JPH05199883A - リコンビナントトランスグルタミナーゼ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】 トランスグルタミナーゼのアミノ酸配列をコ
ードする塩基配列を含むＤＮＡを提供する。さらに、上
記ＤＮＡを組込んだ発現分泌ベクター、該発現分泌ベク
ターにより形質転換された形質転換体、及び該形質転換
体を培養することを特徴とするトランスグルタミナーゼ
活性を有するタンパク質の製造方法を提供する。 【効果】 遺伝子工学的手法により、トランスグルタミ
ナーゼの効率的な大量生産が可能になる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、トランスグルタミナー
ゼをコードするＤＮＡ遺伝子、該遺伝子を組込んだプラ
スミド、該プラスミドが導入された形質転換体及び該形
質転換体を培養することを特徴とする、トランスグルタ
ミナーゼの製造方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】トランスグルタミナーゼ（以下、「ＢＴ
Ｇ」と略する。）は、ペプチド鎖内にあるグルタミン残
基のγ−カルボキシアミド基のアシル転移反応を触媒す
る酵素である。

【０００３】このトランスグルタミナーゼは、アシル受
容体としてタンパク質中のリジン残基のε−アミノ基が
作用すると、分子内及び分子間にε−（γ-Gln）−Lys
架橋結合が形成される。また水がアシル受容体として機
能するときは、グルタミン残基が脱アミド化されグルタ
ミン酸残基になる反応を進行させる酵素である。

【０００４】トランスグルタミナーゼは、ゲル状食品、
ゲル状化粧料をはじめとしてヨーグルト、ゼリー及びチ
ーズなどを製造する際に用いられている（特公平１-503
82号）。

【０００５】更に、熱に安定な、マイクロカプセルの素
材、固定化酵素等の担体などを製造する際にも利用され
ている。

【０００６】トランスグルタミナーゼはこれまで動物由
来のものが知られている。例えばモルモットの肝臓［Co
nnellan, et al., Journal of Biological Chemistry
246巻４号，1093〜1098頁(1971)］及び哺乳動物の臓
器，血液に広く分布し［Folk et al., Advances in Enz
ymology 38巻， 109〜191 頁（1973）；Folk et al., A
dvances in Protein Chemystry 31巻， 1〜133 頁(197
7)］、その酵素の特徴も研究されている。

【０００７】更に、ストレプトベルチシリウム属の菌か
ら、上記動物由来のトランスグルタミナーゼとは異な
り、カルシウム（Ｃａ²⁺）非依存性のトランスグルタミ
ナーゼが発見されている。同属菌の具体例としては、ス
トレプトベルチシリウム・グリセオカルネウム(Strepto
verticillium griseocarneum) IFO 12776 ，ストレプト
ベルチシリウム・シナモネウム・サブ・エスピー・シナ
モネウム(Streptoverticillium cinnamoneum sub sp. c
innamoneum) IFO 12852,ストレプトベルチシリウム・モ
バラエンス（Streptoverticillium mobaraense）IFO 13
819 等があげられている（特開昭64-27471号参照）。

【０００８】

【発明が解決しようとする課題】従来、トランスグルタ
ミナーゼは動物、菌類等から製造されているため、供給
量、供給費用等の点で改善すべき点が多くあった。

【０００９】本発明者等は、上記課題を解決すべく鋭意
研究の結果、トランスグルタミナーゼをコードするＤＮ
Ａを精製・単離し、その塩基配列を決定することに成功
した。かかる成果に基づいて、遺伝子工学的手法によ
り、大腸菌等の微生物を用いて該ＤＮＡを発現させ、ト
ランスグルタミナーゼの効率的な大量生産への途を開い
たものである。

【００１０】

【課題を解決するための手段】従って、本発明は、トラ
ンスグルタミナーゼをコードするＤＮＡを提供するもの
である。

【００１１】即ち、アミノ酸の一文字記号で表したと
き、下記の第１表のアミノ酸配列をコードする塩基配列
を含むＤＮＡを提供するものである。

【００１２】

【表６】 かかるＤＮＡは、遺伝コドンの縮重を考慮すると、種々
の塩基配列を包含し得るものである。

【００１３】これらの塩基配列は、遺伝子発現系の諸要
素、例えば宿主細胞の種類等に応じた優先コドン等によ
って当業者が容易に選択し得るものである。

【００１４】その一具体例として、大腸菌又は酵母を宿
主細胞として用いる発現系に適した塩基配列の一例を第
２表に示す（配列番号１）。

【００１５】

【表７】第 ２ 表 GAT TCT GAT GAC AGA GTC ACT CCA CCA GCT GAA CCA TTG GAT AGA ATG CCA GAT CCA TAC AGA CCA TCT TAC GGT AGA GCT GAA ACT GTT GTC AAC AAC TAC ATT AGA AAG TGG CAA CAA GTC TAC TCT CAC AGA GAT GGT AGA AAG CAA CAA ATG ACT GAA GAA CAA AGA GAA TGG TTG TCT TAC GGT TGT GTT GGT GTT ACT TGG GTT AAC TCT GGT CAA TAC CCA ACT AAC AGA TTG GCT TTC GCT TCT TTC GAT GAA GAT AGA TTC AAG AAC GAA TTG AAG AAC GGT AGA CCA AGA TCC GGT GAA ACT AGA GCT GAA TTC GAA GGT AGA GTT GCT AAG GAA TCT TTC GAT GAA GAA AAG GGT TTC CAA AGA GCT AGA GAA GTT GCT TCT GTT ATG AAC AGA GCT CTA GAA AAC GCT CAC GAT GAA TCT GCT TAC TTG GAT AAC TTG AAG AAG GAA TTG GCC AAC GGT AAC GAT GCT TTG AGA AAC GAA GAT GCT AGA TCC CCA TTC TAC TCT GCT TTG AGA AAC ACT CCA TCT TTC AAG GAA AGA AAC GGT GGT AAC CAC GAT CCA TCC AGA ATG AAG GCT GTT ATT TAC TCT AAG CAC TTC TGG TCT GGT CAA GAT AGA TCT TCT TCT GCT GAT AAG AGA AAG TAC GGT GAT CCA GAT GCT TTC AGA CCA GCT CCA GGT ACC GGT TTG GTC GAC ATG TCC AGA GAT AGA AAC ATT CCA AGA TCC CCA ACT TCT CCA GGT GAA GGT TTC GTC AAC TTC GAT TAC GGT TGG TTC GGT GCT CAA ACT GAA GCT GAT GCT GAT AAG ACT GTT TGG ACC CAT GGT AAC CAC TAC CAC GCT CCA AAC GGT TCT TTG GGT GCT ATG CAC GTC TAC GAA TCT AAG TTC AGA AAC TGG TCT GAA GGT TAC TCT GAT TTC GAT AGA GGT GCT TAC GTT ATT ACT TTC ATT CCA AAG TCT TGG AAC ACT GCT CCA GAC AAG GTC AAG CAA GGT TGG CCA 第１表に示したＤＮＡは従来公知の化学的合成法等によ
り調製することができる。

【００１６】本発明は更に、第１表に示したアミノ酸配
列をコードするＤＮＡの５′末端に、以下の第３表に示
す、シグナルペプチドを含むアミノ酸配列の全部又は一
部をコードする塩基配列を含むＤＮＡをも提供するもの
である。

