KR19990075377A - 신규한 호염성 단백질 분해효소 및 그를 생산하는 미생물 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 신규한 호염성의 단백질 분해효소 및 그를 생산하는 미생물에관한 것이다. 좀 더 구체적으로, 본 발명은 고염도의 조건에서도 안정하며 높은활성을 유지하는 호염성의 단백질 분해효소(halophilic protease) 및 그를 생산하는 미생물에 관한 것이다. 본 발명은 단백질 분해효소를 생산하는 신규한 미생물 할로모나스(Halomonas sp.) YU-1029 및 그로부터 생산되는 신규한 단백질 분해효소를 제공한다. 본 발명의 단백질 분해효소는 고염의 환경에서도 높은 활성을 유지함으로써 우리나라의 전통 장류 및 젓갈과 같은 고염도 식품의 숙성시 단시간에 아미노산을 생성, 숙성 기간을 단축하는 것
Description
본 발명은 신규한 호염성 단백질 분해효소 및 그를 생산하는 미생물에 관한 것이다. 좀 더 구체적으로는, 본 발명은 장류 및 젓갈과 같은 고염의 조건에서 효과적으로 단백질을 분해하여 숙성을 증진시키는 호염성 단백질 분해효소(halophilic protease) 및 그를 생산하는 미생물에 관한 것이다.
호염성 미생물(halophile)이란 생장하는데 염분을 필요로 하는 미생물로 고염분의 환경에서 존재하는 극한성 미생물이다. 이러한 호염성 미생물은 효소나 체외 형성 다당류의 생산, 제약업계에 있어서 새로운 생리 활성 물질의 개발, 그리고 미생물에 의한 3차적 원유의 획득 과정 등의 측면에서 산업적인 가치를 가진다. 효소 생산의 측면에서 중호염성 미생물인 할로박테리움 할로비우스(Halobacterium halobius)에 의해 생산된 아밀라아제(amylase)가 최초로 연구된 이래로 프로테아제(protease), 셀룰라아제(cellulase), 덱스트라나아제(dextranase),리파아제(lipase) 등 다양한 체외 분비효소의 생산이 보고되었고, 호염성 세균으로부터 할로신(halocin)이라는 항생물질이 발견되어 향우 신물질 탐색대상으로서의 호염성 및 내염성 균주들의 활용이 기대되고 있다. 뿐만 아니라 호염성 세균의 유전 정보에 대한 연구가 발달한다면 이를 식물에 적용, 농작물의 내염도를 증가시키고 그 결과 해수를 관개 용수로 이용할 수 있을 것이며, 고염의 폐수를 처리하는 데에도 활용하는 등, 농업과 환경 분야에서도 호염성 미생물의 다양한 활용이 연구되고 있다.
이와 같이 호염성 미생물은 다양한 분야에 응용이 가능함에도 불구하고 충분한 연구가 진행되지 못하고 있다. 특히, 호염성 단백질의 경우, 저염도에서의 불안정성 때문에 전통적으로 사용되어지는 대부분의 정제 방법이 부적절하여 정제 방법의 선택이 극히 제한적이다. 이러한 이유로 최근까지 호염성의 단백질 분해효소가 순수 분리, 정제된 경우는 매우 드물다. 호염성 단백질 분해효소의 연구가치는 특별히 고염도 식품에의 응용에서 찾아 볼 수 있다. 우리 나라의 전통 고염도 발효 식품인 젓갈류와 장류의 독특한 풍미는 숙성과정 중에 단백질 분해효소의 작용에 의해 단백질로부터 생성되는 아미노산과, 제조 과정 중에 첨가되는 식염의 조화로 이루어진다. 이들 발효식품은 상온에서의 장기 유통을 위해 약 15내지 18%의 식염 농도를 요구하는데, 기존에 장류에서 보고된 균주들은 이러한 식염농도에서 활성이 급격하게 감소되며 생육도 어려워 개선을 필요로 하고 있다. 전통적으로 고염의 식품을 많이 이용하는 우리나라의 식생활을 고려해 볼 때,호염성 및 내염성 미생물은 우리 나라의 식품 분야에서 더욱 많은 이용 가치를가질 것으로 예상되어지므로 앞으로 더욱 많은 연구가 진행되어져야한다.
본 발명자들은 지금까지 알려진 단백질 분해효소와는 물리·화학적인 면에서 현저히 다른, 새로운 호염성의 단백질 분해효소를 생산하는 미생물을 젓갈로부터 분리하여 할로모나스(Halomonas sp.) YU-1029로 동정하고 균주의 성질 및 효소의 특성을 검토한 결과, 기존의 생산 균주와 달리 고염의 농도에서도 높은 활성을 나타내는 특성을 갖고 있음을 발견하고, 본 발명을 완성하게 되었다.
결국, 본 발명의 주된 목적은 고염의 조건에서도 높은 활성을 유지하여 젓갈 및 장류의 숙성을 개선하는 신규한 단백질 분해효소 및 전기 효소를 생산하는 신규한 미생물을 제공하는 것이다.
제 1(A) 내지 1(B)도는 본 발명의 균주와 바실러스 섭틸리스(Bacillus subtilis)의 생육 및 단백질 분해효소 생산에 미치는 NaC1 농도의 영향을 나타낸 그래프이다.
제 2(A) 내지 2(B)도는 본 발명의 균주와 바실러스 섭틸리스(Bacillus subtilis)를 이용하여 대두와 대두박을 발효시킨 경우에 아미노산의 생산을 나타낸 그래프이다.
제 3도는 본 발명의 균주 배양시간에 따른 효소 생산을 나타낸 그래프다.
제 4도는 본 발명에서 분리된 단백질 분해효소의 SDS-폴리아크릴아마이드젤 드 전기영동(SDS-polyacrylamide gel electrophoresis) 사진이다.
제 5(A) 내지 5(B)도는 본 발명에서 분리된 단백질 분해효소의 활성에 미치는 NaC1의 영향을 나타내는 그래프이다.
제 6도는 본 발명에서 분리된 단백질 분해효소의 활성과 안정성에 미치는 pH의 영향을 나타내는 그래프이다.
제 7도는 본 발명에서 분리된 단백질 분해효소의 활성과 안정성에 미치는 온도의 영향을 나타내는 그래프이다.
제 8도는 본 발명에서 분리된 단백질 분해효소의 활성에 미치는 에틸렌다이아민테트라아세트 산(EDTA : ethylenediaminetetraacetic acid)의 농도의 영향을 나타낸 그래프이다.
본 발명자들은 젓갈로부터 단백질 분해효소 활성이 있는 호염성 균주를 선택하기 위해서 15%의 NaC1과 기질인 스킴밀크(skim milk)가 첨가된 한천평판배지에 분리한 미생물을 접종하여 자라난 군락(co1ony) 부위에 투명환이 생기는 균주를 단백질 분해효소를 생산하는 호염성 균주로 선정하고, 이러한 균주 중에서 가장 활성이 뛰어한 균을 선별하였다.
본 발명의 균주를 동정한 결과, 형태상 세균의 일종으로 그램 음성이며, 포자를 형성하지 않는 간균으로시, 아래의 표 1과 같은 특성을 나타내었다. 본 발명의 균주는 다른 단백질 분해효소 생산균주와는 다른 형태적, 생화학적 및 배양 특성을 가지고 있는 미생물로서, 공시의 어떤 할로모나스 균종과도 다른 특성을 나타내므로, 본 발명자들은 이 균주를 신규한 균주로 단정하고 할로모나스(Halomonas sp.) YU-1029라고 명명하였다.
본 발명의 균주 할로모나스(Halomonas sp.) YU-1029는 바람직하게는 NaC1 15.0%, 글루코스(glucose) 0.2%, 프로테오스 펩톤(proteose peptone) 2.5%,MgSO4·7H2O 2.0%를 함유하는 배지(pH는 6.0)에서 배양되며, 배양 온도는 30℃가 적당하였다.
본 발명의 균주를 NaCl 15.0%, 글루코스(glucose) 0.2%. 프로테오스 펩톤(protease peptone) 2.5%, MgSO4·7H2O 2.0%를 함유하고 있는 액체 배지(pH 는6.0)에서,30℃의 호기적 조건으로 120시간 배양했을 때 최대의 효소 생산을 얻을수 있었다. 본 발명의 할로모나스(Halomonas sp.) YU-1029가 생산하는 단백질 분해효소는 후술하는 실시예 5 및 7에서 나타낸 바와 같이, 최적 반응 pH와 온도가 각각 pH 8.0,50℃인 분자량 45,000Da의 효소로, 고염의 조건에서도 높은 활성을 유지한다는 점에서 다른 단백질 분해효소와는 제반 특성이 상이한 신규 효소로 밝혀졌다.
이하 본 발명을 실시예에 의하여 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 설명하기 위한 것으로, 이들 실시예에 의해 본 발명의 범위가 한정되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 분야에서 통상의 지식을 가진 자들에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1
본 발명의 균주를 NaC1 15.0%, 글루코스(glucose) 0.2%, 프로테오스 펩톤(proteose peptone) 2.5%, MgSO4·7H2O 2.0%를 함유하고 있는 액체 배지(pH는 6.0)에서 30℃의 온도 조건으로 120시간 배양하였을 때 단위부피당 활성이 최대에 이르렀다.12,000×g에서 10분간 원심분리하여 불순물을 제거한 투명한 아조카제인(azocasein) 기질 용액 250㎕에 조효소액 150㎕를 가해서 완전히 혼합하고 45。C 수조에서 30분간 반응을 시킨 후, 10% 트리클로로아세트 산(TCA :trichloroacetic acid) 용액을 1.2㎖ 첨가하여 반응을 정지시켜 15분 간 방치하였다. 기준액은 동량의 기질 용액과 조효소액에 동량의 TCA 용액을 첨가하여 효소를 불활성화 시켜 15분간 방치한 것을 사용하였다. 효소 반응액과 기준액을 8,000×g에서 5분간 원심분리하여 상둥액을 1.2㎖ 취하고, 여기에 1.0N NaOH 1.4㎖를 첨가한 후 440nm에서의 흡광도를 측정하였다. 이 때 1㎖ 효소액에 의해 OD440을 0.001만큼 증가시키는 효소의 양을 1단위로 정하였다.
실시예 2
글루코스(glucose) 0.2%, 프로테오스 펩톤(proteose peptone) 2.5%로 고정된 조건에서 다양한 농도의 NaCl을 첨가하여 본 발명의 균주의 생육 및 효소의 생산에 미치는 영향을 확인하였다(-●-). 이 경우 대조구로서 바실러스 섭틸리스(Bacillus subtilis) KCCM l1314(-○-), KCCM 11316(-▲-)의 두 균주를 사용하였다. 그 결과, 제 1도에서 나타낸 바와 같이 두 바실러스 섭틸리스(Bacillus subtilis) 균주는 약 10% 이상의 NaCl 농도에서 생육을 하지 않았고 활성도 없었다. 반면에. 본 발명의 할로모나스(Halomonas sp.) YU-1029는 15% 농도까지는 배지 중 NaCl 함유 농도가 증가할수록 생육이 활발하였고, 20%의 농도에서도 생육이 가능하였으나 25% 이상의 농도에서는 생육을 하지 않았다. 생산된 효소의 활성도 15% 까지의 농도에서는 NaCl 농도가 증가할수록 증가하였고, 그 이상의 농도에서는 감소하였다. 이 결과로, 할로모나스(Halomonas sp.) YU-1O29는 일반 바실러스(Bacillus sp.)와는 달리 단백질 분해효소 생산을 위해서 일정 농도 이상의 NaCl을 필요로 하며, 배지 중에 15% NaCl을 함유하는 경우 단백질 분해능이 가장 높음을 확인할 수 있었다.
실시예 3
전통 장류의 숙성 및 생산에 대한 본 발명의 효소의 이용성을 검토하기 위하여 전통 장류의 원료로 이용되는 대두와 대두박을 발효시켜, 경시적으로 시간별로 생성된 유리 아미노산의 양을 측정하였다. 이 경우 대조구로서 바실러스 섭틸리스(Bacillus subtilis) KCCM 11316을 사용하였다. 대두를 발효시키는 경우,대두 50g을 12시간 동안 15% NaCl 용액에 침수시킨 후 건져서 고압 증기 살균하고, 냉각하여 균을 접종, 30℃에서 48시간동안 배양하였다. 대두박 발효의 경우에는 대두박 25g을 15% NaCl 용액 50ml에 넣어 잘 혼합한 후 고압 증기 살균하고 냉각하여 균을 접종한 후 30℃에서 48시간 배양하였다. 단, 바실러스 섭틸러스(Bacillus subtilis) KCCM 11316을 접종하는 경우에는 대두와 대두박 모두 15% NaCl 용액 대신에 물을 사용하였다. 배양을 마친 후, 살균된 15% NaCl 용액 150㎖를 넣고 혼합하여 30℃에서 발효시켰다. 유리 아미노기는 다이나이트로플루오로벤젠(FDNB:dinitro fluorobenzene) 용액을 이용하여 측정하였다. 반응액 20㎕ 1% 소듐 보레이트(sodium borate) 용액 80㎕와 0.1M FDNB 용액 10㎕를가해 60℃에서 30분간 반응시키고, 이 반응액을 냉각시킨 후 4N 염산을 300㎕ 첨가하여 100℃에서 2시간 가수분해 시킨 다음,420nm에서 흡광도를 측정하였다. 이 때, 표준곡선은 글리신(glycine)을 이용하여 측정하였다. 그 결과, 제 2(A)도와 제 2(B)도에 나타낸 바와 같이 바실러스 섭틸리스(Bacillus subtilis) KCCM l1316을 사용하여 발효시킨 경우(-○-)에는 대두와 대두박의 발효속도가 느리나, 할로모나스(Halomonas sp.) YU-1029를 접종한 경우(-●-)에는 발효속도가 빠른것으로 나타났다.
