JPH08322563A - 低温至適アルカリプロテアーゼ、これを生産する微生物及び当該アルカリプロテアーゼの製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】 次の酵素学的性質を有する低温至適アルカリ
プロテアーゼ、これを生産する微生物及び当該アルカリ
プロテアーゼの製造法。 １）作用温度及び最適温度 ０〜５０℃で作用し、最適温度は約２０℃にある。Ｃａ
²⁺イオンが存在すると作用最適温度は４０℃に移行す
る。０℃（氷水中）でも約３５％の活性を保持する。 ２）温度安定性 pH９．０、１５分間の処理条件で２０℃まで安定であ
り、Ｃａ²⁺イオンが存在すると４０℃まで安定である。 ３）作用pH及び最適pH 作用pH範囲はpH５〜１１であり、最適pHは１０近傍にあ
る。 ４）pH安定性 ２０℃、１５分間の処理条件でpH６．３〜９．５までの
各pHで安定である。 【効果】 作用最適温度を低温領域に有し、種々の界面
活性剤によってもほとんど阻害を受けない。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、新規な低温至適アルカ
リプロテアーゼ、これを生産する微生物及び当該低温至
適アルカリプロテアーゼの製造法に関する。

【０００２】

【従来の技術】プロテアーゼは、ペプチド結合の加水分
解を触媒する酵素群の総称で、微生物、動物及び植物中
に広く分布している。その応用範囲としては、衣料用洗
剤、自動食器洗浄機用洗剤、コンタクトレンズ洗浄剤、
浴用剤、角質除去用化粧料、食品の改質剤（製パン、肉
の軟化、水産加工）、ビールの清澄剤、皮革なめし剤、
写真フィルムのゼラチン除去剤、消化助剤あるいは消炎
剤があり、多分野で盛んに利用されてきた。

【０００３】その中で最も大量に工業生産され、市場規
模が大きいのは洗剤用プロテアーゼであり、例えばアル
カラーゼ、サビナーゼ（ノボ・ノルディスク社製）、マ
クサカル（ギスト・ブロケイデス社製）、ＡＰＩ−２１
（昭和電工社製）、ブラップ（ヘンケル社製）及びプロ
テアーゼＫ（ＫＡＰ；花王社製）などが知られている。

【０００４】しかしながら、これらの大半は最適温度が
高温側にあるため、水道水をそのまま用いて低温領域で
衣料等の洗浄を行う場合には、その酵素特性が充分に発
揮されているとは言いがたい。また、前述のプロテアー
ゼは、その応用分野のほとんどにおいて、体温、室温又
は低温条件下で使用されるため、高温至適酵素の使用は
なじまない。加えて、高温至適酵素を用いて高温処理工
程を行うことは、省エネルギーの観点からも好ましいと
は言えない。一方、低温至適プロテアーゼは、反応系に
熱を加えられないようなケース、すなわちチーズの熟成
や肉の軟化等の食品の改質に有効であると思われる。

