塩等の無機塩や、必要に応じて、無機又は有機微量栄養素やビタミン類を培地中に適宜添加することができる。
【0019】
培養温度は2〜35℃、特に25〜30℃が好ましく、pHは6〜12特に8〜10が好ましく、この条件下において通常3〜5日間で培養が完了する。
【0020】
斯くして得られた培養液の中から目的の酵素であるアルカリプロテアーゼの採取は、一般の酵素採取の手段に準じて行うことができる。すなわち、培養後遠心分離又は濾過等の通常の分離手段により菌体を培養液から除去して粗酵素液を得る。この粗酵素液はそのまま使用することもできるが、必要に応じて、限外濾過あるいは沈澱法等の手段により回収し、適当な方法を用いて粉末化して用いることもできる。また、酵素精製の一般的な手段、例えば、適当な陽イオン交換樹脂、陰イオン交換樹脂、ヒドロキシアパタイトによるクロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー及びゲル濾過などを適宜組み合せることによって精製することもできる。
【0021】
斯くして得られる本発明低温アルカリプロテアーゼの酵素化学的性質について以下に説明する。
【0022】
〔酵素活性測定法〕
カゼイン1%を含む50mMの各種緩衝液1mlを0.1mlの酵素溶液と混合し、20℃、15分間反応させた後、反応停止液(0.11M トリクロロ酢酸−0.22M 酢酸ナトリウム−0.33M 酢酸)2mlを加え、30℃、20分間放置した。次に濾紙(ワットマン社製、No.2)で濾過し、濾液中の蛋白分解物をフォーリン・ローリー法(Lowry, O. H. et al., J. Biol. Chem., 193巻,265頁,1951年)によって測定した。
また、上記反応条件下において、1分間に1μmolのチロシンに相当する酸可溶性蛋白分解物を生成する酵素量を1単位(1U)とした。
【0023】
〔酵素学的性質〕
(1)基質特異性:
50mM ホウ酸緩衝液(pH9.0)に各種蛋白質を0.1%又は1%になるように加えた後、精製酵素を適当量添加して20℃で15分間反応を行った。カゼインを基質とした場合の分解活性を100として、それぞれの基質に対する分解活性を表1に示す。
【0024】
【表1】
【0025】
表1から、本酵素は、天然基質であるカゼインに加え、ジメチルカゼイン、アゾカゼイン、ヘモグロビン、尿素変性ヘモグロビン、ケラチン、コラーゲン及びアゾアルブミン、ゼラチンに対して作用するが、リボヌクレアーゼ及びアルブミンには作用しなかった。
【0026】
また、p−ニトロアニリン(pNA)が結合した合成オリゴペプチド基質を用いて、これらの分解活性を調べた。しかし、N−スクシニル化したAla−Ala−Pro−Phe−pNA、Ala−Ala−Pro−Met−pNA、Ala−Ala−Ala−pNA、Phe−Pro−Phe−pNA、Ala−Ala−pNA、Ala−pNAやN−カルボベンゾイル化したAla−Ala−Leu−pNAやGly−Gly−Leu−pNA等の合成基質からのp−ニトロアニリンの遊離は認められなかった。
【0027】
(2)作用pH及び最適pH:
ブリットン・ロビンソン広域緩衝液(50mM)中に最終濃度0.91%となるようにカゼインを加え、20℃で15分間反応を行い、各pHでの活性を測定した。図1から明らかなように、本プロテアーゼの最適pHは10付近に認められる。また、その作用pHは、pH5〜11と幅広いことがわかる。
【0028】
(3)pH安定性:
(1)で用いたと同じ緩衝液(5mM,各pH)中に本酵素を加え、20℃で15分間放置し、カゼインを基質とし、残存活性をpH9,20℃で測定した。その結果、図2に示すとおり、本酵素はpH6.3〜9.5の広い範囲で安定であった。
【0029】
(4)作用温度及び最適温度:
基質として0.91%のカゼインを含む50mMホウ酸緩衝液(pH9.0)に本酵素を加え、15分間各温度で反応を行った。図3から明らかなように、本酵素の最適温度は20℃であった。また、Ca2+イオンが存在すると、至適温度は約40℃に移行し、Ca2+イオン非存在下の最適温度に比べ、約2倍の活性促進が認められた。特徴的なことに本酵素は0℃(氷水中)でも最適温度の活性の約35%の活性を示し、低温条件下でも充分作用することがわかる。
【0030】
(5)温度安定性:
50mM ホウ酸緩衝液(pH9.0)に本酵素を加え、各温度で15分間熱処理した後氷冷した。カゼインを基質として、20℃で残存活性を求め、その結果を図4に示した。本酵素はCa2+イオン非存在下で20℃、Ca2+イオンの存在下で40℃まで安定であることがわかる。
【0031】
(6)分子量:
