KR100227314B1 - 신규의 아미노펩티다제와 그 생산균주 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 고농도의 소금의 존재하에서 활성이 증가하는 아미노펩티다제와 그 제조방법에 관한 것으로 본 발명의 신규의 바실러스속(Bacillus sp. N2, KCTC 8819P)의 균주가 생산하는 아미노펩티다제를 이용하면 고염의 존재하에서 펩타이드를 분해할 수 있으므로 단백질 가수분해를 기본으로하는 식품가공 산업분야에 널리 적용할 수 있다.

Description

신규의 아미노펩티다제와 그 생산균주
본 발명은 루이신 잔기에 대해 높은 기질특이성을 가지는 아미노펩티다제를 생산하는 신규한 바실러스속 균주 및 그 균주로부터 상기 효소를 대량생산 하는 방법에 관한 것이다.
식용육의 보존중에 생기는 유리 아미노산이 보존육의 질, 맛, 풍미를 향상시킨다는 사실은 널리 알려져 있다. 이러한 유리 아미노산은 육질에 존재하는 아미노펩티다제의 exoproteolysis에 의하여 생성된다. 따라서 이러한 아미노펩티다제는 식육가공분야에 있어서 육질의 개선, 맛의 향상등의 수단으로서 유용하다.
종래에도 이러한 목적에 이용되는 효소로서 동물, 미생물에서 유래하는 루이신-아미노펩티다제(leucine-aminopeptidase)가 개발된 바 있다. 이러한 효소는 특히 루이신(leucine) 잔기에 대해 높은 친화성을 가지는 특성이 있다. 그러나 이러한 효소는 루이신 뿐만이 아니라 메치오닌(methionine)등의 다른 아미노산 잔기에 대해서도 비교적 높은 기질 친화성을 가질 뿐 아니라 기질에 대한 특이성이 낮거나, 메치오닌(methionine)등의 함유 아미노산을 유리한다는 단점이 있다. 또한 유리 아미노산은 맛을 저하시키는 단점이 있어서 함유 아미노산을 유리시키지 않고 높은 기질특이성을 가지는 루이신-아미노펩티다제(leucine-aminopeptidase)가 요구되어 왔다. 또 종래의 젖갈, 간장 또는 된장 등 단백질 발효 식품에 있어서 높은 농도의 소금을 함유하고 있음으로 풍미를 개선하기 위한 목적으로 아미노펩티다제를 사용할 경우에는 그 활성이 감소하는 경향이 있다. 이러한 결점을 개선하기 위해서는 고염의 존재하에서도 아미노펩티다제의 활성이 유지 또는 증가되는 아미노펩티다제의 개발이 요구되어 왔다.
더욱이, 상기 종래의 아미노펩티다제(aminopeptidase)는 해양생물, 또는 고등동물의 체조직, 대표적으로는 포유류의 골격근육으로부터 단리되는 것으로서 안정적이며 대량으로 아미노펩티다제(aminopeptidase)를 제공하는 것에는 한계가 있었다. 따라서, 본 발명은 저가, 대량의 높은 기질특이성을 나타내면서도 고 농도염의 존재하에서도 활성이 유지되는 루이신-아미노펩티다제(leucine-aminopeptidase)를 제공함을 그 목적으로 한다. 본 발명의 또 다른 목적은 상기 효소를 생산할 수 있는 신규한 균준를 제공하는 데 있다.
본 발명의 목적은 멸치젖으로부터 바실러스(Bacillus sp.)속에 속하는 신규한 균주를 순수 분리하고, 이 균주로부터 신규한 루이신-아미노펩티다제(leucine-aminopeptidase)를 정제하여 그 특성을 규명하므로서 달성하였다.
제1도는 본 발명 루이신-아미노펩티다제(leucine-aminopeptidase)를 생성하는 바실러스속 세균의 전자현미경 사진.
제2도는 본 발명 루이신-아미노펩티다제의 SDS-PAGE에 의한 전기 영동패턴을 보인 사진.
제3도는 본 발명 루이신-아미노펩티다제의 pH에 따른 상대활성을 나타낸 그림.
제4도는 본 발명 루이신-아미노펩티다제의 온도에 따른 상대활성을 나타낸 그림.
제5도는 본 발명 루이신-아미노펩티다제를 30-80
Figure kpo00002
의 조건하에서 30분간 방치한 후의 상대활성을 나타내는 그림.
제6도는 본 발명 루이신-아미노펩티다제에 따른 상대활성을 나타낸 그림.
제7도는 SDS-PAGE의 검선량으로부터 측정한 본 루이신-아미노펩티다제의 분자량을 나타낸 도면이다.
본 발명의 신규한 바실러스속 균주와 그 균주가 생산하는 루이신-아미노펩티다제는 다음과 같은 특성을 가진다.
작용:아미노펩티다제(aminopeptidase)활성을 가짐; 최적 pH : 약 9.5; 최적온도 50
Figure kpo00003
이다. 열안정성 : pH 7.5에서 30분간 방치한 경우 50
Figure kpo00004
까지 안정하다. 내염성 : 4.5M의 NaCl농도에서도 높은 효소 활성을 나타낸다.
기질특이성 : L-루이신(Leucine)잔기에 대해서 높은 특이성을 나타낸다. 분자량 : Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel 전기영동법에 의하여 분자량은 약 58,000 Da이며, 단량체로서 존재한다.
본 발명 신규한 루이신-아미노펩티다제는 금속단백질분해효소(metalloprotease)로서의 특성을 가진다.
상기 특성을 가지는 미생물 유래의 루이신-아미노펩티다제(leucine-aminopeptidase)는 지금까지 알려진 바 없으며, 본 발명의 루이신-아미노펩티다제(leucine-aminopeptidase)는 상기 균주를 배양하여 그 배양물로부터 분리 정제된다.
이하, 본 발명의 구성과 작용을 실시예를 통하여 상세히 설명한다.
본 발명 신규한 균주의 균학적 성질과 효소의 이화학적 특성은 다음과 같다.
[형태 및 배양학적 특성]
멸치젖으로부터 분리한 본 발명 균주는 바실러스속 세균으로 전자현미경을 이용하여 관찰한 결과는 제1도에 나타내었다. 단간균으로서 0.5
Figure kpo00005
1.5-2um의 크기를 나타내고 있으며, 지방산 함량의 측정으로 바실러스속의 신규한 세균인 것으로 판단되었다. 본 균주는 1997년 8월 8일 한국과학기술원 부설 생명공학연구소 유전자 센타에 수탁번호 KCTC 8819P로 기탁하였다. 본 발명 균주를 배양하기 위한 배지로서는 특별히 한정하지 않고 보통의 액체배지 또는 고체배지가 이용되었다. 본 균주의 배지의 조성은 표 1과 같다. 본균의 배양온도는 특별한 제한은 없으나, 20-30
Figure kpo00006
, 보다 바람직한 온도는 30
Figure kpo00007
로 나타났다. 액체 배양의 경우는 1-3일간, 진탕 또는 통기각반 하면서 수행하였다.
Figure kpo00008
[루이신-아미노펩티다제(leucine-amiopeptidase)의 분리 정제]
상기 액체 배양액으로부터 본 발명의 루이신-아미노펩티다제를 분리 정제 하기 위해서는 기존의 정제법을 단독으로 또는 병용해서 이용하였다.
본 발명의 루이신-아미노펩티다제는 본 발명 균주를 배양함에 따라 균체외로 분비된다. 따라서 배양후 배양액 중의 균체를 원심분리에 의해 제거하였다. 얻어진 배양액(조효소액)을 ammonium sulfate에 의한 분획(염석), 투석, 각종 크로마토그라피, gel-filtration등의 일반적인 효소의 정제공정을 수행함으로써 정제할 수 있다. 즉, 얻어진 배양액을 ammonium sulfate분획한 후 양이온 및 음이온교환크로마토그라피, gel-filtration을 수행함으로서 정제된 고활성의 효소 분획을 얻을 수 있었다.
[루이신-아미노펩티다제 활성의 측정]
본 발명의 루이신-아미노펩티다제의 활성은 L-Leucine-p-nitroanilide를 기질로서 이용하여 1분간에 1umol의 p-nitroaniline을 유리하는 양을 1U로서 측정하였다. 즉, 조효소액 또는 각 ammonium sulfate분획액 10ul을 20mM L-leucine-p-nitroanilide(DMSO) 990ul 첨가하여, 37
Figure kpo00009
에서 30분간 반응시킨 후 405nm의 흡광도(OD405)를 측정하였다. 상기 조소액 또는 ammonium sulfate 분획액중의 단백질의 양도 Bradford법에 따라 동시에 측정하였다. 상기 405nm의 흡광도로부터 계산식(od 40
Figure kpo00010
50.56
Figure kpo00011
0.1ml)/(0.01
Figure kpo00012
30분
Figure kpo00013
단백질의 농도)에 의해 단백질의 양으로부터 비활성(specific activity,
Figure kpo00014
/ml)을 계산하였다.
이하의 실시예에서 본 발명을 더욱 상세하게 설명하지만 본 발명의 권리범위는 이에만 한정하는 것은 아니다.
[실시예 1]
[Bacillus sp N2의 배양]
20ml의 L배지(1
Figure kpo00015
Bactotryptone, 0.5
Figure kpo00016
Yeast extract, 5
Figure kpo00017
NaCl, pH 7.0)을 함유하는 100ml의 삼각플라스크에 접종하여 30
Figure kpo00018
에서 24시간 진탕배양하였다. 이 배양액을 300ml의 L배지를 함유하는 삼각 플라스크 20개에 접종하여 30
Figure kpo00019
에서 24시간 진탕배양하였다.
[실시예 2]
[루이신-아미노펩티다제(leucine-aminopeptidase)의 분리정제]
상기 실시예1의 배양액을 원심분리하여 균체와 배양액을 분리하였다. 얻어진 배양액에 대해 40
Figure kpo00020
가 되도록 ammonium sulfate를 첨가하여 실온에서 각반한 후 원심분리에 의해 40
Figure kpo00021
의 ammonium sulfate에 의해 침전된 단백질을 제거하였다. 그리고 90
Figure kpo00022
의 농도가 되도록 ammonium sulfate를 첨가하여 40-90
Figure kpo00023
의 ammonium sulfate 분획을 얻었다. 이러한 분획의 aminopeptidase의 활성을 상기의 활성측정방법으로 측정하였다. 이 amINopeptidase는 40-90
Figure kpo00024
ammonium sulfate 분획에 존재하고 있음을 예비 실험에서 확인하였다.
[실시예 3]
[루이신-아미노펩티다제(leucine-aminopeptidase)의 이온교환크로마토그라피에 의한 정제]
[양이온교환크로마토그라피]
상기의 40-90
Figure kpo00025
ammonium sulfate 분획을 25mM Tris-HCl(pH 7.7) 완충액으로 투석한 후 CM-sepharose CL-6B(Pharmacia제)를 담체로 하는 양이온교환 크로마토그라피를 이용하여 분획정제하였다. 칼럼(column)의 직경 2.5cm, 길이 25cm의 양이온 교환 컬럼에 단백질농도 12
Figure kpo00026
/ml로 조정한 후 상기의 투석한 단백질용액을 첨가하였다. 25mM Tris-HCl(pH 7.5) 완충액을 이용하여 유속 1.5ml/분, NaCl농도가 0로부터 0.5M의 농도균배로서 용출하여 10ml씩 용출액을 분획회수하여 얻어진 각 분획을 280nm의 자외선흡광도를 측정하였다.
사용한 양이온 교환크로마토그라피는 루이신-아미노펩티다제의 정제에 유효하였으며 0.3M-NaCl 농도부근에서 용출되었다. 정제에 의해 비활성이 2.1U/
Figure kpo00027
단백질의 활성분획이 얻어졌다.
[음이온교환크로마토그라피]
루이신-아미노펩티다제를 더 정제하기위해 상기 양이온 교환 크로마토그라피에서 얻어진 활성효소분획을 음이온교환크로마토그라피(FPLC; Mono-Q HR 5/5 column, Pharmacia)를 수행하였다. 25mM sodium phospahte buffer(pH 6.8)을 이용하여, 유속 0.5ml/분, NaCl농도를 0에서 0.5M의 농도균배로서 용출시켜, 0.5ml씩 용출액을 분획 회수하여 얻어진 각 분획을 280nm의 자외선 흡광도를 측정하여 단백질양과 루이신-아미노펩티다제 활성을 특정하였다.
사용한 음이온 교환 크로마토그라피는 루이신-아미노펩티다제의 정제 및 농축에 유효하였으며 루이신-아미노펩티다제는 0.3M의 NaCl 농도부근에서 용출되었다. 정제 결과, 비활성이 5.3U/
Figure kpo00028
의 단백질로서의 활성분획을 얻을 수 있었다.
[Gel-filtration 크로마토그라피]
루이신-아미노펩티다제(leucine-aminopeptidase)를 더 정제하기 위하여 상기 음이온 크로마토그라피에서 얻어진 활성분획을 Gel-filtration 크로마토그라피(FPLC; Superdex-200 HR 10/30, Pharmacia)로서 분리를 수행하였다. 0.15M NaCl을 포함하는 25mM Tris-HCl(pH 7.5) buffer를 이용하여 유속 0.5ml/min으로 하여, 0.25ml씩 용출액을 회수하였다.
사용한 Gel-filtration 크로마토그라피(FPLC; Superdex-200 HR 10/30, Pharmacia)는 루이신-아미노펩티다제의 정제 및 농축에 유효하였으며, 이 peptidase는 60-70의 분획에서 용출되었다. 정제 결과 따른 비활성이 17U/
Figure kpo00029
단백질로서 활성분획을 얻을 수 있었다.
상기 각 단계의 정제방법에 따른 루이신-아미노펩티다제의 정제도 및 단백질양에 해당하는 비활성을 표 2에 나타내었다. 또한 정제단계별 활성획분의 SDS-PAGE 결과는 제2도에 나타내었다. M은 분자량 마커(marker)를 나타내며, 1번 레인(lane)는 배양액, 2번 레인(lane)은 40-90
Figure kpo00030
의 ammonium sulfate로서 침전시킨 단백질의 분획, 3번 레인(lane)은 CM-세파로스(sepharose) CL-6B 크로마토그래피의 활성을 나타내는 분획, 4번 레인(lane)은 모노-Q 크로마토그래피의 활성획분을, 5번 레인(lane)은 슈퍼덱스-200(superdex-200)을 이용한 gel-filtration의 활성분획을 각각 나타낸다.
Figure kpo00031
[실시예 4]
[루이신-아미노펩티다제(leucine-aminopeptidase)의 최적 pH]
pH는 4.0에서 6.0까지 0.5 간격으로 citrate buffer로써 조정하였다. 또 pH 6.0에서 7.5까지의 buffer는 ammonium sulfate를 이용하여 조정하였다. pH7.5에서 8.5까지의 buffer는 Triethanolamine으로 조정하였다. pH 8.5부터 11까지의 pH범위의 buffer는 carbonate로써 조성하였다. 상기 실시예 3에서 정제된 본 루이신-아미노펩티다제 효소의 활성을 측정한 결과를 제3도에 나타내었다. 그림 중의 횡축은 반응 pH를 나타내며, 종축은 최대활성을 100으로 한 경우의 상대활성(
Figure kpo00032
)로서 표시하였다. 본 발명 루이신-아미노펩티다제의 최적 pH는 9.5로 나타났다.
[실시예 5]
[peptidase의 작용온도의 범위 및 열안정성]
[작용온도]
상기의 실시예 3에서 얻은 정제된 루이신-아미노펩티다제 활성을 여러 온도조건(10,20,30,40,50,60,70,80,90
Figure kpo00033
)에서 측정하였고 그 결과를 제4도에 나타내었다. 그림 중의 횡축은 반응온도(
Figure kpo00034
)를 나타내고, 종축은 최대활성을 100으로 한 경우의 상대활성(
Figure kpo00035
)을 나타내었다. 본 발명 루이신-아미노펩티다제의 최적작용 온도는 50
Figure kpo00036
로 나타났다.
[열안정성]
상기의 실시예 3에서 얻어진 정제된 루이신-아미노펩티다제를 여러 온도 조건하에서 30분간 방치한 후 활성을 측정하였고, 그 결과를 제5도에 나타내었다. 종축은 최대 활성을 100으로 한 경우의 상대활성(
Figure kpo00037
)을 나타내며, 본 발명의 aminopeptidase는 50
Figure kpo00038
까지 안정한 것으로 나타났다.
[실시예 6]
[루이신-아미노펩티다제의 NaCl에 대한 내염성]
상기의 실시예 3에서 얻어진 정제된 루이신-아미노펩티다제를 여러 NaCl 농도하에서의 aminopeptidase의 활성을 측정하였다. NaCl의 농도를 0, 0.5, 1, 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5M의 농도하에서의 상대활성(
Figure kpo00039
)을 측정하였다. NaCl을 포함하지 않는 조건을 100으로 하여 상대활성을 측정한 결과를 제6도에 나타내었다. 본 발명 루이신-아미노펩티다제는 4.5M의 NaCl농도하에서도 200
Figure kpo00040
의 활성을 나타내었으며, NaCl의 농도의 증가에 따라 본 발명의 루이신-아미노펩티다제 활성이 증가하는 현상이 밝혀져 내염성의 효소인 것으로 나타났다.
[실시예 7]
[루이신-아미노펩티다제의 기질특이성]
여러 종류의 α-aminoacyl-ρ-nitroanilide류(L-Arg-pNA, L-Lys-pNA, L-Ala-pNA, L-Pro-pNA, L-Gly-pNA, Met-pNA, L-Phe-pNA, L-Leu-pNA, L-Glu-pNA, L-Val-pNA)을 기질로 하여 상기의 실시예 3에서 정제된 peptidase의 활성을 측정하여 루이신-아미노펩티다제의 기질특이성을 조사하였다. L-Leu-pNA를 기질로 한 경우를 100으로 한 상대활성(
Figure kpo00041
)을 표 3에 나타내었다.
본 발명 루이신-아미노펩티다제는 루이신(leucine)잔기에 대하여 특히 높은 기질특이성을 나타내었다.
Figure kpo00042
[실시예 8]
[루이신-아미노펩티다제의 분자량의 측정]
SDS-PAGE 전기영동법(Laemmli, U.K., Nature, 227, 680, 1970)에 의하여 본 발명 루이신-아미노펩티다제의 분자량을 측정하였다.
Vertical gel전기영동장치(Bio-Rad사)상의 SDS-polyacrylamide gel(분리 gel(12.5
Figure kpo00043
) 및 농축 gel(3
Figure kpo00044
)에 상기 실시예 3에서 얻어진 정제된 루이신-아미노펩티다제를 loading하여 30mA에서 영동하였다. 분자량 marker로서 phospholyase b(분자량 94,000), serum albumin(분자량 67,000), egg albumin(분자량 43,000), carbonicanhydrolase(분자량 30,000), trypsin inhibitor(분자량 20,100), 및 a-lactoalbumin(분자량 14,400)을 동시에 전기영동한 후 coomassie Brilliant blue R-250으로 염색하고, 루이신-아미노펩티다제와 각 분자량 marker와의 상대영동거리의 측정에 의해 본 발명 루이신-아미노펩티다제의 분자량을 결정하고, 그 결과를 제7도에 나타내었다. 오른쪽의 lane은 본 루이신-아미노펩티다제를, 왼쪽의 lane은 동시에 영동한 각 분자량 marker를 나타내고 있다. 모식도 왼쪽의 수치는 분자량의 크기를 나타낸 것이다. 그림 7은 분자량 marker 검량선 및 본 루이신-아미노펩티다제 상대 분자량을 나타내었다. 그림의 횡축은 Rf치, 종선은 분자량(10-4-10-5)를 나타내었다. 본 SDS-PAGE에 의한 본 발명 루이신-아미노펩티다제는 단일band를 나타내고 있다(제2도). 본 발명 루이신-아미노펩티다제의 SDS-PAGE에 있어서의 분자량은 약 58,000 Da인 것으로 나타났다.
[실시예 9]
[Protease inhibitor의 영향]
본 발명 루이신-아미노펩티다제에 대하여 여러종류의 단백질저해제(protease inhibitor)를 처리하였다. 1, 10mM PMSF, 1, 10-phenthroline, Iodoacetic acid, N-methyl maleimide, Diisopropylflurophosphate, DTT, Bestatin, EDTA, 0.1, 0.5, 1
Figure kpo00045
SDS의 각 저해제로서 처리(pH 7.5, 37
Figure kpo00046
, 30분)한 후 활성을 측정하였다. 그 결과를 표 4에 나타내었다.
본 발명 루이신-아미노펩티다제는 1, 10-phenanthroline, DTT, SDS에 의해 현저한 활성저해를 나타내었다. 이상의 결과로서 본 발명 루이신-아미노펩티다제는 금속 단백질(metalloprotease)인 것으로 나타났다.
Figure kpo00047
[실시예 10]
[금속이온에 대한 영향]
본 발명 루이신-아미노펩티다제에 대한 여러 종류의 2가 금속이온으로 처리한 후 루이신파라니트로아닐라이드(leucine-p-nitroanilide)를 기질로하여 효소활성을 측정하였다. 1, 5mM의
Figure kpo00048
2+ 2+ 2+ 2+ 2+ 2+ 2+ 2+
Figure kpo00049
, 30분의 조건하에서 효소활성을 측정하였다. 그 결과를 표 5에 나타내었다.
본 발명 루이신-아미노펩티다제(leucine-aminopeptidase)는 Mn2+, Fe2+, Ca2+, Cu2+에 의해 현저한 효소활성의 저해를 나타내었다. 그러나 Co2+의 첨가에 의해 약 2-3배의 활성이 증가한다는 것이 본 결과에서 나타났다.
Figure kpo00050
[실시예 11]
[첨가 아미노산에 대한 영향]
여러 종류의 아미노산을 반응액중에 5mM의 농도로 첨가하여 본 발명 루이신-아미노펩티다제의 활성에 미치는 영향을 조사하였다. 여러종류의 L-아미노산(methionine, leucine, glutamic acid, arginine, phenylalanine, lysine, tryptophane, alanine, asparagine, serine, threonine, proline, glycine, cystidine, histidine, valine)을 5mM이 되게 반응액중에 가하여, 상기의 실시예 3에서 얻어진 정제된 루이신-아미노펩티다제 효소활성을 측정하였다. 실험 결과 아미노산 무첨가한 것(비교구)의 활성을 100으로 하여 상대활성(
Figure kpo00051
)로 표시하여 표 6에 나타내었다.
본 발명 루이신-아미노펩티다제는 공존하는 L-cystidine, L-arginine에 의하여 저해되었다. 그러나 L-Leucine, L-serine, L-tryptophane, L-lysine, L-asparagine, glycine, L-proline에 의해 활성화됨을 알 수 있었으며 L-leucine존재하에서는 약간의 활성의 증가를 나타내었다.
Figure kpo00052
이상의 실험 및 실시예를 통하여 입증된 바와같이 본 발명은 루이신 잔기에 대해 높은 기질특이성을 가지는 신규의 루이신-아미노펩티다제를 제공하므로써 저장식용육의 맛, 풍미 개선에 유용한 효과가 있다. 또 본 발명 루이신-아미노펩티다제는 내염성이 높기 때문에 우리나라의 염 농도가 높은 식품에 대해서도 그 이용 효과가 높은 것으로 기대된다. 이밖에도 본 발명 루이신-아미노펩티다제 세균의 배양에 의해 생산되어지기 때문에 저가로 대량의 루이신-아미노펩티다제를 제공할 수 있기 때문에 시약 등 공업적인 용도로도 널리 이용될 수 있는 효과가 있다.

Claims (4)

  1. 하기 특성을 가지는 신규한 Bacillus sp.N2(KCTC 8819P) 세균 유래의 루이신-아미노펩티다제(leucine-aminopeptidase) 효소, 작용 : 아미노펩티다제(aminopeptidase)활성을 가지며 최적 pH : 약 9.5이며, 최적온도는 50
    Figure kpo00053
    이며, 열안정성 : pH7.5에서 30분간 방치한 경우 50
    Figure kpo00054
    까지 안정하며, 내염성 : 4.5M의 NaCl농도에서도 높은 효소활성을 유지하며, 기질특이성 : L-Leucine잔기에 대해서 높은 특이성을 나타내며, 분자량 : Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel전기영동법에 의해 결정된 분자량은 약 58,000 Da이며, 단량체이다.
  2. 제1항에 있어서, 상기 루이신-아미노펩티다제 효소는 1,10-penanthroline, DTT, 또는 SDS에 의하여 활성저해를 받는 금속단백질 분해효소로서 aminopeptidase임을 특징으로 하는 효소.
  3. 루이신-아미노펩티다제를 생산하는 신규한 Bacillus sp.N2(KCTC 8819P).
  4. Bacillus sp.N2(KCTC 8819P)를 증류수 100㎖당 Bactotryptone 1g, Bactoyeast extract 0.5g, NaCl 5
    Figure kpo00055
    를 첨가하여 된 배지(pH 7.0)에서 20∼30
    Figure kpo00056
    에서 진탕배양한 후 배양액으로부터 분리 정제함을 특징으로하는 루이신-아미노펩티다제의 생산방법.
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