JPH09201195A - 低温活性プロテアーゼｃｐ７０ - Google Patents
低温活性プロテアーゼｃｐ７０Info
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- JPH09201195A JPH09201195A JP8012207A JP1220796A JPH09201195A JP H09201195 A JPH09201195 A JP H09201195A JP 8012207 A JP8012207 A JP 8012207A JP 1220796 A JP1220796 A JP 1220796A JP H09201195 A JPH09201195 A JP H09201195A
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- A23J—PROTEIN COMPOSITIONS FOR FOODSTUFFS; WORKING-UP PROTEINS FOR FOODSTUFFS; PHOSPHATIDE COMPOSITIONS FOR FOODSTUFFS
- A23J3/00—Working-up of proteins for foodstuffs
- A23J3/30—Working-up of proteins for foodstuffs by hydrolysis
- A23J3/32—Working-up of proteins for foodstuffs by hydrolysis using chemical agents
- A23J3/34—Working-up of proteins for foodstuffs by hydrolysis using chemical agents using enzymes
- A23J3/341—Working-up of proteins for foodstuffs by hydrolysis using chemical agents using enzymes of animal proteins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
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- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
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- C12N9/52—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from bacteria or Archaea
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 低温活性プロテアーゼの提供。
【解決手段】 次の理化学的性質を有する、プロテアー
ゼ。（ａ）作用および基質特異性：カゼイン、ゼラチ
ン、ヘモグロビン、およびアルブミンに作用して、これ
らをカゼイン、ゼラチン、ヘモグロビン、およびアルブ
ミンの順で特異的に分解する。（ｂ）至適作用ｐＨ：
８．０。（ｃ）ｐＨ安定性：３０℃、１時間保持の条件
下でｐＨ６．５〜１０．０において安定。（ｄ）至適作
用温度：約４０℃。（ｅ）温度安定性：ｐＨ７、１時間
保持の条件下で、３０℃までの温度ではほとんど失活せ
ず、４０℃で約４０％失活し、５０℃で急速に失活し約
１０分で完全に失活。（ｆ）酵素活性：２０℃におい
て、最大活性の約５０％以上の活性を有する。（ｇ）酵
素の活性中心：セリン。（ｈ）分子量：約７０ｋＤａ
（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）。
ゼ。（ａ）作用および基質特異性：カゼイン、ゼラチ
ン、ヘモグロビン、およびアルブミンに作用して、これ
らをカゼイン、ゼラチン、ヘモグロビン、およびアルブ
ミンの順で特異的に分解する。（ｂ）至適作用ｐＨ：
８．０。（ｃ）ｐＨ安定性：３０℃、１時間保持の条件
下でｐＨ６．５〜１０．０において安定。（ｄ）至適作
用温度：約４０℃。（ｅ）温度安定性：ｐＨ７、１時間
保持の条件下で、３０℃までの温度ではほとんど失活せ
ず、４０℃で約４０％失活し、５０℃で急速に失活し約
１０分で完全に失活。（ｆ）酵素活性：２０℃におい
て、最大活性の約５０％以上の活性を有する。（ｇ）酵
素の活性中心：セリン。（ｈ）分子量：約７０ｋＤａ
（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）。
Description
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の背景】発明の分野 本発明は、低温域で高い活性を有するプロテアーゼおよ
びその利用に関する。
びその利用に関する。
【０００２】背景技術 低温性細菌はかなり古くから知られており、その存在は
広く低温環境に確認できる。たとえば土壌、魚介類、乳
製品に加え、人工的に作られた低温環境などからも分離
することができるとされている。従来より食品微生物学
上の必要性から低温性細菌の研究が行われてきたが、そ
れは主として微生物の系統学的研究に関するものにとど
まっていた。
広く低温環境に確認できる。たとえば土壌、魚介類、乳
製品に加え、人工的に作られた低温環境などからも分離
することができるとされている。従来より食品微生物学
上の必要性から低温性細菌の研究が行われてきたが、そ
れは主として微生物の系統学的研究に関するものにとど
まっていた。
【０００３】低温性細菌から得られる酵素は、低温に最
適温度を持つ低温酵素であることが期待できる。低温で
効率よく作用する酵素は、例えば、衣料用洗剤に添加さ
れて、低水温でも利用可能な洗剤を実現できると思われ
る。さらに、常温で揮発性である有機溶媒の存在下での
化学反応への利用、腐敗を起こさない低温度での食品の
品質改善への利用などが考えられる。また、低温性細菌
由来の酵素を検討することで、低温性細菌の生理学的機
能および低温度への適用機構を解明する上で意義深いも
のと思われる。
適温度を持つ低温酵素であることが期待できる。低温で
効率よく作用する酵素は、例えば、衣料用洗剤に添加さ
れて、低水温でも利用可能な洗剤を実現できると思われ
る。さらに、常温で揮発性である有機溶媒の存在下での
化学反応への利用、腐敗を起こさない低温度での食品の
品質改善への利用などが考えられる。また、低温性細菌
由来の酵素を検討することで、低温性細菌の生理学的機
能および低温度への適用機構を解明する上で意義深いも
のと思われる。
【０００４】
【発明の概要】今般本発明者らは、Flavobacterium bal
ustinum Ｐ１０４株の培養上清からプロテアーゼを単
離、精製し、該プロテアーゼが低温において活性を有す
ることを見出した。本発明は、かかる知見に基づくもの
である。
ustinum Ｐ１０４株の培養上清からプロテアーゼを単
離、精製し、該プロテアーゼが低温において活性を有す
ることを見出した。本発明は、かかる知見に基づくもの
である。
【０００５】従って、本発明は、低温活性プロテアーゼ
の提供をその目的としている。また、本発明は、Flavob
acterium balustinum Ｐ１０４株を用いた上記低温活性
プロテアーゼの製造法の提供をその目的としている。更
に、本発明は、低温活性プロテアーゼのＮ末端に存在す
るアミノ酸配列からなるペプチドの提供をその目的とし
ている。
の提供をその目的としている。また、本発明は、Flavob
acterium balustinum Ｐ１０４株を用いた上記低温活性
プロテアーゼの製造法の提供をその目的としている。更