本酵素の分子量をSDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法により測定した。分子量マーカーには、低分子用マーカーキット(ファルマシア社製)のホスホリラーゼb(分子量:94,000)、牛血清アルブミン(分子量:67,000)、卵白オブアルブミン(分子量:43,000)、カルボニックアンヒドラーゼ(分子量:30,000)、大豆トリプシンインヒビター(分子量:20,100)、γ−ラクトアルブミン(分子量:14,400)を用いた。図5から明らかなように、本精製プロテアーゼ標品は電気泳動的に均一であり、その分子量は31,000±1,000と推定される。
【0032】
(7)等電点:
等電点電気泳動法により、本プロテアーゼの等電点を求めた。アクリルアミドゲル(6.0%)のpH勾配は、両性電界質であるファーマライト(Pharmalyte, pH3〜10;ファルマシア社製)を使用した。その結果、本プロテアーゼの等電点はpH9.7近傍にあることが判明した。
【0033】
(8)金属イオンの影響:
各種金属塩を1mMになるように添加した20mM ホウ酸緩衝液(pH9.0)に本酵素溶液を添加し、20℃で20分間放置した。その後、50mM ホウ酸緩衝液(pH9.0)で適当希釈を行い、残存活性を測定した。金属塩無添加系で同様に処理した酵素活性を100%として処理群の残存活性を求めた。結果を表2に示す。
【0034】
【表2】
【0035】
表2から、本酵素活性は、CO2+、Cu2+、Zn2+やHg2+イオンに若干の阻害作用が認められる。
【0036】
(9)阻害剤の影響:
20mM リン酸緩衝液(pH7.0に各種阻害剤を所定濃度になるように加え、本酵素を添加し、20℃で20分間放置した後、残存活性を測定した。結果を表3に示す。
【0037】
【表3】
【0038】
表3から、キレート剤であるEDTAとEGTAによって強く阻害され、PMSFなどのセリン酵素阻害剤で全く影響を受けないので金属プロテアーゼ(metalloprotease)であると考えられる。
【0039】
(10)界面活性剤の影響:
本酵素を、0.2%の界面活性剤を含有する50mM ホウ酸緩衝液(pH9.0)に加えて、20℃で20分間放置した後、残存活性を測定した。結果を表4に示す。
【0040】
【表4】
【0041】
表4から、本酵素はSDS、AOS、SAS、α−SFE、ソフタノール70HやLAS(それぞれ0.2%濃度)などの界面活性剤と長時間接触させてもほとんど失活せず、強力な界面活性剤耐性を有していることがわかる。
【0042】
前述したように、低温至適を有するプロテアーゼに関しては数多くの報告があり、その中には金属プロテアーゼに関する報告もある。しかし、低温至適、高アルカリ至適を示し、界面活性剤に対して安定なプロテアーゼについての報告はないことから、本酵素は新規な酵素であると考えられる。
【0043】
【発明の効果】
本発明のアルカリプロテアーゼは、作用最適温度を低温領域に有し、前述の界面活性剤によってもほとんど阻害を受けず、また、酸性から高アルカリ溶液中に幅広く安定である。従って、本酵素は洗浄剤組成物の配合成分として、低温下で有利に使用できるものである。また、低温条件下における、食肉の軟化あるいはチーズの熟成といった食品の改質にも有効である。
【0044】
【実施例】
以下に実施例を挙げて本発明を更に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【0045】
実施例1
北洋に生息するタラの腸を滅菌人工海水(ジャマリン・ラボラトリー社製)20mlに入れ、ホモゲナイザーで粉砕した。得られた懸濁液を、以下に示した組成を有する人工海水平板培地に塗抹し、20℃で5〜7日間培養した。
【0046】
【表5】
人工海水平板培地(pH7.6)
バクトペプトン(ディフコ社製) 2.5g
酵母エキス(ディフコ社製) 1.25g
肉エキス(ディフコ社製) 1.25g
スキムミルク(ディフコ社製)(別滅菌) 10g
グルコース 0.5g
寒天 20g
人工海水 1000ml
【0047】
生育した集落の周囲にスキムミルクの分解によって生じた透明帯を指標としてプロテアーゼ生産菌を分離した。得られた分離株の中から、低温至適プロテアーゼ生産性を調べ、フラボバクテリウム エスピー KSM−N43株を選抜した。
【0048】
実施例2
実施例1で得られたフラボバクテリウム エスピー KSM−N43株を以下に示した液体培地で好気的に20℃、2日間培養した。
【0049】
【表6】
液体培地(pH9.0)
ポリペプトンS 2.5g
酵母エキス 1.25g
KH2PO4 1.25g
MgSO4 0.2g
グルコース 5g
炭酸ナトリウム 2g
イオン交換水 1000ml
【0050】