실시예 4
상기의 최적 효소생산 배양 조건으로 본 발명의 할로모나스 (Halomonas sp.) YU-1029를 배양하였다. 균주의 생육(-○-)과 효소생산(-●-)을 경시적으로 관찰한 결과를 제 3도에 나타내었다. 제 3도에서 볼 수 있는 바와 같이, 균의 생육은 접종 후 96시간까지 증가하다가 정지기에 들어갔으며, 효소의 생산은 접종후 약 40시간부터 증가하기 시작하여 120시간 배양할 때 최대활성을 보였다.
실시예 5
할로모나스(Halomonas sp.) YU-1029가 생산하는 단백질 분해효소를 최적효소 생산 배지 4.8L의 배양액으로부터 유기 용매 침전법, 이온 교환 크로마토그래피(DEAE-cellulose), 겔 칼럼 크로마토그래피(Sephadex G-75)와 겔 칼럼 리크로마토그래피(Sephadex G-75)의 방법으로 분리하였다. 정제 결과, 본 효소는 분자량 45,000달톤 정도의 효소임을 SDS-폴리아크릴아마이드 젤 전기영동(SDS-polyacrylamide gel electrophoresis)으로 확인하였다(참조 : 제 4도). 제 4도에서 제 1레인은 단백질 크기 마커이고, 제 2레인은 최종적으로 45,000Da의 단일밴드로 확인된 본 발명의 단백질 분해효소이다.
실시예 6
NaCl 농도가 효소의 활성에 미치는 영향을 확인하기 위해서 함마스텐-카제인(Hammarsten-casein)을 기질로 이용하여, 기질 용액에 NaCl을 0 내지 20%의 농도로 첨가하고 효소액과 반응시킨 후 활성을 측정하였다. 이 경우, 대조구로서 바실러스 섭틸리스(Bacillus subtilis) KCCM 11314,11316의 두 균주의 배양상등액을 사용하였다. 그 결과, 제 5(A)와 같이, 바실러스 섭틸러스(Bacillus subtilis)의 경우(11314:-●-,11316:-▲-), NaCl 농도가 증가함에 따라 활성이 급격하게 감소하는데 비해 할로모나스(Halomonas sp.) YU-1029가 생산하는 단백질 분해효소(-○-)는 NaCl 농도의 증가에 따라 활성이 계속 증가하여 20% 농도에서, NaCl이 첨가되지 않은 경우보다 활성이 약 40% 증가하였다. 이 결과로 본 발명의 효소는 일반 바실러스(Bacillus sp.)가 생산하는 단백질 분해효소와는 달리 고농도의 NaCl이 함유된 조건에서도 높은 활성을 가짐을 알았다. 기질을 함마스텐-카제인(Hammarsten-casein)과 아조카제인(azocasein)의 두가지로 나누어 각각에 대해 NaCl 0 내지 20% 농도의 용액을 만들어 효소액과 반응시킨 후활성을 측정하였다(참조 : 제 5(B)도). 그 결과, 함마스텐-카제인의 경우는 NaCl농도 증가에 따라 활성이 증가하는 경향을 보였으나, 아조카제인의 경우에는 활성이 약간씩 감소하여 20% NaCl 농도에서 활성이 16% 감소하였다. 그러나 바실러스 섭틸러스(Bacillus subtilis)와 비교할 때, 본 발명의 효소는 고염의 조건에서도 높은 활성이 유지되므로, 본 발명의 효소가 호염성을 지니고 있음을 확인하였다.