に、本発明は、低温活性プロテアーゼのＮ末端に存在す
るアミノ酸配列からなるペプチドの提供をその目的とし
ている。
【０００６】そして、本発明によるプロテアーゼは、下
記の理化学的性質の一部または全部を有するもの、であ
る。 ・作用および基質特異性：カゼイン、ゼラチン、ヘモグ
ロビン、およびアルブミンに作用して、これらをカゼイ
ン、ゼラチン、ヘモグロビン、およびアルブミンの順で
特異的に分解する。 ・至適作用ｐＨ：８．０である。 ・ｐＨ安定性：３０℃、１時間保持の条件下でｐＨ６．
５〜１０．０において安定である。
記の理化学的性質の一部または全部を有するもの、であ
る。 ・作用および基質特異性：カゼイン、ゼラチン、ヘモグ
ロビン、およびアルブミンに作用して、これらをカゼイ
ン、ゼラチン、ヘモグロビン、およびアルブミンの順で
特異的に分解する。 ・至適作用ｐＨ：８．０である。 ・ｐＨ安定性：３０℃、１時間保持の条件下でｐＨ６．
５〜１０．０において安定である。
【０００７】本発明によるプロテアーゼは、更に、下記
の理化学的性質の一部または全部を有するもの、であ
る。 ・至適作用温度：約４０℃である。 ・温度安定性：ｐＨ７、１時間保持の条件下で、３０℃
までの温度ではほとんど失活せず、４０℃で約４０％失
活し、５０℃、約１０分で完全に失活する。 ・酵素活性：２０℃において、最大活性の約５０％以上
の活性を有する。 ・酵素の活性中心がセリンである。 ・ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分子量が約７０ｋＤａであ
る。
の理化学的性質の一部または全部を有するもの、であ
る。 ・至適作用温度：約４０℃である。 ・温度安定性：ｐＨ７、１時間保持の条件下で、３０℃
までの温度ではほとんど失活せず、４０℃で約４０％失
活し、５０℃、約１０分で完全に失活する。 ・酵素活性：２０℃において、最大活性の約５０％以上
の活性を有する。 ・酵素の活性中心がセリンである。 ・ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分子量が約７０ｋＤａであ
る。
【０００８】本発明によるプロテアーゼは、更に、配列
番号１に記載のアミノ酸配列の一部または全部を含んで
なるタンパク質からなるものであるか、または配列番号
１に記載のアミノ酸配列の一部または全部をＮ末端に含
んでなるタンパク質からなるものである。
番号１に記載のアミノ酸配列の一部または全部を含んで
なるタンパク質からなるものであるか、または配列番号
１に記載のアミノ酸配列の一部または全部をＮ末端に含
んでなるタンパク質からなるものである。
【０００９】本発明の別の面によれば、２０℃におい
て、その最大活性の約５０％以上の活性を有するプロテ
アーゼが提供される。
て、その最大活性の約５０％以上の活性を有するプロテ
アーゼが提供される。
【００１０】本発明の更に別の面によれば、配列番号１
に記載のアミノ酸配列の一部または全部を含んでなるタ
ンパク質からなるプロテアーゼ、および配列番号１に記
載のアミノ酸配列の一部または全部をＮ末端に含んでな
るタンパク質からなるプロテアーゼが提供される。
に記載のアミノ酸配列の一部または全部を含んでなるタ
ンパク質からなるプロテアーゼ、および配列番号１に記
載のアミノ酸配列の一部または全部をＮ末端に含んでな
るタンパク質からなるプロテアーゼが提供される。
【００１１】本発明による上記プロテアーゼの製造法
は、該プロテアーゼを産生するFlavobacterium balusti
num Ｐ１０４（ＦＥＲＭ ＢＰ−５００６）を培養
し、その培養物から該プロテアーゼを採取することを含
んでなるもの、である。
は、該プロテアーゼを産生するFlavobacterium balusti
num Ｐ１０４（ＦＥＲＭ ＢＰ−５００６）を培養
し、その培養物から該プロテアーゼを採取することを含
んでなるもの、である。
【００１２】
【発明の具体的説明】酵素の性質 本発明による酵素の性質は、次に示される通りである。 作用および基質特異性 本発明による酵素は、カゼイン、ゼラチン、ヘモグロビ
ン、およびアルブミンに作用してこれらを特異的に分解
した。基質特異性は、カゼイン、ゼラチン、ヘモグロビ
ン、アルブミンの順で小さくなる。
ン、およびアルブミンに作用してこれらを特異的に分解
した。基質特異性は、カゼイン、ゼラチン、ヘモグロビ
ン、アルブミンの順で小さくなる。
【００１３】 至適ｐＨ 本発明による酵素の至適作用ｐＨは８．０であった。ま
た、ｐＨ６．５〜ｐＨ９．５まで約９０％以上の活性を
保持していた。
た、ｐＨ６．５〜ｐＨ９．５まで約９０％以上の活性を
保持していた。
【００１４】 ｐＨ安定性 本発明による酵素は、３０℃、１時間保持の条件下で、
ｐＨ６．５〜１０．０において安定であった。
ｐＨ６．５〜１０．０において安定であった。
【００１５】 至適温度 本発明による酵素の至適作用温度は、ｐＨ１０とｐＨ７
において４０℃である。３０℃において、ｐＨ１０では
約８０％の活性を保持しており、ｐＨ７では約９０％の
活性を保持していた。５０℃において、ｐＨ１０では約
１０％の活性を保持しており、ｐＨ７では約８０％の活
性を保持していた。市販の酵素であるサビナーゼでは、
至適温度が６０℃である。また、既知の低温酵素の至適
温度は、約４０℃付近であることが多い。従って、本発
明による酵素は、低温酵素であると考えられる。
において４０℃である。３０℃において、ｐＨ１０では
約８０％の活性を保持しており、ｐＨ７では約９０％の
活性を保持していた。５０℃において、ｐＨ１０では約
１０％の活性を保持しており、ｐＨ７では約８０％の活
性を保持していた。市販の酵素であるサビナーゼでは、
至適温度が６０℃である。また、既知の低温酵素の至適
温度は、約４０℃付近であることが多い。従って、本発
明による酵素は、低温酵素であると考えられる。
【００１６】 温度安定性 本発明による酵素は、ｐＨ７、１時間保持の条件下で、
３０℃までの温度ではほとんど失活せず、４０℃で約４
０％失活し、５０℃、約１０分で完全に失活する。従っ
て、本発明による酵素は、低温酵素であると考えられ
る。
３０℃までの温度ではほとんど失活せず、４０℃で約４
０％失活し、５０℃、約１０分で完全に失活する。従っ
て、本発明による酵素は、低温酵素であると考えられ
る。
【００１７】 酵素活性 本発明による酵素は、２０℃において、最大活性の約５
０％以上の活性を有する。従って、本発明の別の面によ
れば、２０℃において、その最大活性の約５０％以上の
活性を有するプロテアーゼが提供される。
０％以上の活性を有する。従って、本発明の別の面によ
れば、２０℃において、その最大活性の約５０％以上の
活性を有するプロテアーゼが提供される。
【００１８】 活性の阻害 本発明による酵素は、ペプスタチン、L-trans-エポキシ
スクシニルロイシルアミド−４−グアニジノブタン（Ｅ
−６４）、ヨードアセトアミド、１，１０−フェナント
ロリン、によってそのプロテアーゼ活性を阻害されるこ
となく、フェニルメタンスルホニルフルオリド（ＰＭＳ
Ｆ）、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）によって顕
著に阻害された。このことから、本発明による酵素はセ
リンプロテアーゼであることが示唆された。従って、本
発明による酵素の活性中心は、セリンであると考えられ
る。
スクシニルロイシルアミド−４−グアニジノブタン（Ｅ
−６４）、ヨードアセトアミド、１，１０−フェナント
ロリン、によってそのプロテアーゼ活性を阻害されるこ
となく、フェニルメタンスルホニルフルオリド（ＰＭＳ
Ｆ）、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）によって顕