【００１７】

【表８】 上記ＤＮＡも遺伝子コドンの縮重により種々の塩基配列
を包含し得るものである。一具体例としては、第２表に
示した塩基配列の５′末端に以下に示す塩基配列（配列
番号２）を有するものが挙げられる。

【００１８】

【表９】 AAGAGAAGATCTCCAACTCCAAAGCCAACTGCTTCTAGAAGAATGACTTCTAGACACCAA AGAGCTCAAAGATCTGCTCCAGCTGCTTCTTCTGCTGGTCCATCTTTCAGAGCTCCA また、その取得方法も化学的合成法も含めて種々のもの
が考えられる。例えば、ＰＣＲ（Polymerase Chain Rea
ction ）法により得られたＤＮＡ断片をプローブとして
用いて放線菌のゲノムＤＮＡ等からクローニングするこ
とにより得ることができる。このようにして得られたト
ランスグルタミナーゼの構造遺伝子及び５′末端上流部
分を含むＤＮＡの塩基配列の一例を第４表に示す。

【００１９】

【表１０】 第 ４ 表 ATGCGCTATA CGCCGGAGGC TCTCGTCTTC GCCACTATGA GTGCGGTTTA TGCACCGCCG GATTCATGCC GTCGGCCGGC GAGGCCGCCG CCGACAATGG CGCGGGGGAA GAGACGAAGT CCTACGCCGA AACCTACCGC CTCACGGCGG ATGACGTCGC GACATCAACG CGCTCAACGA AGCGCTCCGG CCGCTTCGAG CGCCGGCCCG TCGTTCCGGG CCCCCGACTC CGACGACAGG GTCACCCCTC CCGCCGAGCC GCTCGACAGG ATGCCCGACC CGTACCGTCC CTCGTACGGC AGGGCCGAGA CGGTCGTCAA CAACTACATA CGCAAGTGGC AGCAGGTCTA CAGCCACCGC GACGGCAGGA AGCAGCAGAT GACCGAGGAG CAACGGGAGT GGCTGTCCTA CGGCTGCGTC GGTGTCACCT GGGTCAATTC GGGTCAGTAC CCCACGAACA GACTGGCCTT CGCGTCCTTC GACGAGGACA GGTTCAAGAA CGAGCTGAAG AACGGCAGGC CCCGGTCCGG CGAGACGCGG GCGGAGTTCG AGGGCCGCGT CGCGAAGGAG AGCTTTGATG AAGAGAAGGG GTTCCAGCGG GCGCGTGAGG TGGCGTCCGT GATGAACAGG GCCCTGGAGA ACGCCCACGA CGAGAGCGCT TACCTCGACA ACCTCAAGAA GGAACTGGCG AACGGCAACG ACGCCCTGCG CAACGAGGAC GCCCGTTCCC CGTTCTACTC GGCGCTGCGG AACACGCCGT CCTTTAAGGA GCGGAACGGA GGCAATCACG ACCCGTCCAG GATGAAGGCC GTCATCTACT CGAAGCACTT CTGGAGCGGC CAGGACCGGT CGAGTTCGGC CGACAAGAGG AAGTACGGCG ACCCGGACGC TTTCCGCCCG GCCCCCGGGA CCGGCCTGGT CGACATGTCG AGGGACAGGA ACATTCCGCG CAGCCCCACC AGCCCCGGTG AGGGATTCGT CAATTTCGAC TACGGCTGGT TCGGCGCCCA GACGGAAGCG GACGCCGACA AGACCGTCTG GACCCACGGA AATCACTATC ACGCGCCCAA TGGCAGCCTT GGTGCCATGC ATGTATACGA GAGCAAGTTC CGCAACTGGT CCGAAGGTTA CTCCGACTTC GACCGCGGAG CCTATGTGAT CACCTTCATC CCCAAGAGCT GGAACACCGC CCCCGACAAG GTAAAGCAGG GCTGGCCG 本発明はまた、トランスグルタミナーゼの発現分泌用に
使用することのできるベクターを提供するものである。

【００２０】かかるベクターは、所望の発現系に応じた
公知の発現用ベクターに、第１表ないし第４表に示す塩
基配列を含むＤＮＡを従来公知の方法によって挿入する
ことにより調製することが可能である。

【００２１】本発明の発現分泌ベクターの調製に用いる
ことのできる公知の発現ベクターとしては、例えば大腸
菌宿主用として PIN−III −ompA₂ 等を挙げることがで
きる。 PIN−III −ompA₂ に本発明のＤＮＡを組込んで
得られた本発明の発現分泌ベクターの一具体例としては
pOMPA-BTGがある。さらに、放線菌宿主用として、pIJ7
02、酵母宿主用として、pNJ1053 が挙げられる。これら
の発現ベクターに本発明のＤＮＡを組み込んで得られた
本発明の発現分泌ベクターの具体例としてはpIJ702-BT
G、pNJ1053-proBTG、pNJ1053-BTG がある。

【００２２】更に、本発明は、トランスグルタミナーゼ
遺伝子を担持する発現分泌ベクターを導入することによ
り得られた形質転換された種々の形質転換体に関する。

【００２３】該形質転換体となり得る細胞には、大腸菌
及び放線菌等の原核細胞並びに酵母等の真核細胞が考え
られる。

【００２４】大腸菌の一具体例としてはＪＡ221 株（hs
dM⁺ , trpE5, leuB6, lacY, recA／F′, lacI^q ,lac⁺ ,
pro⁺ ）がある。

【００２５】かかる大腸菌ＪＡ221 株に本発明のベクタ
ーである pOMPA-BTGを導入することにより形質転換して
得られた形質転換体AJ12569 は、平成２年９月28日付で
工業技術院微生物工業技術研究所に寄託されている（受
託番号FERM BP-3558）。

【００２６】放線菌の一具体例としては Streptomyces
lividans 3131 からチオストレプトン感受性株として得
た Streptomyces lividans 3131-TSがある。

【００２７】かかるStreptomyces lividans 3131-TS に
本発明のベクターであるpIJ702-BTGを導入することによ
り形質転換して得られた形質転換体Streptomyces livid
ansAKW-1 は、平成３年９月３０日付で工業技術院微生
物工業技術研究所に寄託されている（受託番号FERM BP-
3586）。

【００２８】酵母の一具体例としては Saccharomyces c
erevisiae KSC22-1C（MATa，ssl1，leu2， his^- ，ura
3）がある。

【００２９】かかる Saccharomyces cerevisiae KSC 22
-1C に本発明のベクターであるpNJ1053-proBTGを導入す
ることにより形質転換して得られた形質転換体Saccharo
myces cerevisiae AJ 14669 は、平成３年９月３０日付
で工業技術院微生物工業技術研究所に寄託されている
（受託番号FERM BP-3585）。

【００３０】最後に、本発明は、上記の形質転換体を培
養することにより、トランスグルタミナーゼ活性を有す
るタンパク質を製造する方法に関する。

【００３１】培養条件は、形質転換体の種類に応じて当
業者が適宜決定し得るものである。また必要に応じてＩ
ＰＴＧ等の物質を培地に添加することにより、所望遺伝
子の発現を誘導することもできる。発現分泌された該タ
ンパク質は、培養上清及び宿主細胞のペリプラズム更に
は細胞質中から従来公知の種々の方法で単離・精製する
ことが可能である。