培養後、遠心分離(12,000×g,20分間)して得られた上清液を10mM トリス−塩酸緩衝液(pH7.5;2mM CaCl2含有)で5℃、一昼夜透析した。透析内液のプロテアーゼ活性を、カゼインを基質として20℃で測定したところ(50mMホウ酸緩衝液中,pH9.0)、0.6〜1.1U/l培養液に相当するプロテアーゼの生産が認められた。
【0051】
実施例3
フラボバクテリウム エスピー KSM−N43株を実施例2の液体培地に接種し、20℃で40時間培養した。培養後、遠心分離して得られた上清液を限外濾過膜(分画分子量3,000;アミコン社製)で濃縮した。この濃縮液を20mM トリス−塩酸緩衝液(pH8.0;2mM CaCl2含有)に対し5℃で一昼夜透析した。この透析内液を20mM トリス−塩酸緩衝液(pH8.0;2mM CACl2含有)で平衡化したDEAE−バイオゲルA(バイオラッド社製)のカラムを通過させ、その非吸着画分をプールした。再度、DEAE−バイオゲルAのカラムを通過させて非吸着画分を限外濃縮した。この濃縮液を20mM トリス−塩酸緩衝液(pH8.0;2mM CaCl2含有)で平衡化したCM−バイオゲルA(バイオラッド社製)のカラムに添着した後、0〜0.125mM 塩化カリウム濃度勾配溶出を行った(pH8.0;2mM CaCl2含有)。本発明の低温至適プロテアーゼは非吸着画分の溶出領域から若干遅れて分画された。活性画分を限外濾過膜上で約1.0mlまで濃縮した後、平衡化したセファクリル S−200スーパーファイン(ファルマシア社製)のカラムでゲルクロマトグラフィーを行った。得られた活性画分を最終精製酵素標品として使用した。
この結果、約6.8倍まで精製され(回収率7%)、本精製標品は約54U/mg蛋白質(仔牛血清アルブミン単位)の比活性を有していた。
【図面の簡単な説明】
【図1】バチルス エスピー KSM−N43株のプロテアーゼのpH−活性曲線を示す図である。
【図2】フラボバクテリウム エスピー KSM−N43株のプロテアーゼのpH安定性を示す図である。
【図3】フラボバクテリウム エスピー KSM−N43株のプロテアーゼの温度−活性曲線を示す図である。
【図4】フラボバクテリウム エスピー KSM−N43株のプロテアーゼの温度安定性を示す図である。
【図5】フラボバクテリウム エスピー KSM−N43株のプロテアーゼの分子量測定結果を示す図であり、(a)は分子量とSDS電気泳動距離の相関を示す図、(b)は完全精製標品のSDS電気泳動写真(12%アクリルアミドゲル)を示す図である。
Claims (3)
- 次の酵素学的性質を有する低温至適アルカリプロテアーゼ。
1)作用温度及び最適温度
0〜50℃で作用し、最適温度は約20℃にある。Ca2+イオンが存在すると作用最適温度は40℃に移行する。0℃(氷水中)でも最適温度活性値の約35%の活性を保持する。
2)温度安定性
pH9.0、15分間の処理条件で20℃まで安定であり、Ca2+イオンが存在すると40℃まで安定である。
3)作用pH及び最適pH
作用pH範囲は5〜11であり、最適pHは10近傍にある。
4)pH安定性
20℃、15分間の処理条件でpH6.3〜9.5までの各pHで安定である。
5)分子量
ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法による推定分子量は、31,000±1,000である。
6)基質特異性
天然基質であるカゼイン、ジメチルカゼイン、アゾカゼイン、ヘモグロビン、尿素変性ヘモグロビン、ケラチン、コラーゲン及びアゾアルブミンに対して作用する。
7)金属イオンの影響
CO2+、Cu2+、Zn2+及びHg2+イオンによって若干阻害される。
8)阻害剤
EDTA、o−フェナントロリンによって強く阻害を受け、ジチオスレイトール(DTT)によって阻害を受ける。フェニルメタンスルホニルフルオライド(PMSF)、キモスタチン、p−クロロマーキュリー安息香酸(PCMB)、N−エチルマレイミド(NEM)及び5,5′−ジチオ−ビス(2−ニトロ安息香酸)(DTNB)によって阻害を受けない。
9)界面活性剤の影響
アルカン硫酸ナトリウム(SAS)、α−オレフィン硫酸ナトリウム(AOS)、ポリオキシエチレンアルキル硫酸ナトリウム(ES)、ソフタノール70H、α−スルホ脂肪酸エステル(α−SFE)及びドデシル硫酸ナトリウム(SDS)に対して極めて安定である。 - フラボバクテリウム エスピー(Flavobacterium sp.)KSM−N43と命名され、FERM P−14862号として寄託された請求項1記載の低温至適プロテアーゼを生産する微生物。