【０００５】近年、洗剤をはじめとしてプロテアーゼの
商品への配合や工業的プロセスなどにおける利用が考え
られているが、この場合、室温から低温領域で有効に作
用する酵素を見出すことは、省エネルギー化に加えて酵
素の機能を十分発揮させるうえで、必須の条件である。
これまでに、寒冷地土壌等の寒冷環境に棲息する生物、
海水あるいは冷蔵中のミルク等から分離されたプロテア
ーゼ生産菌及び生産されるプロテアーゼに関しては数多
くの報告例がある。すなわち、シュードモナスエスピー
（Pseudomonas sp.）Ｎｏ．５４８株（Agric. Biol. Ch
em.,３６巻，１１８５頁、１９７０年）、エシェリヒア
フロインディ（Eschreichia freundii）（Eur. J. Bi
ochem., ４４巻，８７頁，１９７４年）、キサントモナ
スマルトフィラ（Xanthomonas maltophila）０４７／０
８株（FEMS Microbiol. Lett., ７９巻，２５７頁，１
９９１年）、シュードモナス フルオレセンス（Pseudo
monas fluorescens）Ｔ１６が（Appl. Environ. Microb
iol.,４６巻，３３３頁，１９８３年）、シュードモナ
ス フルオレセンス（Pseudomonas fluorescens）ＡＦ
Ｔ３６株（Biochim. Biophys. Acta, ７１７巻，３７６
頁，１９８２年）、シュードモナス エスピー（Pseudo
monas sp.）１４５−２株（Microbios.,３６巻，７頁，
１９８２年）、アエロモナス サルモニシダ（Aeromona
s salmonicida）（J. Appl. Bacteriol., ５３巻，２８
９頁，１９８３年）、シュードモナス パウシモビリス
（Pseudomonas paucinomobilis）、バチルス エスピー
（Bacillus sp.）（J. Basic Microbiol., ３１巻，３
７７頁，１９９１年）、ビブリオ エスピー（Vibrio s
p.）ＳＡ １株（Antonie van Leeuwenhoek,４４巻，１
５７頁，１９７８年）、シュードモナス フルオレセン
ス（Pseudomonas fluorescens）ＮＣＤＯ ２０８５株
（J. Dairy Res., ５３巻，４５７頁，１９８６年）、
シュードモナス フルオレセンス（Pseudomonas fluore
scens）（J. Dairy Res.,５３巻，９７頁，１９８６
年）、シュードモナス フルオレセンス（Pseudomonas
fluorescens）ＧＲ８３株（Lebensm.-Wiss. u.-Techno
l., ２３巻，１０６頁，１９９０年）、ペシロミセス
マルクアンディ（Paecilomyces mairuandii）（ＷＯ
８８／０３９４８）及びキサントモナス エスピー（Xa
nthomonas sp.）Ｓ−１（特開平５−２１１８６８号）
等などの低温で生育できる微生物が種々のプロテアーゼ
を生産する。また、好冷細菌（psychrotroph）が生産す
るプロテアーゼに関しては、Fairbainらが要領よく総説
にまとめている（J. Dairy Res., ５３巻，１３９頁，
１９８６年）。しかしこれらのプロテアーゼについて
も、低温域における作用は、必ずしも満足できるもので
はない。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】従って、本発明の目的
は、低温条件下においても高い活性を保持するプロテア
ーゼ及びこれを生産する微生物を提供するものである。

【０００７】

【課題を解決するための手段】そこで本発明者らは、斯
かる問題点を解決するため、低温領域において充分作用
するプロテアーゼを自然界に求め、探索してきた。その
結果、北洋に生息するタラの腸から、１０℃という低温
条件下においても良好な生育を示す細菌を分離し、これ
らの中で菌体外に、低温領域においても活性を有するプ
ロテアーゼを分泌する微生物を見出し、更に得られたプ
ロテアーゼは低温領域で優れた活性を有するだけでな
く、アルカリ側に至適pHを有するものであることを見出
し、本発明を完成した。

【０００８】すなわち、本発明は、次の酵素学的性質を
有する低温至適アルカリプロテアーゼ、これを生産する
微生物及び当該アルカリプロテアーゼの製造法を提供す
るものである。

【０００９】１）作用温度及び最適温度 ０〜５０℃で作用し、最適温度は約２０℃にある。Ｃａ
²⁺イオンが存在すると作用最適温度は４０℃に移行す
る。０℃（氷水中）でも最適温度活性値の約３５％の活
性を保持する。 ２）温度安定性 pH９．０、１５分間の処理条件で２０℃まで安定であ
り、Ｃａ²⁺イオンが存在すると４０℃まで安定である。 ３）作用pH及び最適pH 作用pH範囲は５〜１１であり、最適pHは１０近傍にあ
る。 ４）pH安定性 ２０℃、１５分間の処理条件でpH６．３〜９．５までの
各pHで安定である。 ５）分子量 ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）−ポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動法による推定分子量は、３１，０００±
１，０００である。 ６）基質特異性 天然基質であるカゼイン、ジメチルカゼイン、アゾカゼ
イン、ヘモグロビン、尿素変性ヘモグロビン、ケラチ
ン、コラーゲン及びアゾアルブミンに対して作用する。 ７）金属イオンの影響 ＣＯ²⁺、Ｃｕ²⁺、Ｚｎ²⁺及びＨｇ²⁺イオンによって若干
阻害される。 ８）阻害剤 ＥＤＴＡ、ｏ−フェナントロリンによって強く阻害を受
け、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）によって阻害を受け
る。フェニルメタンスルフォニルフルオライド（ＰＭＳ
Ｆ）、キモスタチン、ｐ−クロロマーキュリー安息香酸
（ＰＣＭＢ）、Ｎ−エチルマレイミド（ＮＥＭ）及び
５，５′−ジチオ−ビス（２−ニトロ安息香酸）（ＤＴ
ＮＢ）によって阻害を受けない。 ９）界面活性剤の影響 アルカン硫酸ナトリウム（ＳＡＳ）、α−オレフィン硫
酸ナトリウム（ＡＯＳ）、ポリオキシエチレンアルキル
硫酸ナトリウム（ＥＳ）、ソフタノール７０Ｈ、α−ス
ルホ脂肪酸エステル（α−ＳＦＥ）及びドデシル硫酸ナ
トリウム（ＳＤＳ）に対して極めて安定である。