실시예 7
정제된 상기의 단백질 분해효소의 특성을 검토하고 그 결과를 제 6내지 제7도에 나타내었다. 제 6도는 본 발명의 단백질 분해효소의 활성(-○-)과 안정성(-●-)에 미치는 pH의 영향을 나타낸 그래프로서, 단백질 분해효소와 아조카제인(azocasein)의 pH를 각각 4,5,6,7,8,9,10 및 11로 조절한 완충용액에서 반응시킨 결과, 최적 pH는 8.0이었고 pH 6.0 내지 pH l0.0에서는 50% 이상의 활성을 나타내었다. 본 발명의 단백질 분해효소를 pH 4,5,6,7,8,9,10 및 11로 조절한 완충용액에서 1시간 동안 방치한 다음, 다시 pH 8.0으로 조절하여 아조카제인과 반응시킨 결과 pH 6.0 내지 pH 9.0의 범위에서 안정함을 확인할 수 있었다. 제 7도는 본 발명의 단백질 분해효소의 활성(-○-)과 안정성(-●-)에 미치는 온도의영향을 나타낸 그래프로서, 최적 반응온도는 50℃였으며 4℃와 20 내지 80℃의 범위의 10℃ 간격의 각 온도에서 1시간 동안 방치한 다음 반응시킨 결과 4 내지 40℃의 범위에서 비교적 안정함을 확인하였다.
실시예 8
본 발명 효소의 활성에 대한 화학물질의 영향을 검토하기 위하여 각종 화학물질을 효소액에 첨가하여 상온에서 10분간 방치한 후 효소의 잔존활성을 측정하였다. 그 결과, 본 발명의 단백질 분해효소는 에틸렌다이아민테트라아세트 산(EDTA:ethylenediaminetetraacetic acid)에 의해 활성이 크게 감소하였다. 본 발명의 효소에 대하여 농도별로 EDTA를 처리한 결과, 제 8도와 같은 활성 저해 경향을 나타내었다. 따라서, 본 발명의 단백질 분해효소는 활성 중심에 보조 인자로서 금속 이온을 필요로하는 메탈로-단백질 분해효소(metalloprotease)의 성질을 가지는 것을 확인하였다.
이상에서 상세히 설명하고 입증하였듯이, 본 발명은 호염성의 단백질 분해효소를 생산하는 신규한 미생물 할로모나스(Halomonas sp.) YU-1029 및 그로부터 생산되는 신규한 단백질 분해효소를 제공한다. 본 발명의 호염성 단백질 분해효소는 고염의 환경에서도 높은 활성을 유지함으로써 우리나라의 전통 장류 및 젓갈과 같은 고염도 식품의 숙성시 단시간에 아미노산을 생성, 숙성기간을 단축할 수 있다.
Claims (3)
- 호염성 단백질 분해효소를 생산하는 할로모나스(Halomonas sp.) YU-1029.
- 제 1항에 있어서, 호염성 할로모나스(Halomonas sp.) YU-1029를 사용하여 단백질을 발효시킴으로써 아미노산을 생성하여 간장 및 조미료를 제조하는 방법.
- 할로모나스(Halomonas sp.) YU-1029로부터 생산되는 분자량 45,000Da, 효소반응의 최적 pH는 8.0이고 pH 6.0에서 pH 9.0까지 안정하며, 최적 반응온도가 50℃이며 함마스텐-카제인(Hammarsten-casein)을 기질로 사용한 경우 0 내지 20%의 범위에서 NaCl 농도가 증가함에 따라 활성이 증가하는 호염성을 갖는 것을 특징으로 하는 단백질 분해효소.
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1019980009547A KR19990075377A (ko) | 1998-03-20 | 1998-03-20 | 신규한 호염성 단백질 분해효소 및 그를 생산하는 미생물 |
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Publications (1)
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| KR19990075377A true KR19990075377A (ko) | 1999-10-15 |
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| KR1019980009547A KR19990075377A (ko) | 1998-03-20 | 1998-03-20 | 신규한 호염성 단백질 분해효소 및 그를 생산하는 미생물 |
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|---|---|
| KR (1) | KR19990075377A (ko) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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-
1998
- 1998-03-20 KR KR1019980009547A patent/KR19990075377A/ko not_active Application Discontinuation
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