- 請求項2記載の微生物を培養し、その培養物から該当低温至適アルカリプロテアーゼを採取することを特徴とする請求項1記載のプロテアーゼの製造法。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP13505895A JP3592795B2 (ja) | 1995-06-01 | 1995-06-01 | 低温至適アルカリプロテアーゼ、これを生産する微生物及び当該アルカリプロテアーゼの製造法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP13505895A JP3592795B2 (ja) | 1995-06-01 | 1995-06-01 | 低温至適アルカリプロテアーゼ、これを生産する微生物及び当該アルカリプロテアーゼの製造法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPH08322563A JPH08322563A (ja) | 1996-12-10 |
JP3592795B2 true JP3592795B2 (ja) | 2004-11-24 |
Family
ID=15142918
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP13505895A Expired - Fee Related JP3592795B2 (ja) | 1995-06-01 | 1995-06-01 | 低温至適アルカリプロテアーゼ、これを生産する微生物及び当該アルカリプロテアーゼの製造法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JP3592795B2 (ja) |
Families Citing this family (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPH09201195A (ja) * | 1996-01-26 | 1997-08-05 | Procter & Gamble Co:The | 低温活性プロテアーゼcp70 |
CN1109750C (zh) * | 2000-08-15 | 2003-05-28 | 中国水产科学研究院黄海水产研究所 | 一种新型低温碱性蛋白酶、制造方法、应用和产生该蛋白酶的微生物 |
-
1995
- 1995-06-01 JP JP13505895A patent/JP3592795B2/ja not_active Expired - Fee Related
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JPH08322563A (ja) | 1996-12-10 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Kumar et al. | Microbial alkaline proteases: from a bioindustrial viewpoint | |
Ellaiah et al. | A review on microbial alkaline proteases | |
Morita et al. | Properties of a cold-active protease from psychrotrophic Flavobacterium balustinum P104 | |
Turkiewicz et al. | Biosynthesis and properties of an extracellular metalloprotease from the Antarctic marine bacterium Sphingomonas paucimobilis | |
US5192677A (en) | Alkali and heat stable protease from thermomonospora fusca | |
Fıtrıanı et al. | Isolation, screening, partial purification and characterization of protease from halophilic bacteria isolated from Indonesian fermented food | |
JP3592811B2 (ja) | 低温活性アルカリプロテアーゼ、これを生産する微生物及び当該アルカリプロテアーゼの製造法 | |
JP3592795B2 (ja) | 低温至適アルカリプロテアーゼ、これを生産する微生物及び当該アルカリプロテアーゼの製造法 | |
CN101068924B (zh) | 新型高碱性蛋白酶及其应用 | |
JP3595024B2 (ja) | 低温至適プロテアーゼ、これを生産する微生物及び当該プロテアーゼの製造法 | |