【００１０】本発明の低温至適アルカリプロテアーゼ
は、例えばフラボバクテリウム（Flavobacterium）属に
属するプロテアーゼ生産菌を培養し、その培養物から採
取することにより製造することができる。

【００１１】かかるフラボバクテリウム属に属する本発
明プロテアーゼ生産菌としては、フラボバクテリウム属
に属し、上記の本発明プロテアーゼを生産する限り特に
制限されないが、例えば次の分類学的性質を示すＫＳＭ
−Ｎ４３株が挙げられる。本発明のプロテアーゼ生産菌
の分類に用いられる培地を以下に示す。

【００１２】使用培地の組成（重量％で表示） 培地１． ニュートリエントブロス，０．８；寒天末
（和光純薬社製），１．５ 培地２． ニュートリエントブロス，０．８ 培地３． ニュートリエントブロス，０．８；ゼラチ
ン，２．０；寒天末（和光純薬社製），１．５ 培地４． バクトリトマスミルク，１０．５ 培地５． ニュートリエントブロス，０．８；ＫＮ
Ｏ₃，０．１ 培地６． バクトペプトン，０．７；ＮａＣｌ，０．
５；ブドウ糖，０．５ 培地７． ＳＩＭ寒天培地（栄研化学社製），指示量 培地８． ＴＳＩ寒天培地（栄研化学社製），指示量 培地９． バクトペプトン，１．５；酵母エキス，０．
５；可溶性澱粉，２．０；Ｋ₂ＨＰＯ₄，０．１；ＭｇＳ
Ｏ₄・７Ｈ₂Ｏ，０．０２；寒天末（和光純薬社製），
１．５ 培地１０．Ｋｏｓｅｒの培地（栄研化学社製）、指示量 培地１１．Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎの培地（栄研化学社
製）、指示量 培地１２． （１）酵母エキス，０．０５；ブドウ糖，１．０；ＫＨ
₂ＰＯ₄，０．１；Ｎａ₂ＳＯ₄，０．１ （２）酵母エキス，０．０５；ブドウ糖，１．０；ＫＨ
₂ＰＯ₄，０．１；ＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ，０．０２；Ｃａ
Ｃｌ₂・２Ｈ₂Ｏ，０．０５；ＦｅＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ，０．
００１；ＭｎＳＯ₄・４−６Ｈ₂Ｏ，０．００１；窒素源
としては、硝酸ナトリウム、亜硝酸ナトリウム、塩化ア
ンモニウム及びリン酸アンモニウムを各々０．２５，
０．２，０．１６，０．２％となるように、上記（１）
及び（２）の培地に加えて用いた。 培地１３．キングＡ培地“栄研”（栄研化学社製），指
示量 培地１４．キングＢ培地“栄研”（栄研化学社製），指
示量 培地１５．尿素培地“栄研”（栄研化学社製），指示量 培地１６．チトクロム・オキシダーゼ試験紙濾紙（日水
製薬社製） 培地１７．３％過酸化水素水 培地１８．バクトペプトン，１．５；酵母エキス，０．
５；ＫＨ₂ＰＯ₄，０．１；ブドウ糖，１．０；ＭｇＳＯ
₄・７Ｈ₂Ｏ，０．０２ 培地１９．バクトペプトン，２．７；ＮａＣｌ，５．
５；ブドウ糖，０．５；Ｋ₂ＨＰＯ₄，０．１；ブロムチ
モールブルー，０．０６；寒天末，（和光純薬社製），
１．５ 培地２０．（ＮＨ₄）₂ＨＰＯ₄，０．１；ＫＣｌ，０．
０２；ＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ，０．０２；酵母エキス，
０．０５；糖１．０ 培地２１．カゼイン，０．５；酵母エキス，０．０５；
ブドウ糖，１．０；ＫＨ₂ＰＯ₄，０．１；ＭｇＳＯ₄・
７Ｈ₂Ｏ，０．０２；寒天末，（和光純薬社製），１．
５