【００３２】以下、実施例を参照しつつ、本発明を更に
詳しく説明する。

【００３３】

【実施例】実施例１：ＢＴＧ遺伝子のクローニング （１）菌体の取得 放線菌Streptoverticillium sp. を以下の培地条件で30
℃で５日間培養した。

【００３４】［ＧＰ培地］ グリセロール 0.4 wt％ ペプトン 0.1 wt％ イースト・エキス 0.4 wt％ 硫酸マグネシウム 0.05wt％ リン酸一カリウム 0.2 wt％ リン酸二ナトリウム 0.5 wt％ グリシン 0.1 wt％／１ｌ （２）菌体からのＤＮＡの取得 上記条件下で培養したのち、培養培地 400mlを遠心分離
（12,000ｇ，４℃，10分間）し、これを50mM Tris-HCl
(pH8.0)-5mM EDTA-50mM NaCl(以下「ＴＥＳ」とい
う。）に懸濁した。次のこの懸濁液を、遠心分離（1,10
0 ｇ，室温，10分間）し、上清を捨てた。得られた沈殿
（菌体）を２mg／mlのリゾチーム（シグマ社）を含むＴ
ＥＳ 5mlに懸濁し、これを37℃で１時間インキュベート
した。インキュベート後、これをアセトン−ドライアイ
ス中につけ急激に凍らせ、42mlの100mMTris-HCl(pH9.0)
-1% SDS-100mM NaCl （以下「Tris-SDS」という。）を
加え、よく懸濁した。更にこれを60℃で20分間インキュ
ベートし、アセトン−ドライアイス中に10分間つけた。
次にこれを再度60℃でインキュベートしたのち、これを
Tris-SDSで飽和したフェノールで抽出した。この抽出を
２回繰り返して、得られたものに２倍容量のエタノール
を加えた。このとき、菌体のＤＮＡは糸状となるので、
これをガラス棒で巻き取り回収した。回収したＤＮＡを
80％エタノールで１回洗浄し、アスピレーターとデシケ
ーターを用いて乾燥した。乾燥後ＤＮＡを10mM Tris-HC
l(pH8.0)-1mM EDTA （以下「ＴＥ」という。） 5mlに溶
かした。

【００３５】次にＤＮＡサンプル中のＲＮＡを分解し除
いた。ＲＮＡの分解はＤＮＡを 5mlのＴＥに溶かしたサ
ンプルに、RNase Ａ（シグマ社） 1mg／ml及びRNase TI
（ベーリンガーマンハイム社）2000 u／mlを含む溶液を
0.5ml加え37℃で30分間インキュベートすることにより
行なった。インキュベートの後、サンプルをＴＥ飽和フ
ェノール・クロロホルムとクロロホルムで１回ずつ抽出
し、最後に得られた水層に1/10容量の３Ｍ酢酸ナトリウ
ム（pH 5.2）溶液と２倍容量のエタノールを加え、−80
℃に30分間おいた。その後、遠心分離し（12,000ｇ、４
℃、15分間）により沈殿を回収し、沈殿を70％エタノー
ルで洗浄し、乾燥させた。これをＴＥ 4mlに溶かし以下
の実験に使用した。最終的に得られたＤＮＡ量は約４mg
であった。

【００３６】（３）ＰＣＲ(Polymerase Chain Reactio
n) 法によるＤＮＡ断片の取得 ＢＴＧ遺伝子を含む特定のＤＮＡ領域を、最近開発され
てきたＰＣＲ法によって、単離増幅した（Saiki,R.F.et
al. (1985) Science 230, 1350-1354, Mullis,K.B. 及
び Faloona,F.A. (1987) Methods in Enzymology,155,
335-350）。

【００３７】(ｉ) ＰＣＲ法に用いたPrimer DNAの合成 大阪大学蛋白質研究所、下西研究室において決定され
た、ＢＴＧ蛋白のアミノ酸配列の 117番目のフェニルア
ラニンから 123番目のフェニルアラニンに対応する塩基
配列を予想し、ＤＮＡを合成した。（ＤＮＡ合成は、ミ
リジェン・バイオサーチ社のサイクロンプラスＤＮＡ合
成機を使用した。） このＤＮＡをＰＣＲのPrimer #1 とした。

【００３８】Primer #1 の配列を以下に示す。

【００３９】

【表１１】

【００４０】次に 325番目のリジンから 331番目のプロ
リンに相当する塩基配列を予想し、同様にＤＮＡを合成
した。このＤＮＡをＰＣＲのPrimer #2 とした。Ｐｒｉ
ｍｅｒ ＃２の配列を以下に示す。

【００４１】

【表１２】

【００４２】合成したＤＮＡはそれぞれ２０μM の濃度
になるようにＴＥに溶解した。

【００４３】(ii) ＰＣＲ法によるＤＮＡ断片の増幅 反応は、（株）パーキンエルマージャパン社のGene Amp
^TM kitを用い、同社のＤＮＡ Thermal Cycler（ＤＮＡ
増幅装置）により行なった。反応溶液の組成は以下の通
りである。

【００４４】

【表１３】 （終濃度） Ｈ₂ Ｏ 53.5μｌ [10x] Reaction buffer 10μｌ [1x] dNTPs, Mix 1.25mM 16μｌ 200 μM (i) のPrimer #1 5μｌ 1.0 μM (i) のPrimer #2 5μｌ 1.0 μM * template(BTG DNA 0.5μｇ) 10μｌ AmpliTaq^TMDNA polymerase 0.5μｌ 2.5u/assay 計 100 μｌ * （２）で得たＤＮＡを 0.5μｇ／10μｌになるようにTEにとかしたもの。

【００４５】上記の反応液 100μｌを混合し、ミネラル
オイル（Sigma 社） 100μｌを加えた。次に反応液の入
ったチューブをＤＮＡ thermal Cycler にセットし、以
下の条件で反応を行なった。

【００４６】９５℃ １分 ３７℃ ２分 ７２℃ ３分 この条件下で反応を35サイクル行なった後、更に72℃で
７分間インキュベートした。

【００４７】(iii) 増幅されたＤＮＡの回収 反応後、ミネラルオイルを除き、１００μｌのクロロホ
ルムを加え、混合し、15,000回転／分、２分間の遠心分
離（トミー精工社製）を行ない、上清を１００μｌ回収
した。このうち10μｌを用い、 1.5％アガロース電気泳
動で回収されたＤＮＡのサイズと量を確認した。その結
果645 bpのＤＮＡ断片が、約２μｇ増幅されていること
がわかった。

【００４８】残りの90μｌを 1.5％低融点アガロース電
気泳動にかけ、645 bpに相当するバンドを切り出し、65
℃でとかした後等量のフェノールを加え混合し、遠心
後、水層部分をさらにフェノール／クロロホルム及びク
ロロホルムで順次処理した後、水層に３Ｍ酢酸ナトリウ
ムを 8％になるように加え、エタノールを２倍量加え、
−80℃で15分間置いた。次に15,000回転／分、10分間４
℃の遠心後、沈殿を20μｌの水にとかした。この操作で
約１μｇのＤＮＡ断片が回収された。

【００４９】（４）ＰＣＲで増幅されたＤＮＡの構造確
認 上記のＰＣＲで増幅されたＤＮＡ断片がＢＴＧ遺伝子の
一部であるかどうかを確認するために、このＤＮＡ断片
0.4μｇを用いてダイレクトシーケンスを行なった。そ
の方法は下記に示すもので、シーケンスのプライマーは
ＰＣＲに用いた前述の#1を用いた。