著に阻害された。このことから、本発明による酵素はセ
リンプロテアーゼであることが示唆された。従って、本
発明による酵素の活性中心は、セリンであると考えられ
る。
【００１９】 分子量 本発明による酵素は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって測定し
た分子量が約７０ｋＤａであった。
た分子量が約７０ｋＤａであった。
【００２０】 Ｎ末端アミノ酸配列 本発明による酵素のＮ末端アミノ酸配列は、配列番号１
に記載される通りである。本発明による酵素のＮ末端ア
ミノ酸配列についてデータバンク「Ｅｎｔｒｅｚ」を用
いて既知のタンパク質のアミノ酸配列との相同性を調べ
たところ、既知のタンパク質のアミノ酸配列との相同性
がなかった。従って、本発明によるプロテアーゼは、配
列番号１に記載のアミノ酸配列の一部または全部を含ん
でなるタンパク質からなるもの、または配列番号１に記
載のアミノ酸配列の一部または全部をＮ末端に含んでな
るタンパク質からなるものであってもよい。
に記載される通りである。本発明による酵素のＮ末端ア
ミノ酸配列についてデータバンク「Ｅｎｔｒｅｚ」を用
いて既知のタンパク質のアミノ酸配列との相同性を調べ
たところ、既知のタンパク質のアミノ酸配列との相同性
がなかった。従って、本発明によるプロテアーゼは、配
列番号１に記載のアミノ酸配列の一部または全部を含ん
でなるタンパク質からなるもの、または配列番号１に記
載のアミノ酸配列の一部または全部をＮ末端に含んでな
るタンパク質からなるものであってもよい。
【００２１】また、本発明の更に別の面によれば、配列
番号１に記載のアミノ酸配列の一部または全部を含んで
なるタンパク質からなるプロテアーゼ、および配列番号
１に記載のアミノ酸配列の一部または全部をＮ末端に含
んでなるタンパク質からなるプロテアーゼが提供され
る。このプロテアーゼは、上記〜に記載されるよう
な性質を有していてもよい。
番号１に記載のアミノ酸配列の一部または全部を含んで
なるタンパク質からなるプロテアーゼ、および配列番号
１に記載のアミノ酸配列の一部または全部をＮ末端に含
んでなるタンパク質からなるプロテアーゼが提供され
る。このプロテアーゼは、上記〜に記載されるよう
な性質を有していてもよい。
【００２２】ここで、「配列番号１に記載のアミノ酸配
列の一部または全部を含んでなるタンパク質」とは、配
列番号１に記載されるアミノ酸配列の一部または全部の
Ｎ末端および／またはＣ末端に任意のアミノ酸配列を付
加したタンパク質が挙げられる。
列の一部または全部を含んでなるタンパク質」とは、配
列番号１に記載されるアミノ酸配列の一部または全部の
Ｎ末端および／またはＣ末端に任意のアミノ酸配列を付
加したタンパク質が挙げられる。
【００２３】プロテアーゼの製造法 本発明によるプロテアーゼは、微生物を用いて生産され
る。その生産菌としては、Flavobacterium属に属し、上
記性質を有するプロテアーゼを産生する能力を有するも
のであればよい。
る。その生産菌としては、Flavobacterium属に属し、上
記性質を有するプロテアーゼを産生する能力を有するも
のであればよい。
【００２４】本発明によるプロテアーゼを産生する能力
を有する微生物の好ましい具体例としては、Flavobacte
rium balustinum Ｐ１０４株が挙げられる。この菌株
は、本発明者がサケの腸から分離した微生物であり、工
業技術院生命工学工業技術研究所に平成７年２月１７日
付けで寄託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−５００６のもと寄託さ
れている。
を有する微生物の好ましい具体例としては、Flavobacte
rium balustinum Ｐ１０４株が挙げられる。この菌株
は、本発明者がサケの腸から分離した微生物であり、工
業技術院生命工学工業技術研究所に平成７年２月１７日
付けで寄託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−５００６のもと寄託さ
れている。
【００２５】本発明に使用される菌株の培養にあたって
は、培地は液体でも固体でもよいが通常は液体培地によ
る振とう培養、または通気攪拌培養が用いられる。
は、培地は液体でも固体でもよいが通常は液体培地によ
る振とう培養、または通気攪拌培養が用いられる。
【００２６】この微生物を培養する培地としては、生育
に適し、プロテアーゼを生産し得るものであればどのよ
うなものでもよい。すなわち炭素源としては、例えばグ
ルコース、トレハロース、フラクトース、マルトース、
シュークロース、澱粉、マルトオリゴ糖等が用いられ
る。窒素源としては例えばペプトン、酵母エキス、麦芽
エキス、肉エキス、大豆粉、綿実粉、コーンステイープ
リカー、各種アミノ酸類、およびその塩類、硝酸塩等が
用いられる。その他、燐酸マグネシウム、カルシウム、
ナトリウム、カリウム、鉄、マンガン等の無機塩類、さ
らに必要に応じてその他の栄養物を程よく含有する合成
培地または天然培地を使用することができる。
に適し、プロテアーゼを生産し得るものであればどのよ
うなものでもよい。すなわち炭素源としては、例えばグ
ルコース、トレハロース、フラクトース、マルトース、
シュークロース、澱粉、マルトオリゴ糖等が用いられ
る。窒素源としては例えばペプトン、酵母エキス、麦芽
エキス、肉エキス、大豆粉、綿実粉、コーンステイープ
リカー、各種アミノ酸類、およびその塩類、硝酸塩等が
用いられる。その他、燐酸マグネシウム、カルシウム、
ナトリウム、カリウム、鉄、マンガン等の無機塩類、さ
らに必要に応じてその他の栄養物を程よく含有する合成
培地または天然培地を使用することができる。
【００２７】培地のｐＨ、培養温度などの培養条件はプ
ロテアーゼを生産する範囲内で適宜変更し得るが、液体
振とう培養、または通気攪拌培養の場合は、ｐＨは中性
付近、培養温度は１０〜２０℃が適当である。
ロテアーゼを生産する範囲内で適宜変更し得るが、液体
振とう培養、または通気攪拌培養の場合は、ｐＨは中性
付近、培養温度は１０〜２０℃が適当である。
【００２８】本発明によるプロテアーゼは菌体の細胞
壁、菌体内、培養上清に存在し、その使用形態として
は、菌体、菌体や培養上清等からの粗酵素、あるいは抽
出精製酵素などいずれの形態でも良い。また公知の方法
により固定化したものも利用できる。
壁、菌体内、培養上清に存在し、その使用形態として
は、菌体、菌体や培養上清等からの粗酵素、あるいは抽
出精製酵素などいずれの形態でも良い。また公知の方法
により固定化したものも利用できる。
【００２９】上記培養液からの本発明によるプロテアー
ゼの採取、精製には、既知の精製法が単独もしくは併用
して利用できる。
ゼの採取、精製には、既知の精製法が単独もしくは併用
して利用できる。
【００３０】本発明によるプロテアーゼは、主として菌
体外、すなわち培養液中に分泌されるため、例えば瀘過
または遠心分離により菌体を除去することによって容易
に粗酵素液を得ることができる。この粗酵素は、さらに
既知の精製法によって精製することができる。好ましい
精製法としては、硫安などによる塩析、有機溶媒（例え
ば、メタノール、エタノール、アセトンなど）による沈
殿法、生デンプンによる吸着法、限外瀘過、ゲル瀘過ク
ロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、そ
の他の各種クロマトグラフィーなどが挙げられる。好ま
しい精製法の具体例は後記する実施例において記載す
る。
体外、すなわち培養液中に分泌されるため、例えば瀘過
または遠心分離により菌体を除去することによって容易
に粗酵素液を得ることができる。この粗酵素は、さらに
既知の精製法によって精製することができる。好ましい
精製法としては、硫安などによる塩析、有機溶媒（例え
ば、メタノール、エタノール、アセトンなど）による沈
殿法、生デンプンによる吸着法、限外瀘過、ゲル瀘過ク
ロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、そ
の他の各種クロマトグラフィーなどが挙げられる。好ま
しい精製法の具体例は後記する実施例において記載す
る。
【００３１】酵素の利用 本発明による低温活性プロテアーゼは、低温に最適温度
をもつ。そこで、本発明による低温活性プロテアーゼに
よれば、低温環境においてタンパク質の分解反応を行う
ことが可能となる。例えば、衣料用洗剤組成物に添加す
ることで、低水温でも利用可能な洗剤を実現できる。こ
の洗剤組成物は、本発明による低温活性プロテアーゼが
添加された以外は、常法に従って構成することができ
る。すなわち、洗剤用界面活性剤、漂白剤、ビルダーな
ど、通常の洗剤組成物と組み合わせて構成することがで
きる。
をもつ。そこで、本発明による低温活性プロテアーゼに
よれば、低温環境においてタンパク質の分解反応を行う
ことが可能となる。例えば、衣料用洗剤組成物に添加す
ることで、低水温でも利用可能な洗剤を実現できる。こ
の洗剤組成物は、本発明による低温活性プロテアーゼが
添加された以外は、常法に従って構成することができ
る。すなわち、洗剤用界面活性剤、漂白剤、ビルダーな
ど、通常の洗剤組成物と組み合わせて構成することがで
きる。
【００３２】さらに、本発明による低温活性プロテアー
ゼは、低温で反応を進行させることができる。したがっ
て、反応系に常温で揮発性である有機溶媒が存在する場
合であっても、有機溶媒成分を揮発させることのない低
温下で反応を行うことができる。また、さらに、本発明
によるプロテアーゼを用いて、食品の品質改善を行う場
合、低温で反応が進むことから、食品の腐敗を有効に防
止できる点でも有利である。また、本発明によるプロテ
アーゼが提供されたことで、低温性細菌の生理学的機
能、および低温度への適用機構の解明が進むことが期待
される。
ゼは、低温で反応を進行させることができる。したがっ
て、反応系に常温で揮発性である有機溶媒が存在する場
合であっても、有機溶媒成分を揮発させることのない低
温下で反応を行うことができる。また、さらに、本発明
によるプロテアーゼを用いて、食品の品質改善を行う場
合、低温で反応が進むことから、食品の腐敗を有効に防
止できる点でも有利である。また、本発明によるプロテ
アーゼが提供されたことで、低温性細菌の生理学的機
能、および低温度への適用機構の解明が進むことが期待
される。
【００３３】Ｎ末端アミノ酸配列を有するタンパク質等 本発明によれば配列番号１に記載されるアミノ酸配列の
一部または全部からなるペプチド、並びに配列番号１に
記載されるアミノ酸配列の一部または全部を含んでなる
タンパク質および配列番号１に記載されるアミノ酸配列
の一部または全部をＮ末端に含んでなるタンパク質が提
供される。このタンパク質は、プロテアーゼ活性を有し
ていてもよい。
一部または全部からなるペプチド、並びに配列番号１に
記載されるアミノ酸配列の一部または全部を含んでなる
タンパク質および配列番号１に記載されるアミノ酸配列
の一部または全部をＮ末端に含んでなるタンパク質が提
供される。このタンパク質は、プロテアーゼ活性を有し
ていてもよい。
【００３４】このペプチドまたはタンパク質は、本発明
による酵素のＮ末端に存在するアミノ酸配列の一部また
は全部からなるもの、またはこのアミノ酸配列の一部ま
たは全部を（好ましくはＮ端末に）含んでなるもの、で
ある。従って、上記ペプチドまたはタンパク質は、例え
ば、本発明による酵素に対する抗体を作成する際の抗原
として有用である。
による酵素のＮ末端に存在するアミノ酸配列の一部また
は全部からなるもの、またはこのアミノ酸配列の一部ま
たは全部を（好ましくはＮ端末に）含んでなるもの、で
ある。従って、上記ペプチドまたはタンパク質は、例え
ば、本発明による酵素に対する抗体を作成する際の抗原
として有用である。
【００３５】
【実施例】本発明を以下の実施例によって詳細に説明す
るが、本発明はこれらに限定されるものではない。試験方法 タンパク質の定量は、色素結合法であるバイオラッドプ
ロテインアッセイ（バイオラッド社）を用いて行った。
また、クロマトグラフィーによるタンパク質の検出は、
２８０ｎｍの紫外部の吸収を測定することによって行っ
た。
るが、本発明はこれらに限定されるものではない。試験方法 タンパク質の定量は、色素結合法であるバイオラッドプ
ロテインアッセイ（バイオラッド社）を用いて行った。
また、クロマトグラフィーによるタンパク質の検出は、
２８０ｎｍの紫外部の吸収を測定することによって行っ
た。
【００３６】プロテアーゼの活性の測定は、次の（ａ）
または（ｂ）の方法に従って行った。 （ａ）アゾカゼインによるタンパク質の分解活性 １％（Ｗ／Ｖ）アゾカゼインを含む６７ｍＭリン酸緩衝
液（ｐＨ７）０．３ｍｌに対して、試料酵素液０．０５
ｍｌ加え、３０分間３０℃で保温した。その後、６％ト
リクロロ酢酸１ｍｌで反応を止め、室温で約１５分間放
置後、遠心分離（１５，０００ｒｐｍ、室温、１０分）
した。その上清を分光光度計を用いて、３４０ｎｍの吸
光度を測定した。１ＡＵは、上記条件下において吸光度
が３０分当たり１．０増加する値と定義される。
または（ｂ）の方法に従って行った。 （ａ）アゾカゼインによるタンパク質の分解活性 １％（Ｗ／Ｖ）アゾカゼインを含む６７ｍＭリン酸緩衝
液（ｐＨ７）０．３ｍｌに対して、試料酵素液０．０５
ｍｌ加え、３０分間３０℃で保温した。その後、６％ト
リクロロ酢酸１ｍｌで反応を止め、室温で約１５分間放
置後、遠心分離（１５，０００ｒｐｍ、室温、１０分）
した。その上清を分光光度計を用いて、３４０ｎｍの吸
光度を測定した。１ＡＵは、上記条件下において吸光度
が３０分当たり１．０増加する値と定義される。
【００３７】（ｂ）フェノール試薬法 １％（Ｗ／Ｖ）基質溶液を含む１００ｍＭグリシン−塩
化ナトリウム緩衝液（ｐＨ１０）１３０μｌに対して、
試料酵素液２０μｌ加え、１時間３０℃で保温した。そ
の後、トリクロロ酢酸溶液（０．１１Ｍ トリクロロ酢
酸、０．２２Ｍ酢酸ナトリウム、０．３３Ｍ 酢酸）を
１５０μｌ加え反応を止めた。３０分間室温で放置後、
遠心（１０，０００ｒｐｍ、室温、１０分）し、上清１
００μｌに０．５Ｍ 炭酸ナトリウム溶液５００μｌ、
および蒸留水で２倍希釈したフェノール溶液を１００μ
ｌ加え、室温で１時間放置後、６６０ｎｍの吸収を測定
した。
化ナトリウム緩衝液（ｐＨ１０）１３０μｌに対して、
試料酵素液２０μｌ加え、１時間３０℃で保温した。そ
の後、トリクロロ酢酸溶液（０．１１Ｍ トリクロロ酢
酸、０．２２Ｍ酢酸ナトリウム、０．３３Ｍ 酢酸）を
１５０μｌ加え反応を止めた。３０分間室温で放置後、
遠心（１０，０００ｒｐｍ、室温、１０分）し、上清１
００μｌに０．５Ｍ 炭酸ナトリウム溶液５００μｌ、
および蒸留水で２倍希釈したフェノール溶液を１００μ
ｌ加え、室温で１時間放置後、６６０ｎｍの吸収を測定
した。
【００３８】実施例１ Flavobacterium balustinum Ｐ
１０４株由来プロテアーゼの精製 （１）菌株の培養 菌の生育活性を安定化させるために、菌株を下記の培養
培地１５０ｍｌ（１００ｍｌ三角フラスコ６本に分注）
に接種し、１０℃、４８時間、トリプルシェイカーＮＲ
−８０（タイテック社）を用いて、１４０ｒｐｍで回転
振盪培養した。本培養は、ラボラトリーファーメンター
ＬＳ−５（オリエンタル酵母工業株式会社）を用いて、
下記の培養培地３リットルに前培養液１５０ｍｌを接種
し、１０℃、７５時間、１４０ｒｐｍで回転培養した。
１０４株由来プロテアーゼの精製 （１）菌株の培養 菌の生育活性を安定化させるために、菌株を下記の培養
培地１５０ｍｌ（１００ｍｌ三角フラスコ６本に分注）
に接種し、１０℃、４８時間、トリプルシェイカーＮＲ
−８０（タイテック社）を用いて、１４０ｒｐｍで回転
振盪培養した。本培養は、ラボラトリーファーメンター
ＬＳ−５（オリエンタル酵母工業株式会社）を用いて、
下記の培養培地３リットルに前培養液１５０ｍｌを接種
し、１０℃、７５時間、１４０ｒｐｍで回転培養した。
【００３９】＜培養培地＞ ポリペプトン ３ｇ／リットル 酵母エキス ２．５ｇ／リットル カゼインナトリウム ２．５ｇ／リットル Ｎａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２Ｏ ３ｇ／リットル ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．２ｇ／リットル （ｐＨ７．０） 培地等は、主としてオートクレーブで１．２ｋｇｆ／ｃ
ｍ２（ゲージ圧）（１２１℃）、１５分間、高圧蒸気殺
菌した。
ｍ２（ゲージ圧）（１２１℃）、１５分間、高圧蒸気殺
菌した。
【００４０】（２）本発明による酵素の精製 すべてのプロテアーゼの精製操作は、４℃において行っ
た。 （ａ） イオン交換クロマトグラフィー 上記（１）で得られた培養液を、遠心分離（７，２００
×ｇ、４℃、３０分）により清澄した。その上清を粗酵
素液としてイオン交換クロマトグラフィーに付した。カ
ラムは、ＤＥＡＥセファロースファストフロー陰イオン
交換体（ファルマシアバイオテク社）を２リットル充填
したＩＮｄＥＸ１００カラム（ファルマシアバイオテク
社）を用いた。上記のカラムに２０ｍＭ トリス緩衝液
（ｐＨ７．０）を用いて、線速度（１５０ｃｍ／ｈ）で
ゲル体積の５倍以上（１０リットル）平衡化した。粗酵
素液を線速度１００ｃｍ／ｈで添加した。溶出は、２０
ｍＭ トリス緩衝液（ｐＨ７．０）に０．２Ｍ，０．４
Ｍ，および０．６Ｍ ＮａＣｌを加えたものをそれぞれ
２リットルずつ用いて、線速度１００ｃｍ／ｈで溶出
し、ＵＶ計でタンパク質が検出された部分だけを分取し
た。
た。 （ａ） イオン交換クロマトグラフィー 上記（１）で得られた培養液を、遠心分離（７，２００
×ｇ、４℃、３０分）により清澄した。その上清を粗酵
素液としてイオン交換クロマトグラフィーに付した。カ
ラムは、ＤＥＡＥセファロースファストフロー陰イオン
交換体（ファルマシアバイオテク社）を２リットル充填
したＩＮｄＥＸ１００カラム（ファルマシアバイオテク
社）を用いた。上記のカラムに２０ｍＭ トリス緩衝液
（ｐＨ７．０）を用いて、線速度（１５０ｃｍ／ｈ）で
ゲル体積の５倍以上（１０リットル）平衡化した。粗酵
素液を線速度１００ｃｍ／ｈで添加した。溶出は、２０
ｍＭ トリス緩衝液（ｐＨ７．０）に０．２Ｍ，０．４
Ｍ，および０．６Ｍ ＮａＣｌを加えたものをそれぞれ
２リットルずつ用いて、線速度１００ｃｍ／ｈで溶出
し、ＵＶ計でタンパク質が検出された部分だけを分取し
た。
【００４１】（ｂ）限外濾過 上記で得られた分画を新型撹拌式セル８４００型（アミ
コン社）にダイアフローメンブレンＰＭ３０（分子量３
万以上を分画）（アミコン社）をセットして処理し、分
子量３万以上のタンパク質を濃縮した。
コン社）にダイアフローメンブレンＰＭ３０（分子量３
万以上を分画）（アミコン社）をセットして処理し、分
子量３万以上のタンパク質を濃縮した。
【００４２】（ｃ）硫安塩析 上記で得られた濃縮液に対し、氷冷下で硫安を５０％飽
和になるように加えた。０℃に保ち４時間ゆっくりと撹
拌した後、遠心分離（２７，０００×ｇ、４℃、２０
分）して沈殿させ、０〜５０％飽和分画を得た。硫安の
添加量は、２５℃での飽和濃度添加量を用いた。
和になるように加えた。０℃に保ち４時間ゆっくりと撹
拌した後、遠心分離（２７，０００×ｇ、４℃、２０
分）して沈殿させ、０〜５０％飽和分画を得た。硫安の
添加量は、２５℃での飽和濃度添加量を用いた。
【００４３】（ｄ）ゲル濾過 次に、HiLoad 16/60 Superdex 200 prep gradeカラム
（ファルマシアバイオテク社）によるゲル濾過を行っ
た。装置はHiLoad System 50（ファルマシアバイオテク
社）を用いた。HiLoad 16/60 Superdex 200 prep grade
カラムに線速度約６０ｃｍ／ｈでゲル体積の３倍以上
（４００ｍｌ）のＢｉｓ−トリス緩衝液（ｐＨ７）を流
し平衡化した。硫安塩析後の試料酵素液をカラムにSupe
rloop を用いて５ｍｌ添加した。溶出液Ｂｉｓ−トリス
緩衝液（ｐＨ７）を用いて、線速度６０ｃｍ／ｈで溶出
し、５ｍｌづつ分取した。
（ファルマシアバイオテク社）によるゲル濾過を行っ
た。装置はHiLoad System 50（ファルマシアバイオテク
社）を用いた。HiLoad 16/60 Superdex 200 prep grade
カラムに線速度約６０ｃｍ／ｈでゲル体積の３倍以上
（４００ｍｌ）のＢｉｓ−トリス緩衝液（ｐＨ７）を流
し平衡化した。硫安塩析後の試料酵素液をカラムにSupe
rloop を用いて５ｍｌ添加した。溶出液Ｂｉｓ−トリス
緩衝液（ｐＨ７）を用いて、線速度６０ｃｍ／ｈで溶出
し、５ｍｌづつ分取した。
【００４４】（ｅ）次に、HiLoad 16/10 Ｑ セファロ
ース HP カラムによるイオン交換クロマトグラフィーを
行った。上記のカラムに２０ｍＭ Ｂｉｓ−トリス緩衝
液（ｐＨ７）を用いて、線速度約１５０ｃｍ／ｈでゲル
体積の５倍以上（１００ｍｌ）平衡化した。上記のゲル
濾過で溶出したプロテアーゼ活性画分の試料酵素液を、
カラムにSuperloop を用いて線速度約９０ｃｍ／ｈで添
加した。溶出はＢｉｓ−トリス緩衝液（ｐＨ７）に１Ｍ
ＮａＣｌを加えたものを用いて、直線型イオン強度増
加勾配（０Ｍ〜１Ｍ）により線速度約９０ｃｍ／ｈ、１
５０ｍｌで溶出し、５ｍｌづつ分取した。以上の精製の
概要は第１表に示される通りであった。
ース HP カラムによるイオン交換クロマトグラフィーを
行った。上記のカラムに２０ｍＭ Ｂｉｓ−トリス緩衝
液（ｐＨ７）を用いて、線速度約１５０ｃｍ／ｈでゲル
体積の５倍以上（１００ｍｌ）平衡化した。上記のゲル
濾過で溶出したプロテアーゼ活性画分の試料酵素液を、
カラムにSuperloop を用いて線速度約９０ｃｍ／ｈで添
加した。溶出はＢｉｓ−トリス緩衝液（ｐＨ７）に１Ｍ
ＮａＣｌを加えたものを用いて、直線型イオン強度増
加勾配（０Ｍ〜１Ｍ）により線速度約９０ｃｍ／ｈ、１
５０ｍｌで溶出し、５ｍｌづつ分取した。以上の精製の
概要は第１表に示される通りであった。
【００４５】
【表１】
【００４６】実施例３ 本発明による酵素の精製純度お
よび分子量測定 ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気
泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）を用いて本発明による酵素の
精製純度および分子量を測定した。支持体として１ｍｍ
厚の１０％ポリアクリルアミドゲルを用いた。電気泳動
は、２０ｍＡで通電し、ブロモフェノールブルー（ＢＰ
Ｂ）が下端まで泳動するまで行った。染色法は、３０％
メタノール、１０％酢酸水溶液に０．０２％クマシーブ
リリアントブルーＲ２５０を溶解したものに１時間染色
し、脱色液（３０％メタノール、１０％酢酸）で一晩か
けて脱色した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果および検量線は
それぞれ図１および２に示される通りであった。
よび分子量測定 ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気
泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）を用いて本発明による酵素の
精製純度および分子量を測定した。支持体として１ｍｍ
厚の１０％ポリアクリルアミドゲルを用いた。電気泳動
は、２０ｍＡで通電し、ブロモフェノールブルー（ＢＰ
Ｂ）が下端まで泳動するまで行った。染色法は、３０％
メタノール、１０％酢酸水溶液に０．０２％クマシーブ
リリアントブルーＲ２５０を溶解したものに１時間染色
し、脱色液（３０％メタノール、１０％酢酸）で一晩か
けて脱色した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果および検量線は
それぞれ図１および２に示される通りであった。
【００４７】実施例４ 酵素反応へのｐＨによる影響 本発明による酵素を用いて、アゾカゼインの分解反応を
種々のｐＨにおいて実施した。反応液の緩衝液の組成
は、それぞれ１００ｍＭで、酢酸ナトリウム−酢酸緩衝
液（ｐＨ４．０−５．５）、ＭＥＳ（２−モルホリノエ
タンスルホン酸一水和物）緩衝液（ｐＨ５．５−６．
５）、ＭＯＰＳ（３−モルホリノプロパンスルホン酸）
緩衝液（ｐＨ６．５−８．０）、ＴＡＰＳ（Ｎ−トリス
（ヒドロキシメチル）メチル−３−アミノプロパンスル
ホン酸）緩衝液（ｐＨ８．０−９．０）、ＣＨＥＳ（Ｎ
−シクロヘキシル−２−アミノエタンスルホン酸）緩衝
液（ｐＨ９．０−１０．０）、ＣＡＰＳ（Ｎ−シクロヘ
キシル−３−アミノプロパンスルホン酸）緩衝液（ｐＨ
１０．０−１１．０）、グリシン−塩化ナトリウム−水
酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ１１．０−１３．０）とし
た。結果は、図３に示される通りであった。
種々のｐＨにおいて実施した。反応液の緩衝液の組成
は、それぞれ１００ｍＭで、酢酸ナトリウム−酢酸緩衝
液（ｐＨ４．０−５．５）、ＭＥＳ（２−モルホリノエ
タンスルホン酸一水和物）緩衝液（ｐＨ５．５−６．
５）、ＭＯＰＳ（３−モルホリノプロパンスルホン酸）
緩衝液（ｐＨ６．５−８．０）、ＴＡＰＳ（Ｎ−トリス
（ヒドロキシメチル）メチル−３−アミノプロパンスル
ホン酸）緩衝液（ｐＨ８．０−９．０）、ＣＨＥＳ（Ｎ
−シクロヘキシル−２−アミノエタンスルホン酸）緩衝
液（ｐＨ９．０−１０．０）、ＣＡＰＳ（Ｎ−シクロヘ
キシル−３−アミノプロパンスルホン酸）緩衝液（ｐＨ
１０．０−１１．０）、グリシン−塩化ナトリウム−水
酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ１１．０−１３．０）とし
た。結果は、図３に示される通りであった。
【００４８】至適ｐＨであるｐＨ８．０の相対活性がｐ
Ｈ６．５からｐＨ９．５まで約９０％以上で維持され
た。よって、本発明による酵素は、中性ｐＨを中心とし
てかなり広範囲に作用することが分かった。しかし、ｐ
Ｈ５．０以下の酸性ｐＨやｐＨ１１．０以上のアルカリ
ｐＨではあまり作用せず、ｐＨ１３. ０ではプロテアー
ゼ活性は失活した。
Ｈ６．５からｐＨ９．５まで約９０％以上で維持され
た。よって、本発明による酵素は、中性ｐＨを中心とし
てかなり広範囲に作用することが分かった。しかし、ｐ
Ｈ５．０以下の酸性ｐＨやｐＨ１１．０以上のアルカリ
ｐＨではあまり作用せず、ｐＨ１３. ０ではプロテアー
ゼ活性は失活した。
【００４９】実施例５ 本発明による酵素のｐＨ安定性 本発明による酵素を上記の緩衝液を用いて３０℃で１時
間保温し、残存プロテアーゼ活性を調べた。結果は、図
４に示されるとおりであった。本発明による酵素は、３
０℃、１時間の条件で、ｐＨ６．５からｐＨ１０．０の
範囲で安定であり、ｐＨ４．０およびｐＨ１１．０では
上記の条件で失活することが分かった。
間保温し、残存プロテアーゼ活性を調べた。結果は、図
４に示されるとおりであった。本発明による酵素は、３
０℃、１時間の条件で、ｐＨ６．５からｐＨ１０．０の
範囲で安定であり、ｐＨ４．０およびｐＨ１１．０では
上記の条件で失活することが分かった。
【００５０】実施例６ 酵素反応への温度の影響 本発明による酵素を用いてアゾカゼインの分解反応を６
７ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７）および１００ｍＭグリシ
ン−塩化ナトリウム溶液（ｐＨ１０）中における種々の
温度下において実施した。反応温度は５℃から７０℃ま
で変化させた。また、市販酵素のサビナーゼ（ノボノル
ディスク社）についてもｐＨ７における温度の影響を測
定した。結果は図５に示される通りであった。
７ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７）および１００ｍＭグリシ
ン−塩化ナトリウム溶液（ｐＨ１０）中における種々の
温度下において実施した。反応温度は５℃から７０℃ま
で変化させた。また、市販酵素のサビナーゼ（ノボノル
ディスク社）についてもｐＨ７における温度の影響を測
定した。結果は図５に示される通りであった。
【００５１】本発明による酵素の至適温度は、ｐＨ１０
とｐＨ７において至適作用温度は４０℃であった。３０
℃において、ｐＨ１０では約８０％の活性を保持してお
り、ｐＨ７では約９０％の活性を保持していた。５０℃
において、ｐＨ１０では約１０％の活性を保持してお
り、ｐＨ７では約８０％の活性を保持していた。市販の
サビナーゼは、至適温度が６０℃であり、本発明による
酵素に比べて著しく高い値を示した。
とｐＨ７において至適作用温度は４０℃であった。３０
℃において、ｐＨ１０では約８０％の活性を保持してお
り、ｐＨ７では約９０％の活性を保持していた。５０℃
において、ｐＨ１０では約１０％の活性を保持してお
り、ｐＨ７では約８０％の活性を保持していた。市販の
サビナーゼは、至適温度が６０℃であり、本発明による
酵素に比べて著しく高い値を示した。
【００５２】実施例７ 本発明による酵素の温度安定性 本発明による酵素を１時間保持の条件下において、１０
℃〜６０℃で保温した。その活性の経時変化は図６に示
されるとおりであった。本発明による酵素は、１時間の
１０℃、２０℃、３０℃での保温ではあまり変化しなか
った。しかし、４０℃での保温では約６０％まで失活
し、その後徐々に失活していった。そして、５０℃、６
０℃では、急速に失活し、１０分以降から完全に失活し
ていた。
℃〜６０℃で保温した。その活性の経時変化は図６に示
されるとおりであった。本発明による酵素は、１時間の
１０℃、２０℃、３０℃での保温ではあまり変化しなか
った。しかし、４０℃での保温では約６０％まで失活
し、その後徐々に失活していった。そして、５０℃、６
０℃では、急速に失活し、１０分以降から完全に失活し
ていた。
【００５３】実施例８ 本発明による酵素の阻害剤によ
る影響 阻害剤としては、アスパラギン酸プロテアーゼに作用す
るペプスタチン、システインプロテアーゼに作用するＬ
−ｔｒａｎｓ−エポキシスクシニルロイシルアミド−４
−グアニジノブタン（Ｅ−６４）およびヨードアセトア
ミド、セリンプロテアーゼに作用するフェニルメタンス
ルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）、並びに金属プロテア
ーゼおよび金属依存性プロテアーゼに作用する1,10−フ
ェナントロリンおよびエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴ
Ａ）を用いた。種々の終濃度になるように阻害剤を加え
た後、３０℃で０．５または１時間保温し、残存プロテ
アーゼ活性を調べた。その結果は、第２表に示されると
おりであった。
る影響 阻害剤としては、アスパラギン酸プロテアーゼに作用す
るペプスタチン、システインプロテアーゼに作用するＬ