JP3592794B2 (ja) | 低温アルカリプロテアーゼ、これを生産する微生物及び当該アルカリプロテアーゼの製造法 | |
US20080220499A1 (en) | Novel protease for industrial applications | |
FUJII et al. | Purification and characterization of a prolidase from Aureobacterium esteraromaticum | |
JP3664804B2 (ja) | 低温アルカリプロテアーゼx、それを生産する微生物、その製造法、並びに当該酵素を含有する洗浄剤組成物及び食品加工用酵素製剤 | |
JP2003325186A (ja) | アルカリプロテアーゼ | |
JP3664802B2 (ja) | 低温アルカリプロテアーゼ、それを生産する微生物、その製造法、並びに当該酵素を含有する洗浄剤組成物及び食品加工用酵素製剤 | |
JP2509540B2 (ja) | 新規プロテア―ゼを産生する新規微生物 | |
JP3664801B2 (ja) | 低温アルカリプロテアーゼs、それを生産する微生物、その製造法、並びに当該酵素を含有する洗浄剤組成物及び食品加工用酵素製剤 | |
JPH0856664A (ja) | プロテアーゼ及び肉軟化剤 | |
JP2985018B2 (ja) | 新規微生物 | |
JP3664800B2 (ja) | 低温アルカリプロテアーゼt15、それを生産する微生物、その製造法、並びに当該酵素を含有する洗浄剤組成物及び食品加工用酵素製剤 | |
JP3026111B2 (ja) | 新規アルカリプロテアーゼ及びその製造方法 | |
JP3784874B2 (ja) | 低温プロテアーゼ、これを生産する微生物、これの製造法及びこれを用いる食肉軟化法 | |
JP3664803B2 (ja) | 低温アルカリプロテアーゼt16、それを生産する微生物、その製造法、並びに当該酵素を含有する洗浄剤組成物及び食品加工用酵素製剤 | |
Rostami et al. | Protease production using Bacillus licheniformis by submerged fermentation |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20040622 |
|
A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20040729 |
|
RD02 | Notification of acceptance of power of attorney |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7422 Effective date: 20040729 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20040824 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20040826 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20080903 Year of fee payment: 4 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20080903 Year of fee payment: 4 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20090903 Year of fee payment: 5 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20090903 Year of fee payment: 5 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20100903 Year of fee payment: 6 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20110903 Year of fee payment: 7 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20120903 Year of fee payment: 8 |
|
LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |