WO2006088199A1

WO2006088199A1 - Nε-アシル-L-リジン特異的アミノアシラーゼ

Info

Publication number: WO2006088199A1
Application number: PCT/JP2006/303047
Authority: WO
Inventors: Kazuhiro Nakanishi; Koreyoshi Imamura; Hiroyuki Imanaka; Mayuko Koreishi; Noriki Nio
Original assignee: Ajinomoto Co., Inc.; National University Corporation Okayama University
Priority date: 2005-02-21
Filing date: 2006-02-21
Publication date: 2006-08-24
Also published as: JP4941990B2; US7888079B2; JPWO2006088199A1; EP1852502A1; EP1852502B1; US20070298469A1; EP1852502A4

Abstract

　本発明により、Lysのε－アミノ基を特異的にアシル化及びそれを加水分解する能力に優れたアミノアシラーゼ及びそれを用いたNε-アシル－リジンの製造法が提供される。本発明により、N末端にアミノ酸配列SERPXTTLLRNGDVH（Xは不明）を含むNε-アシル－リジン特異的アミノアシラーゼおよび、前記アミノアシラーゼをL-Lysおよびカルボン酸に作用させることを含む、Nε-アシル－リジン製造方法が提供される。

Description

明細書

N ε -ァシル- L-リジン特異的アミノアシラーゼ

技術分野

[0001] 本発明は、微生物由来の新規な N ε -ァシル -L-リジン特異的分解および合成酵素、およびその製造方法に関する。また、本発明は、前記酵素を用いた Ν ε -ァシル -L -リジンの製造方法にも関する。

背景技術

[0002] Ν ε -ァシル- L-リジンは、その構造力くる特性や自然界に排出された後の安全性、無公害性の面より、両性界面活性剤原料として一般洗浄剤はもとより、殺菌消毒剤、繊維柔軟材、防鲭剤、浮遊選鉱剤、接着剤、清澄剤、染料固着剤、帯電防止剤、乳化剤、化粧品用界面活性剤などの広範な産業用途を有するものである。特に、水や通常の有機溶剤に極めて溶けにくぐかつ、撥水性、抗酸化性、滑沢性などの特長を活力して、有機系の新しい粉黛素材として、化粧品、潤滑剤などの分野での活用が拡大して!/、る（特開昭 61-10503)。

この Ν ε -ァシル -L-リジンの製造には、従来、アミノ酸のアルカリ水溶液中にァシルノ、ライドを滴下させるいわゆるショッテン'バウマン法が採用されてきた。しかしながら、リジンのような塩基性アミノ酸は、 a—位及び ω—位にアミノ基を有するために、このショッテン'バウマン法ではジアルキル塩基性アミノ酸が主生成物となり、 ω—ァシル塩基性アミノ酸は副生成物として少量でし力得られない。そのため、 ω—ァシル塩基性アミノ酸を製造するには、塩基性アミノ酸を塩基性アミノ酸銅塩とし、これをァシルクロライドにてァシルイ匕した後、銅を脱離させる方法が知られている（薬学雑誌、 89 、 531(1969))。これらの方法においては、製造工程、製造作業が煩雑であり、重金属である銅が使用され、脱銅工程で大量の硫ィ匕水素ガスが必要とされる。

それ故、酵素を使用したより温和な条件で Ν ε -ァシル -L-リジンを特異的かつ効率良く加水分解及び合成する酵素の存在とその工業的製造方法の開発が志向されている。

[0003] 従来、 Ν ε -ァシル -L-リジン類を特異的に加水分解することができる酵素に関する報告は少なぐァクロモパクタ^ ~ ·ぺスチフェル（Achromobacter pestifer) (A.ぺスチフエル）由来の酵素、ラット腎由来の酵素、シユードモナス（Pseudomonas) sp. KT-83由来の酵素などが報告されている力それらの酵素による Ν ε -ァシル -L-リジンの合成反応については報告はなされていない。また、リジンに存在する 2つのアミノ基のうち、 ε アミノ基を特異的かつ効率的にァシルイ匕する酵素は見出されていない。

また、従来の酵素による Ν ε -ァシル -L-リジンの合成については、例えば、特開 200 3-210164記載のカブサイシン分解合成酵素が Ν ε -ァシル -L-リジンの合成反応をも触媒するとの報告がある。

特開 2004-81107に記載されているように、特開 2003-210164記載のカプサイシン分解合成酵素により収率 95%で Ν ε -ラウロイル -L-リジンが生成するという報告がある。しかし、反応時間が 2日間という長時間を要し、また、このカブサイシン分解合成酵素は ε ーァミノ基のみならず α アミノ基に対しても高い反応性を示すため、最終的には、 Ν α -ラウロイル- L- Lysと Ν ε -ラウロイル- L- Lysの混合物が生成する。