−ｔｒａｎｓ−エポキシスクシニルロイシルアミド−４
−グアニジノブタン（Ｅ−６４）およびヨードアセトア
ミド、セリンプロテアーゼに作用するフェニルメタンス
ルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）、並びに金属プロテア
ーゼおよび金属依存性プロテアーゼに作用する1,10−フ
ェナントロリンおよびエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴ
Ａ）を用いた。種々の終濃度になるように阻害剤を加え
た後、３０℃で０．５または１時間保温し、残存プロテ
アーゼ活性を調べた。その結果は、第２表に示されると
おりであった。
【００５４】
【表２】
【００５５】本発明による酵素は、ペプスタチン、Ｌ−
ｔｒａｎｓ−エポキシスクシニルロイシルアミド−４−
グアニジノブタン（Ｅ−６４）、ヨードアセトアミド、
１，１０−フェナントロリンによってそのプロテアーゼ
活性を阻害されることなく、フェニルメタンスルホニル
フルオリド（ＰＭＳＦ）、エチレンジアミン四酢酸（Ｅ
ＤＴＡ）によって顕著に阻害された。このことから、本
発明による酵素はセリンプロテアーゼであり、活性中心
がセリンであることが示唆された。
ｔｒａｎｓ−エポキシスクシニルロイシルアミド−４−
グアニジノブタン（Ｅ−６４）、ヨードアセトアミド、
１，１０−フェナントロリンによってそのプロテアーゼ
活性を阻害されることなく、フェニルメタンスルホニル
フルオリド（ＰＭＳＦ）、エチレンジアミン四酢酸（Ｅ
ＤＴＡ）によって顕著に阻害された。このことから、本
発明による酵素はセリンプロテアーゼであり、活性中心
がセリンであることが示唆された。
【００５６】実施例９ プロテアーゼの基質特異性 基質タンパク質として、カゼイン、ヘモグロビン、アル
ブミン、ゼラチンを用い、フェノール試薬法によってタ
ンパク質分解活性を測定した。その結果は、第３表に示
される通りであった。
ブミン、ゼラチンを用い、フェノール試薬法によってタ
ンパク質分解活性を測定した。その結果は、第３表に示
される通りであった。
【００５７】
【表３】
【００５８】本発明による酵素は、低温においてカゼイ
ンに特異的に作用し、その基質特異性はゼラチン、ヘモ
グロビン、アルブミンの順に小さくなった。
ンに特異的に作用し、その基質特異性はゼラチン、ヘモ
グロビン、アルブミンの順に小さくなった。
【００５９】実施例１０ Ｎ末端アミノ酸配列の決定 本発明による酵素のＮ末端アミノ酸配列を３０残基決定
した。結果は図７および配列番号１に示される通りであ
った。本発明による酵素のＮ末端アミノ酸配列を決定
し、データバンク「Ｅｎｔｒｅｚ」を用いて既知のアミ
ノ酸配列との相同性を調べたところ、相同性がなかっ
た。本発明による酵素は、既知のタンパク質のアミノ酸
配列との相同性がないことから、新規なＮ末端アミノ酸
配列をもつことが分かった。
した。結果は図７および配列番号１に示される通りであ
った。本発明による酵素のＮ末端アミノ酸配列を決定
し、データバンク「Ｅｎｔｒｅｚ」を用いて既知のアミ
ノ酸配列との相同性を調べたところ、相同性がなかっ
た。本発明による酵素は、既知のタンパク質のアミノ酸
配列との相同性がないことから、新規なＮ末端アミノ酸
配列をもつことが分かった。
【００６０】
配列番号：１ 配列の長さ：３０ 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド フラグメント型：Ｎ末端 起源 生物名：Flavobacterium balustinum 株 名：Ｐ１０４株 配列 Asp Thr Arg Gln Leu Leu Asn Ala Asn Ser Asp Leu Leu Asn Thr Thr 1 5 10 15 Gly Asn Val Thr Gly Leu Thr Gly Ala Phe Asn Gly Glu Asn 20 25 30
【図１】本発明による酵素の精製の結果を示した図であ
る。
る。
【図２】本発明による酵素の分子量を測定するための検
量線を示した図である。
量線を示した図である。
【図３】本発明による酵素の酵素反応へのｐＨの影響を
示した図である。黒丸は酢酸ナトリウム−酢酸緩衝液、
黒三角形はＭＥＳ、黒四角形はＭＯＰＳ、白丸はＴＡＰ
Ｓ、白三角形はＣＨＥＳ、白四角形はＣＡＰＳ、×印は
グリシン−ＮａＣｌ−ＮａＯＨ緩衝液を用いた場合をそ
れぞれ示す。
示した図である。黒丸は酢酸ナトリウム−酢酸緩衝液、
黒三角形はＭＥＳ、黒四角形はＭＯＰＳ、白丸はＴＡＰ
Ｓ、白三角形はＣＨＥＳ、白四角形はＣＡＰＳ、×印は
グリシン−ＮａＣｌ−ＮａＯＨ緩衝液を用いた場合をそ
れぞれ示す。
【図４】本発明による酵素のｐＨ安定性を示した図であ
る。黒丸は酢酸ナトリウム−酢酸緩衝液、黒三角形はＭ
ＥＳ、黒四角形はＭＯＰＳ、白丸はＴＡＰＳ、白三角形
はＣＨＥＳ、白四角形はＣＡＰＳ、×印はグリシン−Ｎ
ａＣｌ−ＮａＯＨ緩衝液を用いた場合をそれぞれ示す。
る。黒丸は酢酸ナトリウム−酢酸緩衝液、黒三角形はＭ
ＥＳ、黒四角形はＭＯＰＳ、白丸はＴＡＰＳ、白三角形
はＣＨＥＳ、白四角形はＣＡＰＳ、×印はグリシン−Ｎ
ａＣｌ−ＮａＯＨ緩衝液を用いた場合をそれぞれ示す。
【図５】本発明による酵素の酵素反応への温度の影響を
示した図である。黒丸はｐＨ７における本発明による酵
素、黒三角形はｐＨ１０における本発明による酵素、白
四角はｐＨ７におけるサビナーゼである。
示した図である。黒丸はｐＨ７における本発明による酵
素、黒三角形はｐＨ１０における本発明による酵素、白
四角はｐＨ７におけるサビナーゼである。
【図６】本発明による酵素の温度安定性を示した図であ
る。黒丸は１０℃、黒三角形は２０℃、黒四角形は３０
℃、白丸は４０℃、白三角形は５０℃、白四角形は６０
℃である。
る。黒丸は１０℃、黒三角形は２０℃、黒四角形は３０
℃、白丸は４０℃、白三角形は５０℃、白四角形は６０
℃である。
【図７】本発明による酵素のＮ末端アミノ酸残基を示
す。
す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (71)出願人 592043805 ＯＮＥ ＰＲＯＣＴＥＲ ＆ ＧＡＮＢＬ Ｅ ＰＬＡＺＡ，ＣＩＮＣＩＮＮＡＴＩ, ＯＨＩＯ，ＵＮＩＴＥＤ ＳＴＡＴＥＳ ＯＦ ＡＭＥＲＩＣＡ (72)発明者 エー．ケイ．エム．カムルール、ハサーン 兵庫県神戸市東灘区魚崎南５−４−10− 403 (72)発明者 民 谷 栄 一 石川県能美郡辰口町字大口１番地１ Ａ− １−15
Claims (13)
- 【請求項１】２０℃において、その最大活性の約５０％
以上の活性を有する、プロテアーゼ。 - 【請求項２】下記の理化学的性質を有する、プロテアー
ゼ。 （ａ）作用および基質特異性：カゼイン、ゼラチン、ヘ
モグロビン、およびアルブミンに作用してこれらを特異
的に分解する。基質特異性は、カゼイン、ゼラチン、ヘ
モグロビン、アルブミンの順で小さくなる。 （ｂ）至適作用ｐＨ：８．０である。 （ｃ）ｐＨ安定性：３０℃、１時間保持の条件下でｐＨ
６．５〜１０．０において安定である。 - 【請求項３】下記の理化学的性質を更に有する、請求項
２に記載のプロテアーゼ。 （ｄ）至適作用温度：約４０℃である。 （ｅ）温度安定性：ｐＨ７、１時間保持の条件下で、３
０℃までの温度ではほとんど失活せず、４０℃で約４０
％失活し、５０℃、約１０分で完全に失活する。 （ｆ）酵素活性：２０℃において、最大活性の約５０％
以上の活性を有する。 - 【請求項４】酵素の活性中心がセリンである、請求項２
または３に記載のプロテアーゼ。 - 【請求項５】ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分子量が約７０ｋ
Ｄａである、請求項２〜４いずれか一項に記載のプロテ