【００１３】ＫＳＭ−Ｎ４３株の分類学的性質を以下に
示す。

【００１４】〔分類学的性質〕 （ａ）顕微鏡的観察結果：菌体の大きさは、０．５〜
０．６μｍ×１．０×３．０μｍの桿菌であり、運動性
はない。 （ｂ）グラム染色性：陰性。 （ｃ）各種培地における生育状態： （１）肉汁寒天平板培養（培地１）；生育状態は良い。
集落の周縁は葉状あるいは樹根状である。また、集落の
色調は、黄色である。 （２）肉汁寒天斜面培養（培地１）；生育する。 （３）肉汁液体培養（培地２）；生育は良好。 （４）肉汁ゼラチン穿刺培養（培地３）；生育状態は良
い。ゼラチンの液化が認められる。 （５）リトマスミルク培地（培地４）；液化が認められ
る。 （ｄ）生理学的性質 （１）硝酸塩の還元及び脱窒反応（培地５）；硝酸塩の
還元及び脱窒反応は陰性。 （２）ＭＲテスト（培地６）；陰性。 （３）ＶＰテスト（培地６）；陰性。 （４）インドールの生成（培地７）；陽性。 （５）硫化水素の生成（培地８）；陰性。 （６）澱粉の加水分解（培地９）；陰性。 （７）クエン酸の利用（培地１０、１１）；陰性。 （８）無機窒素源の利用（培地１２）；硝酸塩及びアン
モニウム塩の利用は認められない。 （９）色素の生成（培地１３、１４）；淡黄色あるいは
淡茶色の色素を産生する。 （10）ウレアーゼ（培地１５）；陰性。 （11）オキシダーゼ（培地１６）；陽性。 （12）カタラーゼ（培地１７）；陽性。 （13）生育の範囲（培地１８）；生育の温度範囲は２〜
３５℃である。生育のpH範囲は６〜１２である。 （14）酸素に対する態度（培地１９）；好気的。 （15）Ｏ−Ｆテスト（培地２０）；酸化型。 （16）糖の利用性；Ｄ−ガラクトース、シュクロース、
Ｄ−グルコース、Ｄ−フラクトース、マルトース、Ｄ−
マンノース、ラフィノース、トレハロース、グリセリ
ン、メリビオース及び可溶性澱粉を利用することができ
る。 （17）食塩含有培地における生育（培地１中）；食塩濃
度５％では生育できない。 （18）カゼインの分解（培地２１）；陽性。

【００１５】以上の分類学的性質に関する検討に基づ
き、バージーズ・マニュアル・オブ・システマティク・
バクテリオロジー（Bergey's Mannual of Systematic B
acteriology）第８版を参照し、比較検討した結果、本
菌株は、低温で生育可能なフラボバクテリウム属に近縁
な新種と判断された。

【００１６】従って、本菌株をフラボバクテリウム エ
スピー（Flavobacterium sp.）ＫＳＭ−Ｎ４３と命名
し、生命工学ＦＥＲＭ Ｐ−１４８６２号として工業技
術院生命工学工業技術研究所に寄託した。

【００１７】上記の菌株を用いて、本発明のプロテアー
ゼを得るには、培地に菌株を接種し、常法に従って培養
すればよい。

【００１８】培養に用いる培地中には、資化しうる炭素
源及び窒素源を適当量含有せしめておくことが望まし
い。この炭素源及び窒素源は特に制限されないが、例え
ば炭素源として可溶性澱粉、ブルコース、マンノース、
ガラクトース、フラクトース、シュクロース、マルトー
ス、ラフィノース、トレハロース、グリセリン、メリビ
オース及び可溶性澱粉を利用や資化しうる有機酸、例え
ばクエン酸などが挙げられる。また、窒素源としては、
コーングルテンミール、大豆粉、コーンスティプリカ
ー、カザミノ酸、酵母エキス、フーマメディア、肉エキ
ス、トリプトン、ソイトン、ポリペプトン、ソイビーン
ミール、綿実油粕やカルチベータなどの有機窒素源が有
効である。更に、燐酸塩、マグネシウム塩、カルシウム
塩、マンガン塩、亜鉛塩、コバルト塩、ナトリウム塩及
びカリウム塩等の無機塩や、必要に応じて、無機又は有
機微量栄養素やビタミン類を培地中に適宜添加すること
ができる。

【００１９】培養温度は２〜３５℃、特に２５〜３０℃
が好ましく、pHは６〜１２特に８〜１０が好ましく、こ
の条件下において通常３〜５日間で培養が完了する。

【００２０】斯くして得られた培養液の中から目的の酵
素であるアルカリプロテアーゼの採取は、一般の酵素採
取の手段に準じて行うことができる。すなわち、培養後
遠心分離又は濾過等の通常の分離手段により菌体を培養
液から除去して粗酵素液を得る。この粗酵素液はそのま
ま使用することもできるが、必要に応じて、限外濾過あ
るいは沈澱法等の手段により回収し、適当な方法を用い
て粉末化して用いることもできる。また、酵素精製の一
般的な手段、例えば、適当な陽イオン交換樹脂、陰イオ
ン交換樹脂、ヒドロキシアパタイトによるクロマトグラ
フィー、アフィニティークロマトグラフィー、疎水クロ
マトグラフィー及びゲル濾過などを適宜組み合せること
によって精製することもできる。

【００２１】斯くして得られる本発明低温アルカリプロ
テアーゼの酵素化学的性質について以下に説明する。

【００２２】〔酵素活性測定法〕カゼイン１％を含む５
０mMの各種緩衝液１mlを０．１mlの酵素溶液と混合し、
２０℃、１５分間反応させた後、反応停止液（０．１１
Ｍ トリクロロ酢酸−０．２２Ｍ 酢酸ナトリウム−
０．３３Ｍ 酢酸）２mlを加え、３０℃、２０分間放置
した。次に濾紙（ワットマン社製、Ｎｏ．２）で濾過
し、濾液中の蛋白分解物をフォーリン・ローリー法（Lo
wry, O. H. et al., J. Biol. Chem., １９３巻，２６
５頁，１９５１年）によって測定した。また、上記反応
条件下において、１分間に１μmolのチロシンに相当す
る酸可溶性蛋白分解物を生成する酵素量を１単位（１
Ｕ）とした。

【００２３】〔酵素学的性質〕 （１）基質特異性：５０mM ホウ酸緩衝液（pH９．０）
に各種蛋白質を０．１％又は１％になるように加えた
後、精製酵素を適当量添加して２０℃で１５分間反応を
行った。カゼインを基質とした場合の分解活性を１００
として、それぞれの基質に対する分解活性を表１に示
す。

【００２４】

【表１】

【００２５】表１から、本酵素は、天然基質であるカゼ
インに加え、ジメチルカゼイン、アゾカゼイン、ヘモグ
ロビン、尿素変性ヘモグロビン、ケラチン、コラーゲン
及びアゾアルブミン、ゼラチンに対して作用するが、リ
ボヌクレアーゼ及びアルブミンには作用しなかった。

【００２６】また、ｐ−ニトロアニリン（ｐＮＡ）が結
合した合成オリゴペプチド基質を用いて、これらの分解
活性を調べた。しかし、Ｎ−スクシニル化したAla-Ala-
Pro-Phe-pNA、Ala-Ala-Pro-Met-pNA、Ala-Ala-Ala-pN
A、Phe-Pro-Phe-pNA、Ala-Ala-pNA、Ala-pNAやＮ−カル
ボベンゾイル化したAla-Ala-Leu-pNAやGly-Gly-Leu-pNA
等の合成基質からのｐ−ニトロアニリンの遊離は認めら
れなかった。

【００２７】（２）作用pH及び最適pH：ブリットン・ロ
ビンソン広域緩衝液（５０mM）中に最終濃度０．９１％
となるようにカゼインを加え、２０℃で１５分間反応を
行い、各pHでの活性を測定した。図１から明らかなよう
に、本プロテアーゼの最適pHは１０付近に認められる。
また、その作用pHは、pH５〜１１と幅広いことがわか
る。

【００２８】（３）pH安定性：（１）で用いたと同じ緩
衝液（５mM，各pH）中に本酵素を加え、２０℃で１５分
間放置し、カゼインを基質とし、残存活性をpH９，２０
℃で測定した。その結果、図２に示すとおり、本酵素は
pH６．３〜９．５の広い範囲で安定であった。