発明の開示

本発明は、 N ε -ァシル -L-リジンを特異的に加水分解能及び合成する能力に優れた新規な酵素およびその製造方法、並びに前記酵素を用いた Ν ε -ァシル -L-リジンの製造方法を提供する。

本発明者らは、ストレプトミセス（Streptomyces)属に属する微生物力 N ε -ァシル- L-リジンを特異的に加水分解及び合成する能力に優れた酵素を生産することを見出した。

本発明の一側面は、以下の性質を有する酵素である：

1) Ν ε -ァシル -L-リジンに作用し、カルボン酸と L-リジンを遊離させる反応を触媒し、かつ、その逆反応も触媒する。

2)基質特異性:各種ァシル基を有する N ε -ァシル -L-リジンに作用し、 Ν ε -ァシル- D-リジンに対する反応性は非常に低い。ァシル基に対する特異性は広ぐ飽和または不飽和脂肪酸ァシル、更には芳香族基カルボン酸ァシルカゝらなる Ν ε -ァシル -L- リジンを加水分解し、その逆反応も触媒する。逆反応については、 L-リジンの ε -アミノ基に作用するが、 D-リジンの ε -ァミノ基に対する反応性は非常に低ぐ L-リジンの ε -ァミノ基に優先的に作用する。

3)至適 ρΗ :Ν ε -ァシル -L-リジンを基質としたときの加水分解反応の至適 ρΗは、 37 °Cにおいて、トリス—塩酸緩衝液中で pH8.0〜9.0の範囲である。

4) pH安定'性： 37°C、 1時間のインキュベートにおいて、 pH 6.5〜10.5の範囲で安定である。

5)至適温度: N ε -ァセチル -L-リジンを基質としたときの加水分解反応の至適温度は、 50 mMトリス—塩酸緩衝液（pH8.2)中で、約 55°Cである。

6)熱安定性: 50 mMトリス—塩酸緩衝液 (pH8.2)中、 40°Cにて 60分間処理しても全く失活しない。また、同じ緩衝液中で 55°Cにて 60分間処理した後の残存活性は約 80% (75〜85%)である。

7)活性は 0-フエナンスロリンにより阻害を受ける。

8)コバルトイオンにより活性が増加する。

9)分子量は SDS-ポリアクリルアミド電気泳動による測定では分子量約 60kである。

10) N末端にアミノ酸配列 SERPXTTLLRNGDVH (Xは不明）を含む。

また、本発明の一側面は、 Streptomyces属に属し、前記性質を有する酵素を生産する微生物、特に、ストレプトミセス'モバラエンシス（Streptomyces mobaraensis) (S. モバラエンシス)を培養し、それらの培養物力前記酵素を分離および Zまたは回収することを特徴とする本発明の酵素の製造方法である。

本発明の別の側面は、本発明の酵素をカルボン酸および L-リジンまたはこれらの塩と接触させ、それによつて N ε -ァシル -L-リジンを生成させることを含む、 Ν ε -ァシル -L-リジンの製造方法でもある。

本発明の更なる側面は、本発明の酵素を、炭素数 5以上のァシル基を有するカルボン酸またはその塩と- L-リジンまたはその塩と接触させ、それによつて Ν ε -ァシル- L-リジンを生成させることを含む、 Ν ε -ァシル -L-リジンの製造方法である。

本発明のより具体的な一実施態様では、上述した Ν ε -ァシル -L-リジンの製造方法において、カルボン酸はオクタン酸、デカン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、ノルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸、リノレン酸、安息香酸、ケィ皮酸力なる群より選ばれる。更に、本発明の別の側面は、本発明の酵素とカルボン酸またはその塩、および L-リジンまたはその塩との接触が水溶性溶媒中で行われる、 N ε -ァシル -L-リジンの製造方法でもある。

発明を実施するための最良の形態

[0006] 本発明において使用される新規な酵素は、微生物を培養することによって生産することができる。その生産菌としては上記性質を有する酵素を生産する能力を有していれば特に限定されないが、 Streptomyces属に属する微生物が好ましぐ Streptomyces mobaraensisが特に好まし!/、。 Streptomyces属に属する微生物の供給源は特に限定されないが、例えば、 Streptomyces mobaraensisとしては（財）発酵研究所（Institute f or Fermentation, Osaka,〒532- 8686 大阪市淀川区十三本町 2丁目 17-85)に寄託され、独立行政法人製品評価技術基盤機構（〒 292-0818千葉県木更津巿かずさ鎌足 2-5-8)に移管されている NBRC(IFO) Νο.13819Τ、アメリカンタイプカルチャーコレククシヨン (ATCC)から入手可能な ATCC15003、 ATCC25365、 ATCC27441, ATCC2 7446および ATCC29032を使用することが出来る。これらの菌株の変種および Zまたは変異株も、本発明の酵素を得るため、および/または、本発明の N ε -ァシル -L-リジン製造方法に使用することができる。

[0007] 本発明の新規な酵素を生産する微生物は、各微生物について発酵学の分野で公知の情報に従って培養することができる。使用する培地としては炭素源、窒素源、無機物およびその他の栄養素を適量含有する培地ならば、合成培地または天然培地の、ずれでも使用可能であり、液体培地または固体培地を用いて培養することができる。具体的には炭素源として、グルコース、フラクトース、マルトース、ガラクトース、澱粉、澱粉加水分解物、糖蜜、廃糖蜜等の糖、麦、米などの天然炭水化物、グリセ口ール、メタノール、エタノール等のアルコール、酢酸、ダルコン酸、ピルビン酸、クェン酸等の脂肪酸、ノルマルパラフィン等の炭化水素、グリシン、グルタミン、ァスパラギン等のアミノ酸等の一般的な炭素源より使用する微生物の資化性を考慮して、一種または二種以上選択して使用すればよい。窒素源としては、肉エキス、ペプトン、酵母エキス、大豆加水分解物、ミルクカゼイン、カザミノ酸、各種アミノ酸、コーンスティープリカ一、その他の動物、植物、微生物の加水分解物等の有機窒素化合物、アンモ二了、硝酸アンモ-ゥム、硫酸アンモ-ゥム、塩化アンモ-ゥム等のアンモ-ゥム塩、硝酸ナトリウム等の硝酸塩、尿素等の無機窒素化合物より使用微生物の資化性を考慮して、一種または二種以上選択して使用することができる。必要に応じて、無機塩として微量のマグネシウム、マンガン、カルシウム、ナトリウム、カリウム、銅、亜鉛等のリン酸塩、塩酸塩、硫酸塩、酢酸塩等より一種または二種以上を選択して使用することができる。また、さらに植物油、界面活性剤等の消泡剤を添加してもよい。使用する微生物に応じて、当業者は各培地成分の種類及び濃度を適切に選択および調節することが出来るであろう。

[0008] 培養は前記培地成分を含有する液体培地中で振盪培養、通気撹拌培養、連続培養などの通常の方法を用いて行うことができる。培養条件は、培地の種類、培養法により適宜選択すればよぐ使用する微生物が増殖し、本発明の酵素を産生できる条件であればよい。一般には、培養開始時の pHを 7に調節し、 25〜35°Cの温度条件下で微生物を培養することが望ましい。培養日数は、酵素の生産量、微生物の生育状態などを考慮すれば、 2リットルの三角フラスコを用いて培養を行う場合、一般には 3〜7日が好ましいが、特にこの期間に限定されるわけではない。このような条件で培養すれば、本発明の酵素が微生物によって産生され、培養物中に蓄積される。特に、ストレプトミセス属微生物、とりわけ Streptomyces mobaraensisの培養に適した培地および条件は当業者によく知られたものである。

ストレプトミセス属微生物、とりわけ Streptomyces mobaraensisを培養した場合、本酵素は菌体外に分泌されるので、培養終了後、菌体を瀘過、遠心分離等の方法で除去することによって粗酵素画分が容易に得られる。他の微生物を用いた場合であつて、細胞外に放出されない場合は、それらの微生物についてよく知られた方法により微生物細胞を破砕し、さらに、瀘過、遠心分離等の方法で細胞および細胞破砕物を除去することによって本発明の酵素を粗酵素画分として得ることが出来る。以下では、このようにして得られた本発明の酵素の粗酵素画分を「粗アミノアシラーゼ」と呼ぶことちある。

[0009] 得られた粗アミノアシラーゼは塩析、有機溶媒による分別沈殿、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル瀘過クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、色素クロマトグラフィ一、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ァフィ二ティークロマトグラフィー等のクロマトグラフィーゃ高速液体クロマトグラフィー (HPLC)および電気泳動を含む当業者によく知られたタンパク質精製のための方法を単独もしくは組み合わせて精製することができる。精製の各段階で、種々の純度の酵素が得られる。

本発明の酵素の活性は、 N ε -ァセチル -L-リジン加水分解活性を測定する方法に基づいて測定することが出来る。例えば、本発明の酵素の活性は、一定濃度の Ν ε - ァセチル -L-リジンを基質として 37°Cにて 30分間インキュベート（50 mMトリス塩酸緩衝液、 pH8.0)し、遊離した L-リジンを定量することによって測定することができる。なお、本発明の酵素 1U (ユニット）は、 4 mMの N ε -ァセチル -L-リジン溶液を基質として 37°Cにて 30分間インキュベート（50 mMトリス塩酸緩衝液、 pH8.0)し、遊離した L-リジンを酸性-ンヒドリン法により定量した場合に、 1時間あたり 1マイクロモルの N ε -ァセチル -L-リジンを加水分解するのに必要な酵素量と定義する。