【００５０】−準備− 1. ＤＮＡシークエンシング用試薬：基本的にはdideoxy
法を用いた。米国USB 社のシークエンス用キットであ
るSequenase^TM（version 2.0）を使用した。

【００５１】2. シークエンシングのためのプライマー
の標識：ＰＣＲ反応に用いたprimer #1 を2 pmol用意
し、T4 Kinase(TOYOBO) で５′末端を［³²Ｐ］で標識し
た（比活性3000Ci/mmol の［γ−³²Ｐ］ＡＴＰを用い
た）。標識したプライマーから適当なミニカラムなどを
通してフリーの［γ−³²Ｐ］ＡＴＰを除いた。

【００５２】3. シークエンス反応液（3.25μｌ中）：S
equenase Kit を用いて４本のチューブに各Ｇ，Ａ，
Ｔ，Ｃ反応用のものを別々に調製した。

【００５３】2.5 μｌ G,A,T,C,termination mix 0.38μｌ ５×buffer 0.22μｌ 0.1M DTT 0.15μｌ Sequenase （２ユニット） −反応− 1. 0.4μｇの増幅したＤＮＡと2 pmolの［³²Ｐ］標識
したプライマーを12μｌのＴＥに溶かし、95℃で５分間
熱変性した後、氷水中で急冷した。

【００５４】2. 直ちに(1) の溶液を 2.8μｌずつ４本
のチューブに取り、3.25μｌの各シークエンス反応液を
加えて37℃で10分間インキュベートした。４μｌの反応
停止液を加え、75〜80℃で２分間加熱した後シークエン
スゲルで泳動した。

【００５５】ダイレクトシーケンスの結果、この断片に
ＢＴＧのアミノ酸配列の 129番目のバリンから 149番目
のアスパラギンまでのアミノ酸配列をコードする塩基配
列が見出された。したがって、この断片はＢＴＧ遺伝子
の一部と推定された。

【００５６】（５）ＰＣＲで増幅されたＤＮＡ断片のpU
C19 へのサブクローニング 次にＰＣＲで増幅されたＤＮＡ断片をpUC19 のSmaIサイ
トへサブクローニングした。そのためにまずＰＣＲで得
られたＤＮＡ断片の両末端を平滑化した。平滑化反応は
Blunting kit（宝酒造）を用いて下記のように行なっ
た。

【００５７】1. ミクロ遠心チューブに以下の反応液を
調製し、全量を９μｌにした。

【００５８】ＤＮＡ断片 ８μｌ(0.4μｇ) 10×buffer １μｌ 2. ＤＮＡ末端のアニーリングを防ぐため、70℃で５分
間保温した後、37℃の恒温槽に移した。

【００５９】3. T4 DNA polymerase を１μｌ加え、ピ
ペッティングにより穏やかに混和した。

【００６０】4. 37℃で５分間保温した。

【００６１】5. DNA dilution buffer を最終濃度１μ
ｇ DNA／50μｌになるように加え、ボルテックスで激し
く撹拌した。

【００６２】得られたＤＮＡ断片を pUC19をSmaIで切断
したものと、ライゲーションを行ない、大腸菌ＤＨ５α
を、5 −ブロモ−1 −クロロ−3 −インドリル−β−Ｄ
−ガラクトシド（Ｘ-gal）及びイソプロピル−β−Ｄ−
チオガラクトシド（IPTG）存在下で形質転換した。アン
ピシリン耐性白色コロニーから得られた、ＰＣＲで増幅
されたＤＮＡ断片がSmaIサイトに組み込まれたプラスミ
ドを pUC 19 BTG と名付け以下の実験に使用した。なお
ライゲーションには、ライゲーションキット（宝酒造）
を用いた。

【００６３】次に、ＰＣＲで増幅されたＤＮＡ断片のよ
り広範囲の塩基配列を知るために、上記pUC19BTGを鋳型
として、ＤＮＡシーケンスを行なった。ＤＮＡシーケン
スは7-deaza dGTP仕様のシーケネースキット（ＵＳＢ
社）を用いる従来公知の方法で行なった。その結果、以
下の第５表に示す564bp の塩基配列が明らかとなった。

【００６４】

【表１４】 第 ５ 表 TCCGTGATGA ACAGGGCCCT GGAGAACGCC CACGACGAGA GCGCTTACCT CGACAACCTC AAGAAGGAAC TGGCGAACGG CAACGACGCC CTGCGCAACG AGGACGCCCG TTCCCCGTTC TACTCGGCGC TGCGGAACAC GCCGTCCTTT AAGGAGCGGA ACGGAGGCAA TCACGACCCG TCCAGGATGA AGGCCGTCAT CTACTCGAAG CACTTCTGGA GCGGCCAGGA CCGGTCGAGT TCGGCCGACA AGAGGAAGTA CGGCGACCCG GACGCTTTCC GCCCGGCCCC CGGGACCGGC CTGGTCGACA TGTCGAGGGA CAGGAACATT CCGCGCAGCC CCACCAGCCC CGGTGAGGGA TTCGTCAATT TCGACTACGG CTGGTTCGGC GCCCAGACGG AAGCGGACGC CGACAAGACC GTCTGGACCC ACGGAAATCA CTATCACGCG CCCAATGGCA GCCTTGGTGC CATGCATGTA TACGAGAGCA AGTTCCGCAA CTGGTCCGAA GGTTACTCCG ACTTCGACCG CGGAGCCTAT GTGATCACCT TCATCCCCAA GAGC （６）ライブラリーの作製 1. Streptoverticillium sp. 染色体ＤＮＡの部分分解 ・ 染色体DNA 24μｇ、BamHI 10×buffer（TOYOBO10×
High buffer ）60μｌに滅菌水を加えTotal 594 μｌと
し、混合した。

【００６５】・ 37℃で５分間予熱した。

【００６６】・ BamHI(TOYOBO製）を 6μｌ加え、混合
し、37℃、10分間反応した。

【００６７】・ 65℃、15分間熱処理し、酵素を失活さ
せた。

【００６８】2. クローニング（STRATAGENE製EMBL3 CLO
NING KIT 使用） i）ligation ・ 上記ＤＮＡ部分分解物25μｌをエタノール沈殿し、
2.5μｌのＴＥに溶解した。

【００６９】・ 1.0μｌ EMBL3 predigested arms (1
μｇ／μｌ), 0.5μｌ 10×ligationbuffer, 0.5μｌ
10mM ATP(pH 7.5), 0.5μｌ T4 DNA ligase(8 units／
μｌ,Boehringer Mannheim 製）を加え混合し、４℃で
一晩反応した。

【００７０】10×ligation buffer 500mM Tris-HCl, pH 7.5 70mM MgCl₂ 10mM DTT ii）Packaging （STRATAGENE製GIGAPACK II GOLD PACKA
GING EXTRACT使用） 1. 適当量の抽出物を−70℃のフリーザーからドライア
イス上に移し、同時に、音波抽出物を溶かし始めた。

【００７１】2. 指の間で、調度融け始めるまで凍結／
融解抽出物を暖めた。

【００７２】3. 凍結／融解抽出物に上記ＤＮＡ溶液４
μｌ(1.6μｇ含有) を加え氷上に置いた。

【００７３】4. ＤＮＡを含む凍結／融解抽出物に速や
かに音波抽出物15μｌを加えた。

【００７４】5. 泡立てないように撹拌し良く混合し
た。

【００７５】6. 4,000 ｇで５秒間遠心し、内容物全て
をチューブの底に集めた。

【００７６】7. 室温（22℃）で２時間インキュベート
した。

【００７７】8. ファージ希釈用バッファー 500μｌを
加えた。

【００７８】9. クロロホルム20μｌを加え、静かに混
合した。10. 4,000 ｇで５秒間遠心し、デブリスを沈降
させた。

【００７９】11. 上清を集め４℃で保存した。

【００８０】ファージ希釈用バッファー（１ｌ当り） 5.8 ｇ NaCl 2.0 ｇ MgSO₄ 50ml 1M Tris-HCl, pH7.5 5ml 2% gelatin autoclave iii) plating 1. 大腸菌P2392 をＴＢ培地に接種した。

【００８１】P2392 の性状はhsd R514(rk-, mk+) sup E
44, sup F58, lacY1 ,orΔ(lac IZY), gal K2, gal T2
2, met B1, trp R55,(P2).またＴＢ培地の組成は、 5ｇ
／ｌ NaCl,−10ｇ／ｌ Bactotryptoneである。

【００８２】2. P2392 をＴＢ培地中で37℃で振盪培養
した。

【００８３】3. ＯＤ₆₀₀ ＝0.5 で、菌体を遠心分離(1,
100ｇ，15分間、室温）により集めて、10mM MgSO₄ に
ＯＤ₆₀₀ ＝0.5 となるように懸濁した。

【００８４】4. (ii)-11 の上清を少量加え、37℃15分
間インキュベートした。

【００８５】5. あらかじめ溶かしてあたためておいた
top agarose （NaCl 5g/ｌ, MgSO₄・ H₂ O 2g／ｌ, Ye
ast Extract 5g／ｌ, NZ Amine 10g／ｌ, Agarose 0.7
%） 8mlと混合し、ＮＺＹプレート上に重層した。（NZY
プレート：NaCl 5ｇ／ｌ, MgSO₄ ・ H₂ O 2ｇ／ｌ, Y
east Ext 5ｇ／ｌ, NZ Amine 10ｇ／ｌ, Agar 15ｇ
／ｌ）。

【００８６】6. 37℃で１晩インキュベートした。

【００８７】この結果 3.0×10⁴ インデペンデントクロ
ーンよりなるライブラリーが作製できた。

【００８８】（７）ＢＴＧ遺伝子のスクリーニング （６）で得られたライブラリーを用いてＢＴＧ遺伝子の
クローニングを行なった。（６）-(iii)に示した方法
で、ライブラリー中のファージのプレーティングを行な
った。一晩37℃で培養後、プラークを形成させ、ファー
ジのリフティングを行なった。ファージのリフティング
は次のように行なった。

【００８９】1. プレートを４℃に数時間おいた。

【００９０】2. プレート表面（トップアガロース表
面）にニトロセルロースフィルターを密着させた（ニト
ロセルロースフィルター (S & S)）。

【００９１】3. そのまま約２分間放置した。

【００９２】4. ニトロセルロースフィルターをはが
し、0.5M NaOH-1.5M NaCl に１分間浸した。

【００９３】5. ニトロセルロースフィルターを1.5M Na
Cl-1M Tris-HCl (pH7.5) に５分間浸した。

【００９４】6. ニトロセルロースフィルターを 2×SSC
(1×SSC ＝0.15M NaCl 0.015M Na-Citrate, pH7.0)に3
0秒間浸した。

【００９５】7. ３ＭＭロ紙上でニトロセルロースを風
乾した。

【００９６】8. ３ＭＭロ紙にはさみ、80℃で２時間Bak
ingを行った。

【００９７】リフティングを行なった後、pUC 19 BTGの
EcoRI, HindIII で分解して得られる650 bpのフラグメ
ントを³²Ｐでラベルしたものをプローブとして用いて、
ハイブリダイゼーションを行なった。このEcoRI, Hind
III で分解して得られる650bpのフラグメントは、ＰＣ
Ｒにより増幅されたＤＮＡ断片を完全に含んでいる。ま
た、フラグメントの³²Ｐの標識はマルチプライムＤＮＡ
標識セット（アマシャム）を用いて行なった。プローブ
の比活性は 3×10⁸ cpm/μｇ-DNAであった。ハイブリダ
イゼーションの条件は以下の通りであった。

【００９８】プレハイブリダイゼーション：ハイブリダ
イゼーション溶液（50％ホルムアミド、 1×Denhardt′
s(0.02% BSA,0.02% Ficoll, 0.02% ポリビニルピロリド
ン）、0.1%SDS ，50mMリン酸ナトリウムバッファー（pH
6.5）， 200μｇ／μｌ変性サケ精巣ＤＮＡ）中42℃、
1晩インキュベートした。

【００９９】ハイブリダイゼーション：ハイブリダイゼ
ーション溶液中で、プローブ濃度を２ng／mlとして、42
℃で、１晩インキュベートした。

【０１００】洗 浄 1. 2×SSC, 0.1% SDS 5分×３回、室温 2. 1×SSC, 0.1% SDS 1時間×２回、68℃ 洗浄後ニトロセルロースフィルターを風乾し、オートラ
ジオグラムをとった。

【０１０１】以上の一連の操作で、初めに約４万個のプ
ラークについてスクリーニングを行なった（ファースト
スクリーニング）。この結果16個の強いシグナルを示す
クローンを得た。これらのクローンをシングルプラーク
として得るために、これら16個のクローンについて更に
スクリーニングを行なった。この結果６個のシングルプ
ラーク化された、強いシグナルを示すクローンを得た。

【０１０２】（８）クローンＤＮＡの構造解析 得られた６つのクローンのＤＮＡの構造を調べるため
に、６つのクローンよりＤＮＡを調製した。ＤＮＡの調
製法は“Molecular, Cloning, a laboratory manual 2n
d Edition ”に従って行なった。

【０１０３】このようにして得られたＤＮＡから制限酵
素 BamHI, SphI, NcoI, BglII, KpnI （いずれもTOYOB
O）を用いて制限酵素地図を作製した。その結果、これ
らのクローンは、ほぼ同一のＤＮＡ断片を含んでおり、
その制限酵素地図は第１図のように決まった。

【０１０４】次に、それぞれの制限酵素でＤＮＡを切断
し、電気泳動し、ＤＮＡをニトロセルロースフィルター
に固定し、先にＢＴＧ遺伝子のスクリーニングで用いた
プローブを用いてサザンハイブリダイゼーションを行な
った。ハイブリダイゼーションの条件はＢＴＧ遺伝子の
スクリーニングで用いた条件と同じとした。

【０１０５】その結果、プローブにハイブリダイズして
強いシグナルを与えるのはマップ上のNcoI 3.6kbp 断片
であることがわかった。したがって、少なくともＢＴＧ
遺伝子の一部はNcoI断片にあると考えられた。

【０１０６】（９）NcoI 3.6kbp 断片のサブクローニン
グ 次に、NcoI 3.6kbp 断片をプラスミドにサブクローニン
グすることにした。得られたファージクローンのＤＮＡ
をNcoIで切断し、3.6kbpのＤＮＡ断片を低融点アガロー
スを用いて回収した。このNcoI断片を、プラスミド pTV
118N（宝酒造）をNcoIで切断したＤＮＡとライゲーショ
ンさせ、このＤＮＡで大腸菌ＤＨ５αを形質転換した。
得られた形質転換体より、 pTV118NにNcoI 3.6kbp 断片
がサブクローニングされたプラスミド pTV118 NcoIを得
た。

【０１０７】（10）ＢＴＧ遺伝子のＤＮＡシーケンス 得られたpTV118 NcoI を鋳型として、ＤＮＡシーケンス
を行なった。その方法は（４）の項で説明した手法と同
様の方法を用いた。ただしここでは反応温度を48℃と
し、更にシーケンスのコンプレッションの程度によって
は反応系にＳＳＢ（Single Stranded DNA Binding Prot
ein;TOYOBO）を加えた。

【０１０８】下記の第６表に求められた塩基配列を示す
（配列番号３）。

【０１０９】

【表１５】 第 ６ 表 _{TGCGGCGACG CGTAGGCAAT GGGGGTTCAT CGCGACGTGC TTCCGCACGG CCGCGTTCAA 1} CGATGTTCCA CGACAAAGGA GTTGCAGGTT TCCATGCGCT ATACGCCGGA GGCTCTCGTC TTCGCCACTA TGAGTGCGGT TTATGCACCG CCGGATTCAT GCCGTCGGCC GGCGAGGCCG CCGCCGACAA TGGCGCGGGG GAAGAGACGA AGTCCTACGC CGAAACCTAC CGCCTCACGG CGGATGACGT CGCGACATCA ACGCGCTCAA CGAAGCGCTC CGGCCGCTTC GAGCGCCGGC CCGTCGTTCC GGGCCCCCGA CTCCGACGAC AGGGTCACCC CTCCCGCCGA GCCGCTCGAC AGGATGCCCG ACCCGTACCG TCCCTCGTAC GGCAGGGCCG AGACGGTCGT CAACAACTAC ATACGCAAGT GGCAGCAGGT CTACAGCCAC CGCGACGGCA GGAAGCAGCA GATGACCGAG GAGCAACGGG AGTGGCTGTC CTACGGCTGC GTCGGTGTCA CCTGGGTCAA TTCGGGTCAG TACCCCACGA ACAGACTGGC CTTCGCGTCC TTCGACGAGG ACAGGTTCAA GAACGAGCTG AAGAACGGCA GGCCCCGGTC CGGCGAGACG CGGGCGGAGT TCGAGGGCCG CGTCGCGAAG GAGAGCTTTG ATGAAGAGAA GGGGTTCCAG CGGGCGCGTG AGGTGGCGTC CGTGATGAAC AGGGCCCTGG AGAACGCCCA CGACGAGAGC GCTTACCTCG ACAACCTCAA GAAGGAACTG GCGAACGGCA ACGACGCCCT GCGCAACGAG GACGCCCGTT CCCCGTTCTA CTCGGCGCTG CGGAACACGC CGTCCTTTAA GGAGCGGAAC GGAGGCAATC ACGACCCGTC CAGGATGAAG GCCGTCATCT ACTCGAAGCA CTTCTGGAGC GGCCAGGACC GGTCGAGTTC GGCCGACAAG AGGAAGTACG GCGACCCGGA CGCTTTCCGC CCGGCCCCCG GGACCGGCCT GGTCGACATG TCGAGGGACA GGAACATTCC GCGCAGCCCC ACCAGCCCCG GTGAGGGATT CGTCAATTTC GACTACGGCT GGTTCGGCGC CCAGACGGAA GCGGACGCCG ACAAGACCGT CTGGACCCAC GGAAATCACT ATCACGCGCC CAATGGCAGC CTTGGTGCCA TGCATGTATA CGAGAGCAAG TTCCGCAACT GGTCCGAAGG TTACTCCGAC TTCGACCGCG GAGCCTATGT GATCACCTTC 1218 ^{ATCCCCAAGA GCTGGAACAC CGCCCCCGAC AAGGTAAAGC AGGGCTGGCC GTGATGTGAG CG} 塩基配列よりＢＴＧ遺伝子の開始コドンは１位のＡＴＧ
と推定された。その理由は、（ａ）１位の81ｂ上流にス
トップコドンが存在し、ＢＴＧ遺伝子のオープンリーデ
ィングフレームはこの位置より下流から始まると考えら
れる；（ｂ）１位のＡＴＧの13ｂ上流には典型的なＳＤ
配列(5′− AAAGGAG− 3′）が存在する；（ｃ）１位の
ＡＴＧのメチオニンから約20アミノ酸の領域は比較的疎
水性に富んだ部分で、シグナル配列様の配列を持つ：と
いう以上の３点からである。

【０１１０】また、３′末側の1219位にはストップコド
ンが存在しておりＢＴＧのＣ末は1216位のプロリンと考
えられる。塩基配列より求められたオープンリーディン
グフレームで、アミノ酸シーケンスで求められたＢＴＧ
のＮ末のアミノ酸の位置は 226位のアスパラギン酸であ
る。したがって、ここで求められたＢＴＧ遺伝子のオー
プンリーディングフレームはアミノ酸シーケンスから求
まった構造に更に75個のアミノ酸が付加した構造をとっ
ていることがわかった。

【０１１１】実施例２：ＢＴＧ遺伝子の化学合成 ＢＴＧ遺伝子の設計合成 前述の如く、明らかになったＢＴＧの全アミノ酸配列を
もとに、ＢＴＧ遺伝子ＤＮＡを設計した。その際、大腸
菌や酵母のコドン使用頻度（Ikemura, T. andOzeki,H.,
Cold Spring Harbor Symp.Quant. Biol., 47, 1087(19
83)）を考慮し、また、各フラグメント (1)〜(5) の両
端のＤＮＡ鎖には各フラグメントの集合連結させる時に
用いる制限酵素の認識部位を配置した。

【０１１２】

【表１６】 次に設計した遺伝子ＤＮＡをアプライドバイオシステム
ズ社のＤＮＡ合成機 380Ａを用いてホスホアミダイト法
で化学合成した。

【０１１３】現在のＤＮＡ合成機やＤＮＡ精製法の信頼
性，操作性から判断して、１本あたりのＤＮＡ鎖は30〜
40塩基程度にした。まず、当該ＢＴＧは 331アミノ酸、
即ち、 993塩基の遺伝子が少なくとも必要である。また
２本鎖としてプラスミドに組み込む必要があるのでその
２倍のＤＮＡを合成する必要がある。実際には終止コド
ンの導入や、各断片の連結のための制限酵素認識部位も
必要なため、27本表裏で合計54本のＤＮＡ鎖を合成し
た。またプラスミドに組み込んだところで、塩基配列の
確認が必要なので確実に塩基配列の決定が行なえる長さ
（約200 bp）に分けてプラスミドに組み込む方が操作し
やすい。

【０１１４】したがって遺伝子全体を一度に組み立てる
のではなく、約200bp ずつ５つのブロックに分けて最初
のフラグメントの集合を行ない、そこで塩基配列の確認
を行なってから全体を構築することにした。

【０１１５】ＢＴＧ遺伝子（合成型）の構築 まず、５ブロックに分けた各フラグメント（約200 bp）
の構築を行なった。化学合成によって得られるオリゴヌ
クレオチドの５′末端にはリン酸がついていないので、
ポリヌクレオチドキナーゼを用いて５′末端にリン酸を
くっつけた。その際、各フラグメントの５′両末端に位
置するＤＮＡ鎖のリン酸化は連結後に行なった。

【０１１６】 各オリゴヌクレオチド100pmole （水中） 7.5μｌ 10x バッファー * 1μｌ 10mM ATP 1μｌ ポリヌクレオチドキナーゼ（宝酒造） 0.5μｌ(5ユニット） 10 μｌ * 10xバッファー 650mM Tris-HCl(pH7.6) 100mM MgCl₂ 150mM ジチオスレイトール 10mM スペルミジン 上記組成をエッペンドルフチューブに入れ、37℃、１時
間反応させた後、３分間煮沸により酵素を失活させた。
次に相補的な対同志を５μｌずつ混合し（トータル10μ
ｌ）、90℃の湯浴中に３分間煮れたあと、自然に37℃ま
で湯の温度を下げてアニーリングを行なった。そのあ
と、２対のＤＮＡ（20μｌ）の隣どうしをリガーゼを用
いて連結した。

【０１１７】 ＤＮＡ２対 20 μｌ 150mM ジチオスレイトール(DTT) 2 μｌ 10mM ATP 2 μｌ リガーゼ（宝酒造） 0.5μｌ(150ユニット） 24.5 μｌ 上記組成をエッペンドルフチューブに入れ、16℃、30分
間反応させた後、さらに隣どうしを連結して、ブロック
をつなぎ合わせるため、上記反応液の各22μｌずつを３
本混合し（トータル66μｌ）、リガーゼ 0.5μｌを加え
た。16℃、30分間反応後、10％ポリアクリルアミドゲル
電気泳動を行ない、約200 bpのＤＮＡフラグメントをゲ
ルから回収した。

【０１１８】こうして得たＤＮＡフラグメント (1)〜
(5) の５′末端にはEcoRI 認識部位、３′末端にはHind
III 認識部位がある。次に各フラグメントの５′両末端
のリン酸化を行なった後、適当量をあらかじめ EcoRIと
HindIII で切断処理したプラスミド pUC18（Yanisch-Pe
rron, C.等、Gene, 33, 103(1985))と混合し、ライゲー
ションキット（宝酒造）を用いて16℃、１時間連結反応
を行なった。

【０１１９】次にこの各混合物を大腸菌ＪＭ109 株（re
cA1,Δlacpro, endA1, gryA96, thi-1, hsdR17, supE4
4,relA1, λ^- , (F′traD36,proAB,lacI ^q Z ΔM15)）
に導入した。

【０１２０】E.coli JM109株はpUC 系プラスミドＤＮＡ
の形質転換やＭ13ファージベクターＤＮＡの形質導入を
行なう際に、ベクターＤＮＡより生成するlacZαペプチ
ドとJM109F′にコードされるlacZΔＭ15とによるβ−ガ
ラクトシダーゼの活性回復を用いて、組換え体の選別を
容易にする菌株である。即ち、ＩＰＴＧ（イソプロピル
−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド）とＸ−Ｇal(5−ブ
ロモ−4 −クロロ−3−インドール−β−Ｄ−ガラクト
シド）を含む培地でプラスミドpUC18 を保持するJM109
株は、β−ガラクトシダーゼ活性を示す青色のコロニー
として出現するが、外来ＤＮＡ断片が挿入された組換え
プラスミドを保持するＪＭ109 株はβ−ガラクトシダー
ゼ活性が回復せず無色のコロニーとして出現する。

【０１２１】いくつかの無色のコロニーから、プラスミ
ドを調製し、そのＤＮＡシークエンシングを行ない（Sa
nger,F. ら、J.Mol.Biol., 143, 161(1980))、挿入され
た各フラグメントが設計した通りの正しい塩基配列を有
するクローンを選択した。

【０１２２】さらに、各制限酵素認識部位をもちいて各
フラグメントの連結を行なった。

【０１２３】まずフラグメント (2)と(3) の連結は、pU
C18 のアンピシリン耐性遺伝子内に存在するScaI認識部
位を利用して、フラグメント (2)及び(3) をScaIとXbaI
で切断後、ＢＴＧ遺伝子を含むScaI・XbaI断片を用いて
行なった。またフラグメント(4) と(5) の連結は同様に
フラグメント (4)及び(5) をScaIとNcoIで切断後、ＢＴ
Ｇ遺伝子を含むScaI・NcoI断片を用いて行なった。さら
にフラグメント(2)(3)(4)(5)の連結は同様にフラグメン
ト(2)(3)集合体及び(4)(5)集合体をScaIと BglIIで切断
後、ＢＴＧ遺伝子を含むScaI・Bgl II断片を用いて行な
った。

【０１２４】最後に、フラグメント(1) の EcoRI・HpaI
断片とフラグメント(2)(3)(4)(5)の集合体のHpaI・Hind
III 断片をあらかじめ EcoRIとHindIII で切断処理した
大腸菌用高発現分泌ベクターpIN-III-ompA2 （Ghrayeb,
J.等、EMBO J., 3, 2437(1984)）と混合し、ライゲーシ
ョンキットを用いて、16℃30分間連結反応を行なった。
次にこの混合物を大腸菌ＪＡ221 株（hsdM⁺ , trpE5, l
euB6, lacY, recA/F′, lacI^q ,lac⁺ ,pro⁺ )(Nakamur
a,K. 等、J.Mol.Appl.Genet., 1, 289(1982))に導入し
た。生じたコロニーからいくつかプラスミドを調製し、
ＢＴＧ遺伝子（約1 kb）が正しく挿入されたことを確認
した。こうして得られたＢＴＧの発現分泌ベクターをpO
MPA-BTG と呼ぶ。挿入された化学合成型ＢＴＧ遺伝子の
塩基配列を第２表に示した。

【０１２５】なお、この実施例で用いたプラスミドpIN-
III −ompA2 は大腸菌の外膜リポタンパクのプロモータ
ー(lpp^P ）、及びラクトースオペロンのプロモーター、
オペレーター(lac^PO）、大腸菌の外膜タンパクOmpAのシ
グナルペプチドを含んでおり、この下流に組み込まれた
遺伝子はＩＰＴＧの添加により発現が誘導され、遺伝子
産物はペリプラズムに蓄積される。これまでにサチライ
シンをはじめ、いくつかの例で遺伝子産物がペリプラズ
ムに著量蓄積することが報告されている（Ikemura,H.
等、J.Biol.Chem., 262, 7859(1987), Hsiung,H.M.
等、Bio/Technology, 4, 991(1986) など）。ＢＴＧタ
ンパクの精製は常法どおり、ペリプラズムから浸透圧シ
ョック法(Koshland,D.ら、Cell, 20, 749(1980))によっ
てペリプラズム画分のタンパク質を抽出し、その後、硫
安沈殿、各種イオン交換クロマトグラフィ、ゲル濾過及
びＨＰＬＣ等の各操作を用いる生化学的手法により行な
うことができる。

【０１２６】また、合成したＢＴＧ遺伝子の発現に用い
るプラスミドとしては、pIN-III-ompAに限らず、他の発
現プラスミドを用いることもできる。これらは、発現系
に応じて当業者であれば容易に選択し得る。