【００２９】（４）作用温度及び最適温度：基質として
０．９１％のカゼインを含む５０mMホウ酸緩衝液（pH
９．０）に本酵素を加え、１５分間各温度で反応を行っ
た。図３から明らかなように、本酵素の最適温度は２０
℃であった。また、Ｃａ²⁺イオンが存在すると、至適温
度は約４０℃に移行し、Ｃａ²⁺イオン非存在下の最適温
度に比べ、約２倍の活性促進が認められた。特徴的なこ
とに本酵素は０℃（氷水中）でも最適温度の活性の約３
５％の活性を示し、低温条件下でも充分作用することが
わかる。

【００３０】（５）温度安定性：５０mM ホウ酸緩衝液
（pH９．０）に本酵素を加え、各温度で１５分間熱処理
した後氷冷した。カゼインを基質として、２０℃で残存
活性を求め、その結果を図４に示した。本酵素はＣａ²⁺
イオン非存在下で２０℃、Ｃａ²⁺イオンの存在下で４０
℃まで安定であることがわかる。

【００３１】（６）分子量：本酵素の分子量をＳＤＳ−
ポリアクリルアミドゲル電気泳動法により測定した。分
子量マーカーには、低分子用マーカーキット（ファルマ
シア社製）のホスホリラーゼｂ（分子量：９４，００
０）、牛血清アルブミン（分子量：６７，０００）、卵
白オブアルブミン（分子量：４３，０００）、カルボニ
ックアンヒドラーゼ（分子量：３０，０００）、大豆ト
リプシンインヒビター（分子量：２０，１００）、γ−
ラクトアルブミン（分子量：１４，４００）を用いた。
図５から明らかなように、本精製プロテアーゼ標品は電
気泳動的に均一であり、その分子量は３１，０００±
１，０００と推定される。

【００３２】（７）等電点：等電点電気泳動法により、
本プロテアーゼの等電点を求めた。アクリルアミドゲル
（６．０％）のpH勾配は、両性電界質であるファーマラ
イト（Pharmalyte,pH３〜１０；ファルマシア社製）を
使用した。その結果、本プロテアーゼの等電点はpH９．
７近傍にあることが判明した。

【００３３】（８）金属イオンの影響：各種金属塩を１
mMになるように添加した２０mM ホウ酸緩衝液（pH９．
０）に本酵素溶液を添加し、２０℃で２０分間放置し
た。その後、５０mM ホウ酸緩衝液（pH９．０）で適当
希釈を行い、残存活性を測定した。金属塩無添加系で同
様に処理した酵素活性を１００％として処理群の残存活
性を求めた。結果を表２に示す。

【００３４】

【表２】

【００３５】表２から、本酵素活性は、ＣＯ²⁺、Ｃ
ｕ²⁺、Ｚｎ²⁺やＨｇ²⁺イオンに若干の阻害作用が認めら
れる。

【００３６】（９）阻害剤の影響：２０mM リン酸緩衝
液（pH７．０に各種阻害剤を所定濃度になるように加
え、本酵素を添加し、２０℃で２０分間放置した後、残
存活性を測定した。結果を表３に示す。

【００３７】

【表３】

【００３８】表３から、キレート剤であるＥＤＴＡとＥ
ＧＴＡによって強く阻害され、ＰＭＳＦなどのセリン酵
素阻害剤で全く影響を受けないので金属プロテアーゼ
（metalloprotease）であると考えられる。

【００３９】（10）界面活性剤の影響：本酵素を、０．
２％の界面活性剤を含有する５０mM ホウ酸緩衝液（pH
９．０）に加えて、２０℃で２０分間放置した後、残存
活性を測定した。結果を表４に示す。

【００４０】

【表４】

【００４１】表４から、本酵素はＳＤＳ、ＡＯＳ、ＳＡ
Ｓ、α−ＳＦＥ、ソフタノール７０ＨやＬＡＳ（それぞ
れ０．２％濃度）などの界面活性剤と長時間接触させて
もほとんど失活せず、強力な界面活性剤耐性を有してい
ることがわかる。

【００４２】前述したように、低温至適を有するプロテ
アーゼに関しては数多くの報告があり、その中には金属
プロテアーゼに関する報告もある。しかし、低温至適、
高アルカリ至適を示し、界面活性剤に対して安定なプロ
テアーゼについての報告はないことから、本酵素は新規
な酵素であると考えられる。

【００４３】

【発明の効果】本発明のアルカリプロテアーゼは、作用
最適温度を低温領域に有し、前述の界面活性剤によって
もほとんど阻害を受けず、また、酸性から高アルカリ溶
液中に幅広く安定である。従って、本酵素は洗浄剤組成
物の配合成分として、低温下で有利に使用できるもので
ある。また、低温条件下における、食肉の軟化あるいは
チーズの熟成といった食品の改質にも有効である。

【００４４】

【実施例】以下に実施例を挙げて本発明を更に説明する
が、本発明はこれらの実施例に限定されるものではな
い。

【００４５】実施例１ 北洋に生息するタラの腸を滅菌人工海水（ジャマリン・
ラボラトリー社製）２０mlに入れ、ホモゲナイザーで粉
砕した。得られた懸濁液を、以下に示した組成を有する
人工海水平板培地に塗抹し、２０℃で５〜７日間培養し
た。

【００４６】

【表５】 人工海水平板培地（pH７．６） バクトペプトン（ディフコ社製） ２．５ｇ 酵母エキス（ディフコ社製） １．２５ｇ 肉エキス（ディフコ社製） １．２５ｇ スキムミルク（ディフコ社製）（別滅菌） １０ｇ グルコース ０．５ｇ 寒天 ２０ｇ 人工海水 １０００ml

【００４７】生育した集落の周囲にスキムミルクの分解
によって生じた透明帯を指標としてプロテアーゼ生産菌
を分離した。得られた分離株の中から、低温至適プロテ
アーゼ生産性を調べ、フラボバクテリウム エスピー
ＫＳＭ−Ｎ４３株を選抜した。

【００４８】実施例２ 実施例１で得られたフラボバクテリウム エスピー Ｋ
ＳＭ−Ｎ４３株を以下に示した液体培地で好気的に２０
℃、２日間培養した。

【００４９】

【表６】 液体培地（pH９．０） ポリペプトンＳ ２．５ｇ 酵母エキス １．２５ｇ ＫＨ₂ＰＯ₄ １．２５ｇ ＭｇＳＯ₄ ０．２ｇ グルコース ５ｇ 炭酸ナトリウム ２ｇ イオン交換水 １０００ml

【００５０】培養後、遠心分離（１２，０００×ｇ，２
０分間）して得られた上清液を１０mM トリス−塩酸緩
衝液（pH７．５；２mM ＣａＣｌ₂含有）で５℃、一昼
夜透析した。透析内液のプロテアーゼ活性を、カゼイン
を基質として２０℃で測定したところ（５０mMホウ酸緩
衝液中，pH９．０）、０．６〜１．１Ｕ／ｌ培養液に相
当するプロテアーゼの生産が認められた。

【００５１】実施例３ フラボバクテリウム エスピー ＫＳＭ−Ｎ４３株を実
施例２の液体培地に接種し、２０℃で４０時間培養し
た。培養後、遠心分離して得られた上清液を限外濾過膜
（分画分子量３，０００；アミコン社製）で濃縮した。
この濃縮液を２０mM トリス−塩酸緩衝液（pH８．０；
２mM ＣａＣｌ₂含有）に対し５℃で一昼夜透析した。
この透析内液を２０mM トリス−塩酸緩衝液（pH８．
０；２mM ＣＡＣｌ₂含有）で平衡化したＤＥＡＥ−バ
イオゲルＡ（バイオラッド社製）のカラムを通過させ、
その非吸着画分をプールした。再度、ＤＥＡＥ−バイオ
ゲルＡのカラムを通過させて非吸着画分を限外濃縮し
た。この濃縮液を２０mM トリス−塩酸緩衝液（pH８．
０；２mM ＣａＣｌ₂含有）で平衡化したＣＭ−バイオ
ゲルＡ（バイオラッド社製）のカラムに添着した後、０
〜０．１２５mM 塩化カリウム濃度勾配溶出を行った
（pH８．０；２mM ＣａＣｌ₂含有）。本発明の低温至
適プロテアーゼは非吸着画分の溶出領域から若干遅れて
分画された。活性画分を限外濾過膜上で約１．０mlまで
濃縮した後、平衡化したセファクリル Ｓ−２００スー
パーファイン（ファルマシア社製）のカラムでゲルクロ
マトグラフィーを行った。得られた活性画分を最終精製
酵素標品として使用した。この結果、約６．８倍まで精
製され（回収率７％）、本精製標品は約５４Ｕ／mg蛋白
質（仔牛血清アルブミン単位）の比活性を有していた。