本発明の酵素の精製は例えば以下のように行うことができる。 Streptomyces属微生物、例えば Streptomyces mobaraensisの培養終了後、遠心除菌し、さらにフィルター除菌により新規酵素が含有した上清を得る。その後、この上清を硫酸アンモ-ゥム (2 .8M)により沈殿分画後、 CMセフアデックス C-50、 DEAE-セフアデックス A-50イオン交換カラムクロマトグラフィー、ォクチルセファロース CL-4Bおよびフエ-ルセファロース CL-4Bカラムクロマトグラフィーを行うことによって、ポリアクリルアミドゲル電気泳動した場合にゲル上で単一バンドを呈する程度に本発明の酵素を精製することができる。

本発明の酵素は、 N ε -ァシル -L-リジンに作用し、 Ν ε -ァシル- D-リジンに対する反応性は非常に低い。ァシル基に対する特異性は広ぐ飽和または不飽和脂肪酸ァシル、更には芳香族基を含有するカルボン酸ァシルからなる Ν ε -ァシル -L-リジンを加水分解し、その逆反応も触媒する。逆反応については、 D-リジンの ε -ァミノ基に対する反応性は非常に低ぐ L-リジンの ε -ァミノ基に優先的に作用する。

本発明の別の側面は、本発明の酵素を用いた Ν ε -ァシル -L-リジンの製造方法である。この側面における一つの実施様態では、本発明の酵素を L-リジンまたはその塩、およびカルボン酸またはその塩と接触させ、それによつて、 Ν ε -ァシル -L-リジンが製造される。この実施態様における、本発明の酵素の反応条件は、上述した本発明の酵素の特性、特に至適温度および安定温度、並びに、至適 pHおよび安定 pHを含む適切な条件に従って決定することができる。特に、前記カルボン酸が比較的長鎖であって、前記接触が水溶性溶媒中で行われる場合、生成する N ε -ァシル -L-リジンは水に不溶性または難溶性であるため析出して反応系から容易に除去され、従つて、 ε -ァシル -L-リジンの合成反応力その逆反応である Ν ε -ァシルリジンの分解反応よりも顕著に優先的かつ効率よく進む。また、このような場合、 Ν ε -ァシル- L-リジンは速やかに水相から分離してくるので非常に容易に回収することができる。例えば、分離した Ν ε -ァシル -L-リジンを直接回収する、または、有機溶媒によって容易に Ν ε -ァシル -L-リジンを水性反応系から抽出して回収することができる。本発明によって Ν ε -ァシル -L-リジンを製造する場合、使用する比較的長鎖のカルボン酸は、例えば使用する水溶性溶媒に対する溶解性を基準として選択することができる。このカルボン酸は、炭素数が多いほど水溶性溶媒に対する溶解性が低下するので、例えば長鎖であるほど好ましい。より具体的には、本発明において使用するカルボン酸は、好ましくは炭素数 5以上、より好ましくは 8以上のァシル基を有するカルボン酸である。し力しながら、炭素数力以下のァシル基を有するカルボン酸を使用する場合であっても、本発明により Ν ε -ァシル -L-リジンを製造することが可能である。なお、本明細書において"水溶性溶媒"には水自身も含まれる。また、反応を水溶性溶媒中で行う場合であっても、別途油層 (有機溶媒層）を重層し、水溶性溶媒 Ζ有機溶媒の 2相反応とすることもできる。

本発明による Ν ε -ァシル -L-リジンの製造において使用される「酵素」は、本発明の酵素を生産する微生物の培養物 (場合により微生物細胞を破砕してもよ!、）、前記培養物から (必要により微生物の破砕後)遠心やろ過等により微生物または微生物破砕物を除去した培養液画分 (即ち、「粗アミノアシラーゼ」）、前記培養液力も種々の純度に部分精製された酵素 (例えば、硫安沈殿により部分精製された酵素）、または、 SDS-PAGEで単一バンドとなるまで高度に精製された酵素を含み、本発明の酵素活性を有する限りどのような形態であっても良い。

本発明の酵素を用いて Ν ε -ァシル- L-リジン製造を行う本発明の一態様においては、本発明の酵素 0.5U〜50U、好ましくは 1U〜20Uと、 L-リジンまたはその塩 50mM 〜2M、好ましくは 100mM〜1.0M、および、カルボン酸またはその塩 5mM〜2M、好ましくは 10mM〜150mMとを、適切な緩衝液、例えばトリス-塩酸緩衝液中、 pH6.5〜10. 5、好ましくは pH7.0〜10.0、特に好ましくは pH8.0〜9.0の pH範囲、 30°C〜70°C、好ましくは 45°C〜70°Cの温度範囲にて、 1〜48時間、好ましくは 2〜24時間、特に好ましくは 4〜24時間反応させる。適切な条件下では約 80%またはそれ以上の収率で N ε - ァシル -L-リジンを得ることが出来る。あるいは、基質である L-リジンまたはカルボン酸の一方が反応系に過剰量存在してヽてもよく、必要に応じて不足して！/ヽる基質を反応中に追カ卩してもよい。

[0012] 本発明の Ν ε -ァシル -L-リジンの製造方法においては前述したように、本発明の酵素により L-リジンとカルボン酸、またはそれらの塩との反応が触媒される。反応に使用されカルボン酸には、直鎖又は分枝した、飽和又は不飽和の脂肪酸、飽和または不飽和の側鎖を有する芳香族カルボン酸が含まれ、それらのカルボン酸は好ましくは炭素数が 5以上、より好ましくは炭素数が 8以上のァシル基を有するカルボン酸である。より具体的には、本発明の Ν ε -ァシル -L-リジンの製造方法において使用し得るカルボン酸は、オクタン酸、デカン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸、リノレン酸、安息香酸、ケィ皮酸などが好ましぐオクタン酸、ラウリン酸が特に好ましい。

[0013] 以下の実施例により本発明を更に説明するが、これらの実施例は本発明の範囲を制限するものと解してはならな、。

なお、下記実施例におけるパーセンテージは、特にことわらない限り「質量％」を意味する。

実施例

[0014] 実施例 1.本発明のアミノアシラーゼの産生および精製

可溶性澱粉 4.0%、ポリペプトン 2.0%、肉エキス 4.0%、リン酸水素カリウム 0.2%、硫酸マグネシウム 2.0%、 ρΗ7を含む培地 2L (リットル）を 5L容量のバッフル付き坂口フラスコに入れ、 Streptomyces mobaraensisの胞子溶液 0.1mlを接種し、 30°Cで 3日力ら 7日間培養した。計 2リットルの本培養を行い、培養終了後、遠心して（10000 X g、 3 0分間）除菌し、上清を回収した。得られた本酵素 (上清中）の総活性は、 2875U,比活性 0.096 U/mgであった。なお、タンパクの定量は色素結合法によって行った。

[0015] 本発明の酵素の活性は、一定濃度の N ε -ァセチル -L-リジンを基質として 37°Cにて 30分間インキュベート（50 mMトリス塩酸緩衝液、 pH8.0)し、遊離した L-リンを定量することによって測定した。本発明の酵素 1U (ユニット）は、 4 mMの N ε -ァセチル -L -リジン溶液を基質として 37°Cにて 30分間インキュベート (50 mMトリス塩酸緩衝液、 p H8.0)し、遊離した L-リジンを酸性-ンヒドリン法により定量した場合に、 1時間あたり 1 マイクロモルの N ε -ァセチル -L-リジンを加水分解するのに必要な酵素量と定義した

[0016] 得られた培養上清に最終濃度 60%になるように硫酸アンモ-ゥムを添加した。生じた沈殿物を 50 mM NaCl/25 mM Tris- HCl緩衝液 (pH 7.5)150 mlに溶解し、 3Lの 50 mM NaCl/25 mM Tris- HCl緩衝液 (pH 7.5)に対して透析を行った。このようにして得られた溶液中の酵素の総活性は 947 U、比活性は 0.43 U/mgであった。

この活性画分を 50mM NaCl/25mM Tric-HCl緩衝液 (pH7.5)で平衡化された DEAE -セフアデックス A-50カラム（ φ 26 X 350 mm)に供し、 50〜500 mMの NaCl濃度勾配により溶出した。その結果、活性画分は、 NaCl濃度が約 250 mMの条件で溶出された。総活性は 613 U、比活性は 2.1 U/mgであった。

[0017] この活性画分を 750 mM NaCl/25 mMトリス-塩酸バッファー（pH 7.5)で平衡化したォクチルセファロース CL- 4Bカラム（ φ 16 X 300 mm)、 750〜0 mMの NaCl濃度勾配に供した。その結果、 NaCl濃度が約 0 mMの条件で活性画分が溶出された。総活性は 456 U、比活性は 304 U/mgであった。

この活性画分を再度 500 mM NaCl/25 mM Tris- HCl緩衝液 (pH 7.5)で平衡化されたフエ-ルセファロース CL- 4Bカラム（ φ 16 X 150 mm)、 500〜0 mMの NaCl濃度勾配に供した。活性は 0 mM NaCl濃度の条件で溶出された。総活性は 169 U、比活性は 3370 U/mgとなった。

この活性画分をポリアクリルアミドゲル電気泳動に供したところ、分子量約 60kの単一バンドになる程度に精製されたことが分力つた（図 1)。各工程における精製の結果を表 1に示す。上述のように精製された本酵素をプロテインシークェンサ一に供したところ、 N末端にアミノ酸配列 SERPXTTLLRNGDVH (Xは不明）（配列番号 1)が存在することが明らかになつた。

表 1.

U :ユニット

[0019] 実施例 2.本発明のアミノアシラーゼの至適 pHおよび pH安定性

実施例 1に記載の方法によって得られた最終精製酵素を用いて、 N ε -ァシル -L-リジンを基質にした場合の酵素の至適 pHおよび pH安定性を測定した。

37°C、各種緩衝液 (pH3.8〜9.7 :トリス—塩酸緩衝液、 pH8.6〜10.6 : CAPS緩衝液）を用いて種々の pHにおける活性を測定した。その結果を図 2に示す。図 2中、活性は最高値における活性値を 100としたときの相対活性 (%)で表した。これらの結果から分かるように、本酵素の至適 pHは pH8.0〜9.0の範囲であった。

また、 pH安定性についても調べた。本発明の酵素は 37°C、 1時間のインキュベート中、 pH 6.5〜10.5の範囲で安定であった（図 3)。

[0020] さらに、前記精製酵素を用いて、 N ε -ァシル -L-リジンを基質としたときの酵素の反応至適温度と熱安定性を測定した。その結果を図 4及び図 5に示す。図 4および 5にぉヽて、最高値における活性値を 100としたときの相対活性 (%)を示した。

横軸に示された各温度で酵素液 (50mMトリス—塩酸緩衝液 (pH8.2) )の活性を測定して本酵素の至適温度を調べた（図 4)。また、温度安定性を調べるため、各温度で酵素液 (50mMトリス—塩酸緩衝液 (pH8.2) )を 60分間インキュベートした後、前述した活性測定法に従い、残存活性を求めた (図 5)。

至適温度は 55°Cであった。

温度安定性については、各温度で 60分間インキュベートした場合、少なくとも 40°C 付近まで活性の低下が認められず、 55°Cでも 80%の残存活性を有することが示された（図 5)。 N ε -ァシル- L-リジンに対して加水分解活性を示す Achromobacter pestife r由来の酵素は 37°Cにおいて、 1時間インキュベーション後に活性が 25%にまで低下することからも分力るように、熱に対して極めて不安定である力本酵素はそれよりもはるかに安定であることが示された。

[0021] 実施例 3.各種阻害剤の本発明のアミノアシラーゼの分解活性に与える影響

実施例 2に準じて得られた精製酵素を用い、前述した活性測定法を用いて各種阻害剤の分解活性に与える影響を比較した。その結果の一例を表 2に示す。表 2中、酵素活性は無添加の分解活性を 100とした相対活性 (%)で表した。これらの結果から、本発明の酵素は 0-フエナンスロリンにより活性が低下する、金属酵素であることが示された。

[0022] 表 2. 添加濃度 (mM) 相対活性（％)

無添カロ 100

PCMB 1 86. 1

ョードアセトアミド 1 83. 1

β メルカプトエタノール 10 87. 5

DTT 1 64. 7

GSH 1 80. 0

L-システィン 1 77. 6

EDTA 1 74. 6

0-フエナンスロリン 1 10. 3

[0023] 実施例 4.金属イオンの影響

0-フエナンスロリン溶液で透析した酵素を用いて、金属イオンの影響につ 1、て検討を行った。その結果を表 3に示す。表 3中、酵素活性は、無添加の分解活性を 100とした相対活性（％)で表した。コバルト、亜鉛、マンガン、カルシウム、カリウム、マグネシゥムを含む金属イオンによって活性が上昇し、特にコバルトイオンによって大きく活性が上昇することが示された。

[0024] 表 3. 金属イオン終濃度 (mM) 相対活性（％)

無添力 D 0 100

o

0. 1 140. 8

ZnS0₄ 0. 1 103. 3

MnS0₄ 0. 1 1 14. 1

CuS0₄ 0. 1 67. 2

uaC l ₂ 0. 1 1 10. 3

KC 1 0. 1 1 10. 2

MgS0₄ 0. 1 121. 1

FeS0₄ 0. 1 85. 3

[0025] 実施例 5.本発明のアミノアシラーゼの分子量

実施例 1に記載の方法によって得られた最終精製酵素を SDS—ポリアクリルアミド電気泳動に供したところ、単一のバンドを示し、その分子量は約 60kであった（図 1)。また、精製された本酵素をゲルろ過クロマトグラフィーおよび非変性- PAGEに供しても分子量 57〜60kを示した。従って、本酵素は単量体で存在すると考えられる。

[0026] 実施例 6.種々の. N-ァセチル -L-アミノ酸に対する本発明の酵素の反応性

本酵素の基質特異性を見るために、数種類の N-ァセチル -L-アミノ酸 (終濃度 4m M)に対する本発明の酵素の反応性を調べた。結果の一覧を表 4に示す。以下の表 4および 5中、 37°C、 50 mM Tris-HCl緩衝液（pH 8.2)中で、 1時間の反応において、酵素タンパク質 lmgあたりに加水分解された基質 (ァセチル- L-アミノ酸)の量（ μ mol e)を比活'性として示してある。

本酵素は、 N ε -ァセチル -L-リジンに高い加水分解活性を示した。し力しながら、 Ν a -ァセチル -L-リジンを除く N a -ァセチル -L-アミノ酸には活性を示さな力つた。すなわち、本酵素は N ε -ァセチル -L-リジンに対して極めて特異性の高い酵素であることが示された。

[0027] 表 4. Ν-ァセチル -L-アミノ酸に対する基質特異性基質比活性（μΐηοΐ/mg) (相対活性）

Net -ァセチノレー L Arg ND

Net -ァセチル -L-His ND

Net -ァセチノレー L Lys 70 (2.1%)

Ν ε -ァセチノレ _L_Lys 3370 (100%)

Net -ァセチノレ _L_Asn ND

Net -ァセチル -L-Gln ND

Net -ァセチノレ _L_Asp ND

Net -ァセチル -L-Glu ND

Net -ァセチル -L-Ala ND

Net -ァセチノレー L Cys ND

Net -ァセチル -L-Gly ND

Net -ァセチノレー L Leu ND

Net -ァセチノレー L Met ND

Net -ァセチノレー L Phe ND

Net -ァセチノレー L Pro ND

Net -ァセチル- L- Trp ND

Net -ァセチル- L- Tyr ND

Net -ァセチル -L-Val ND

ND:検出限界未満

実施例 7.本発明の酵素の基質特異性

各種ァシル基力なる N ε -ァシル -L-リジンの加水分解活性力基質特異性について検討したところ、本発明の酵素は Ν ε -ァセチル -L-リジンに最も高い比活性を有することがわかったが，クロロアセチル基やベンゾィル基を有する他の Ν ε -ァシル -L -リジンなどにも高い活性が認められた (表 5)。 Ν ε -ァシル -L-リジンに対して高い加水分解活性を示す Α.ぺスチフェルの酵素は Ν ε -ラウロイル -L-リジンに対してほとんど分解活性を示さないのに対して、本発明の酵素は Ν ε -ラウロイル -L-リジンに対しても分解活性を示した (表 5)。一方、本発明の酵素は、 Να-ラウロイル- L-リジンに対しては全く加水分解活性を示さなカゝつた。

表 5. Ν ε -ァシル- L-リジンのアシノレ基に：対する活性の比較

比活性 mo 1/ mg)

基質

A.ぺスチフ .エル酵素 S. モバラエンシス酵素

Ν ε -ァセチル-い Lys 2, 700* 3, 370

N -クロ口ァセチル- L- Lys 5, 300¹ 1, 030

N ε —ベン、グイノレ一し Lys 15, 000* 1, 380

N e -ォクタノィル- L- Lys 12, 500¹ 570

N ラウロイノレ—し— Lys 0.4 28

N t—ラウロイノレ—し— Lys 0 * Chibataら、（1970) Methods Enzymol. 19, 756- 562より。

[0030] 実施例 8. N ε -ラウロイル- L-リジンの生成

L-リジン塩酸塩（終濃度 1M)とラウリン酸（終濃度 15mM)に対して、 100 mM Tris塩酸緩衝液， pH 7.0)中で本発明の酵素 10Uを添加し、 45°Cで 3時間反応を行った。反応溶液を HPLC (YMC- Pack ODS 150 x 4.6 mm、溶出液： 35 %ァセトニトリル溶液 pH 2.8,流速; 0.8 mL/min)で分析した。合成収率は脂肪酸を基準として約 88%であつた。

反応が進行するにつれ、水に不溶である N ε -ラウロイル -L-リジンが析出してきた。析出した Ν ε -ラウロイル -L-リジンをろ過又は遠心分離により回収し、水洗することによって精製された Ν ε -ラウロイル- L-リジンが得られた。

[0031] 実施例 9.既知のカブサイシン分解合成酵素および本発明の酵素の Ν ε -ラウロイル -L-リジン合成能の比較

特開 2004-81107記載のカブサイシン分解合成酵素および本発明の酵素の Ν ε -ラゥロイル -L-リジン合成能を比較した。

15 mMラウリン酸と 200 mM- L-リジン塩酸塩を 100 mM Tris塩酸緩衝液（pH 7.5、 0. 5 mM CoCl )中で、カプサイシン分解合成酵素（10U/ml ; 37°C、 pH7.7にて 1時間に 1

2

マイクロモルのカプサイシンを加水分解する量を 1Uとする）および本発明の酵素（10 U/ml)を 45 °Cにて作用させ、 N ε -ラウロイルリジンの生成量を比較した（図 6)。 4 時間反応させた結果では、カブサイシン合成酵素を用いた場合は、 Ν ε -ラウロイル- L-リジン合成収率は 10%程度で、 N o; -ラウロイル -L-リジンもほぼ等量生成した。一方、本発明の酵素を用いた場合は、反応時間 3時間で N ε -ラウロイル -L-リジン合成の収率が 90%程度に達し、かつ、 N o; -ラウロイル -L-リジンの生成は検出されなかつた。

[0032] 本発明により、新規の酵素 (アミノアシラーゼ)、その製造方法、及び前記酵素による N ε -ァシル -L-リジン特異的分解および合成酵素の製造方法が提供され、該酵素を用いることにより、 Ν ε -ァシル -L-リジンを効率よく分解及び合成することが可能となる。

[0033] 参考文献 1.特開 2003- 210164

2.特開 2004-81107

図面の簡単な説明

[図 1]精製された本発明の酵素を還元剤 2-メルカプトエタノール存在下で SDS-PAGE を行い、クマシ一ブリリアントブルー染色した結果である。レーン 1、 7 :分子量マーカ一、レーン 2 :培養上清、レーン 3 : 60%硫安沈殿画分、レーン 4 : DEAEセフアデックス A-50カラムクロマトグラフィー溶出画分、レーン 5 :ォクチルセファロース CL-4B力ラムクロマトグラフィー溶出画分。レーン 6：フエ-ルセファロース CL-4Bカラムクロマトグラフィー溶出画分。矢印は本発明の酵素の位置を示す。

[図 2]本発明の酵素の至適 pHプロファイルを示した図である。

[図 3]本発明の酵素の pH安定性プロファイルを示した図である。

[図 4]本発明の酵素の至適温度プロファイルを示した図である。

[図 5]本発明の酵素の熱安定性プロファイルを示した図である。

[図 6]本発明の酵素と既知の酵素（特開 2004-81107)の N ε -ラウロイルリジンの合成能および特異性を比較した図である。（Α)カブサイシン分解合成酵素、（Β)本発明の酵素。いずれも縦軸は収率（％)、横軸は反応時間（時間）である。國は Ν ε -ラウ口ィル- L-リジン、參は N a -ラウロイル- L-リジンを表す。

Claims

請求の範囲

[1] 以下の性質を有する酵素：

1) Ν ε -ァシル -L-リジンに作用し、カルボン酸とリジンを遊離させる反応、および、その逆反応を触媒する；

2) L-Lysの ε —ァミノ基に作用する；

3) Ν ε -ァセチル- L-リジンを基質とした場合に、加水分解反応の至適 pH力 37°Cにおいて、トリス一塩酸緩衝液中で、 8.0〜9.0の範囲にある；

4)トリス—塩酸緩衝液中で、 37°C、 1時間のインキュベートした場合、 pH 6.5〜10.5の範囲で安定である；

5) Ν ε -ァセチル -L-リジンを基質としたときの加水分解反応における至適温度力トリス—塩酸緩衝液 (PH8.2)中で、 55°C付近である；

6)トリス—塩酸緩衝液 (pH8.2)中、 40°C、 60分処理において失活せず、 55°C、 60分処理後の残存活性は 75〜85%である；

7) 0-フエナンスロリンにより阻害を受ける。

8)コバルトイオンにより活性が増加する；

9)分子量は SDS-ポリアクリルアミド電気泳動測定によれば約 60kである；

10) N末端にアミノ酸配列 SERPXTTLLRNGDVH (Xは不明）が存在する。

[2] ストレプトミセス属に属する微生物力も得られる、請求項 1記載の酵素。

[3] ストレプトミセス属に属する微生物力ストレプトミセス 'モバラェンシスである、請求項 2に記載の酵素。

[4] 請ストレプトミセス属に属する微生物を培養し、前記微生物の培養物から請求項 1 記載の酵素を分離、回収することを特徴とする前記酵素の製造方法。

[5] ストレプトミセス属に属する微生物がストレプトミセス 'モバラェンシスである、請求項 4記載の製造方法。

[6] 請求項 1〜3のいずれか 1項記載の酵素を、カルボン酸またはその塩および L-リジンまたはその塩と接触させ、それによつて N ε -ァシル -L-リジンを生成させることを含む、 Ν ε -ァシル -L-リジンの製造方法。

[7] カルボン酸が、炭素数 5以上のァシル基を有するカルボン酸である、請求項 6記載の方法。

[8] カルボン酸がオクタン酸、デカン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸、リノレン酸、安息香酸、ケィ皮酸力なる群より選ばれる、請求項 6記載の製造方法。

[9] カルボン酸がラウリン酸であり、 N ε -ァシル -L-リジンが Ν ε -ラウロイルリジンである、請求項 6記載の製造方法。

[10] 接触が水溶性溶媒で行われることを特徴とする、請求項 6〜9のいずれか 1項記載の製造方法。