アーゼ。 - 【請求項６】配列番号１に記載のアミノ酸配列の一部ま
たは全部を含んでなるタンパク質からなる、請求項１〜
５いずれか一項に記載のプロテアーゼ。 - 【請求項７】配列番号１に記載のアミノ酸配列の一部ま
たは全部をＮ末端に含んでなるタンパク質からなる、請
求項１〜５いずれか一項に記載のプロテアーゼ。 - 【請求項８】配列番号１に記載のアミノ酸配列の一部ま
たは全部を含んでなるタンパク質からなるプロテアー
ゼ。 - 【請求項９】配列番号１に記載のアミノ酸配列の一部ま
たは全部をＮ末端に含んでなるタンパク質からなるプロ
テアーゼ。 - 【請求項１０】請求項１〜９いずれか一項に記載のプロ
テアーゼを産生するFlavobacterium balustinum Ｐ１０
４（ＦＥＲＭ ＢＰ−５００６）を培養し、その培養物
から請求項１〜９いずれか一項に記載のプロテアーゼを
採取することを含んでなる、請求項１〜９いずれか一項
に記載のプロテアーゼの製造法。 - 【請求項１１】配列番号１に記載のアミノ酸配列の一部
または全部からなるペプチド。 - 【請求項１２】配列番号１に記載のアミノ酸配列の一部
または全部を含んでなるタンパク質。 - 【請求項１３】配列番号１に記載のアミノ酸配列の一部
または全部をそのＮ末端に含んでなる、タンパク質。
Priority Applications (8)
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|---|---|---|---|
| JP8012207A JPH09201195A (ja) | 1996-01-26 | 1996-01-26 | 低温活性プロテアーゼｃｐ７０ |
| EP97903957A EP0876500A4 (en) | 1996-01-26 | 1997-01-24 | COLD ACTIVE PROTEASE CP70 |
| CA002243598A CA2243598C (en) | 1996-01-26 | 1997-01-24 | Cold-active protease cp70 |
| US09/117,245 US6200793B1 (en) | 1996-01-26 | 1997-01-24 | Cold-active protease CP70 |
| BR9707203-6A BR9707203A (pt) | 1996-01-26 | 1997-01-24 | Protease cp70 ativa no frio |
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| CN 97193195 CN1214084A (zh) | 1996-01-26 | 1997-01-24 | 冷活性蛋白酶cp70 |
| ARP970100288A AR005541A1 (es) | 1996-01-26 | 1997-01-24 | Proteasa que es activa a temperatura ambiente y metodo para su preparacion |
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|---|---|---|---|
| JP8012207A JPH09201195A (ja) | 1996-01-26 | 1996-01-26 | 低温活性プロテアーゼｃｐ７０ |
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| JPH09201195A true JPH09201195A (ja) | 1997-08-05 |
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|---|---|---|---|
| JP8012207A Withdrawn JPH09201195A (ja) | 1996-01-26 | 1996-01-26 | 低温活性プロテアーゼｃｐ７０ |
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| JP (1) | JPH09201195A (ja) |
| CN (1) | CN1214084A (ja) |
| AR (1) | AR005541A1 (ja) |
| BR (1) | BR9707203A (ja) |
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| WO (1) | WO1997027313A1 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2019080493A (ja) * | 2017-10-27 | 2019-05-30 | プリマハム株式会社 | プロテアーゼ、洗浄剤組成物、洗浄方法、微生物 |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH09224666A (ja) * | 1996-02-16 | 1997-09-02 | Procter & Gamble Co:The | 低温活性プロテアーゼｃｐ５８および低温性細菌 |
| JP2000510345A (ja) * | 1997-11-14 | 2000-08-15 | ザ、プロクター、エンド、ギャンブル、カンパニー | Ｃｐ７０低温活性プロテアーゼをコードするポリヌクレオチド |
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| EP0871719A1 (en) * | 1995-02-17 | 1998-10-21 | The Procter & Gamble Company | Psychrophilic protease and psychrophilic bacteria |
| JP3592795B2 (ja) * | 1995-06-01 | 2004-11-24 | 花王株式会社 | 低温至適アルカリプロテアーゼ、これを生産する微生物及び当該アルカリプロテアーゼの製造法 |
-
1996
- 1996-01-26 JP JP8012207A patent/JPH09201195A/ja not_active Withdrawn
-
1997
- 1997-01-24 WO PCT/US1997/001148 patent/WO1997027313A1/en not_active Application Discontinuation
- 1997-01-24 CN CN 97193195 patent/CN1214084A/zh active Pending
- 1997-01-24 EP EP97903957A patent/EP0876500A4/en not_active Withdrawn
- 1997-01-24 AR ARP970100288A patent/AR005541A1/es unknown
- 1997-01-24 BR BR9707203-6A patent/BR9707203A/pt not_active IP Right Cessation
- 1997-01-24 CA CA002243598A patent/CA2243598C/en not_active Expired - Fee Related
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2019080493A (ja) * | 2017-10-27 | 2019-05-30 | プリマハム株式会社 | プロテアーゼ、洗浄剤組成物、洗浄方法、微生物 |
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