【図面の簡単な説明】

【図１】バチルス エスピー ＫＳＭ−Ｎ４３株のプロ
テアーゼのpH−活性曲線を示す図である。

【図２】フラボバクテリウム エスピー ＫＳＭ−Ｎ４
３株のプロテアーゼのpH安定性を示す図である。

【図３】フラボバクテリウム エスピー ＫＳＭ−Ｎ４
３株のプロテアーゼの温度−活性曲線を示す図である。

【図４】フラボバクテリウム エスピー ＫＳＭ−Ｎ４
３株のプロテアーゼの温度安定性を示す図である。

【図５】フラボバクテリウム エスピー ＫＳＭ−Ｎ４
３株のプロテアーゼの分子量測定結果を示す図であり、
（ａ）は分子量とＳＤＳ電気泳動距離の相関を示す図、
（ｂ）は完全精製標品のＳＤＳ電気泳動写真（１２％ア
クリルアミドゲル）を示す図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 (Ｃ１２Ｎ 1/20 Ｃ１２Ｒ 1:20） (72)発明者 太田 康彦 栃木県芳賀郡市貝町赤羽2606 花王株式会 社研究所内 (72)発明者 藤森 尚子 栃木県芳賀郡市貝町赤羽2606 花王株式会 社研究所内 (72)発明者 小林 徹 栃木県芳賀郡市貝町赤羽2606 花王株式会 社研究所内 (72)発明者 伊藤 進 栃木県芳賀郡市貝町赤羽2606 花王株式会 社研究所内

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 次の酵素学的性質を有する低温至適アル
   カリプロテアーゼ。 １）作用温度及び最適温度 ０〜５０℃で作用し、最適温度は約２０℃にある。Ｃａ
   ²⁺イオンが存在すると作用最適温度は４０℃に移行す
   る。０℃（氷水中）でも最適温度活性値の約３５％の活
   性を保持する。 ２）温度安定性 pH９．０、１５分間の処理条件で２０℃まで安定であ
   り、Ｃａ²⁺イオンが存在すると４０℃まで安定である。 ３）作用pH及び最適pH 作用pH範囲は５〜１１であり、最適pHは１０近傍にあ
   る。 ４）pH安定性 ２０℃、１５分間の処理条件でpH６．３〜９．５までの
   各pHで安定である。 ５）分子量 ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）−ポリアクリルアミ
   ドゲル電気泳動法による推定分子量は、３１，０００±
   １，０００である。 ６）基質特異性 天然基質であるカゼイン、ジメチルカゼイン、アゾカゼ
   イン、ヘモグロビン、尿素変性ヘモグロビン、ケラチ
   ン、コラーゲン及びアゾアルブミンに対して作用する。 ７）金属イオンの影響 ＣＯ²⁺、Ｃｕ²⁺、Ｚｎ²⁺及びＨｇ²⁺イオンによって若干
   阻害される。 ８）阻害剤 ＥＤＴＡ、ｏ−フェナントロリンによって強く阻害を受
   け、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）によって阻害を受け
   る。フェニルメタンスルホニルフルオライド（ＰＭＳ
   Ｆ）、キモスタチン、ｐ−クロロマーキュリー安息香酸
   （ＰＣＭＢ）、Ｎ−エチルマレイミド（ＮＥＭ）及び
   ５，５′−ジチオ−ビス（２−ニトロ安息香酸）（ＤＴ
   ＮＢ）によって阻害を受けない。 ９）界面活性剤の影響 アルカン硫酸ナトリウム（ＳＡＳ）、α−オレフィン硫
   酸ナトリウム（ＡＯＳ）、ポリオキシエチレンアルキル
   硫酸ナトリウム（ＥＳ）、ソフタノール７０Ｈ、α−ス
   ルホ脂肪酸エステル（α−ＳＦＥ）及びドデシル硫酸ナ
   トリウム（ＳＤＳ）に対して極めて安定である。
2. 【請求項２】 フラボバクテリウム属に属し，請求項１
   記載の低温至適プロテアーゼを生産する微生物。
3. 【請求項３】 フラボバクテリウム エスピー（Flavob
   acterium sp.）ＫＳＭ−Ｎ４３と命名され、ＦＥＲＭ
   Ｐ−１４８６２号として寄託された請求項２記載の微生
   物。
4. 【請求項４】 請求項２記載の微生物を培養し、その培
   養物から該当低温至適アルカリプロテアーゼを採取する
   ことを特徴とする請求項１記載のプロテアーゼの製造
   法。