【０１２７】実施例３：ＢＴＧ遺伝子（合成型）の大腸
菌での発現 合成型ＢＴＧ遺伝子を組み込んだプラスミドpOMPA-BTG
を保有する大腸菌 JA221株（FERM P-11745 ）をアンピ
シリン50μｇ／mlを含むＭ9 カザミノ酸培地で37℃、２
時間振盪培養後、培養温度を23℃に下げ、IPTGを１mMと
なるよう添加し、さらに４時間23℃で振盪した。次いで
この培養液50mlを遠心分離により集菌後、菌体を20％シ
ュークロース、10mM Tris-HCl(pH7.5) 2.5mlに懸濁し、
0.5M EDTA(pH8.0) 0.125mlを添加後、30分間氷中に放置
した。12000 rpm 、10分間遠心し、上澄と菌体を分離
後、菌体画分を蒸留水３mlに懸濁し、30分間氷中に放置
した。 12000 rpm、10分間遠心し、上澄と菌体を分離し
た。次にこれらの上澄液を合わせて38000 rpm 、60分間
超遠心し、その上澄液をペリプラズム画分とした。

【０１２８】さらに菌体画分は蒸留水３mlに懸濁後、超
音波破砕（200W，５分）を行ない、細胞質画分とした。

【０１２９】各画分のＢＴＧ活性の測定 調製した各画分（培養上清、ペリプラズム、細胞質）の
ＢＴＧ活性をヒドロキサム酸法により測定した。

【０１３０】測定方法は基本的には、J.Biol.Chem. 241
5518(1966) に記載のFolk and Cole の方法（Colorime
tric hydroxamate Procefure）に準じて行なった。すな
わち、ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−グルタミルグリ
シン（CBZ −gln −gly ）とヒドロキシルアミンを基質
としてＣａ²⁺存在下あるいは非存在下で反応を行ない、
生成したヒドロキサム酸をトリクロロ酢酸存在下で鉄錯
体として形成させ、525 nmの吸収を測定し、ヒドロキサ
ム酸の量を検量線より求め活性を算出する方法である。

【０１３１】＜活性測定法＞ 試薬Ａ 0.2Mトリス塩酸緩衝液（pH 6.0） 0.1Mヒドロキシルアミン 0.05M 塩化カルシウム 0.01M 還元型グルタチオン 0.03M CBZ-gln-gly （国産化学製） 試薬Ｂ ３Ｎ 塩酸 １容 12％−トリクロロ酢酸 １容 5％ FeCl₃ ・6H₂ O(0.1N-HClに溶解） １容 試料（酵素液）の 0.4mlに試薬Ａ 0.4ml加えて混合し、
37℃で、10分間反応後、試薬Ｂ 0.4mlを加えて反応停止
と鉄錯体の形成を行なった後、525 nmの吸光度を測定し
た。

【０１３２】対照として、予め、熱失活させた酵素液を
用いて同様に反応させたものの吸光度を測定し、酵素液
との吸光度差を求め、別に酵素液のかわりにＬ−グルタ
ミン酸γ−モノヒドロキサム酸を用いて検量線を作成
し、吸光度より、生成されたヒドロキサム酸の量を求
め、１分間に１マイクロモルのヒドロキサム酸を生成す
る酵素活性を１単位とした。

【０１３３】以下にその測定結果を示す。

【０１３４】

【表１７】 いずれの画分にもＩＰＴＧで誘導すると微弱ながらＢＴ
Ｇ活性を検出することができた。

【０１３５】さらに、ＢＴＧ遺伝子産物が生成している
ことを確認するため精製ＢＴＧを用いてウサギで作製し
た抗ＢＴＧ抗体によるウェスタン・ブロッティングを、
ベクター社のVectastain ABC kitを用いて行なった。

【０１３６】即ち、各画分からのタンパク 0.5μｌずつ
をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけ、泳
動後のゲルをメンブレン（Immobilon ；ミリポア社）に
トランスファーして抗原となるタンパク質をメンブレン
に結合させた。その後、ウサギ抗ＢＴＧ抗体（抗体価64
倍のものを1000倍希釈した）によるウェスタンブロッテ
ィングを行ない、遺伝子産物をタンパクレベルで確認し
た。

【０１３７】その結果、以下の１，３，５及び７のレー
ンにおいて同一の位置に発色したバンドが現われ、いず
れのＩＰＴＧ添加画分でも抗ＢＴＧ抗体との反応を示す
タンパク質が、精製ＢＴＧと同一分子量の位置に検出で
きた。

【０１３８】１：精製ＢＴＧ（コントロール） ２：培養上清（ＩＰＴＧ無添加） ３： 同上 （ＩＰＴＧ１mM添加） ４：ペリプラズム（ＩＰＴＧ無添加） ５： 同上 （ＩＰＴＧ１mM添加） ６：細胞質 （ＩＰＴＧ無添加） ７： 同上 （ＩＰＴＧ１mM添加）実施例４：ＢＴＧ遺伝子（天然型）の放線菌での発現 （１）プラスミドベクター（pIJ 702 ）の取得 pIJ 702 含有Streptomyces lividans 3131（ATCC 3528
7）を以下の培地条件で３０℃、２日間培養した。

【０１３９】 ［ＹＥＭＥ培地＋０．５％グリシン＋50μｇ／mlチオストレプトン］ ０．３％ イースト・エキス ０．５％ ペプトン ０．３％ マルト・エキス ０．１％ 塩化マグネシウム １．０％ グルコース ３４．０％ サッカロース ０．５％ グリシン ０．１％ ５０mg／mlチオストレプトン溶液 （シグマ：ジメチルスルホキシド溶液） ／ｌ（ｐＨ７．０） 上記条件下で培養した培養培地２００mlを遠心分離（1
2,000ｇ，４℃、１０分間）し、得られた沈澱（菌体）
を50mM Tris-HCl(pH 8.0)-5mM EDTA-50mM NaClで洗浄し
た。洗浄後、遠心分離（1,300 ｇ、室温、５分間）によ
り得られた菌体を50mM Tris-HCl(pH 8.0)-10mM EDTA-25
% Sucrose （以下「TE-Sucrose」という。）１０mlに懸
濁した。次に３０mg／mlのリゾチーム（シグマ）を含む
TE-Sucrose２ml及び 0.25M EDTA ４mlを加え、これを３
７℃で３０分間インキュベートした。インキュベート後
２０％ＳＤＳ ２mlを加えさらに5M NaCl 5ml を加え穏
やかに撹拌した後、０℃で１晩インキュベートした。次
に、遠心分離（100,000 ｇ，４℃，４０分間）により得
られた上清に３０％ポリエチレングリコール6000を終濃
度１０％になるように加え、０℃で４．５時間インキュ
ベートした。その後、遠心分離（900 ｇ，４℃，５分
間）し、沈澱を10mM Tris-HCl(pH 8.0)-1mM EDTA-50mM
NaClに溶かした。そして、塩化セシウム16.8ｇ及び１０
mg／mlの濃度にエチジウムブロマイドを10mM Tris-HCl
(pH 8.0)-1mM EDTA（以下「ＴＥ」という。）に溶かし
調製した溶液１．２mlを加え、遠心分離（1,300 ｇ，室
温，１５分間）により、残渣を取り除いた後、遠心分離
（230,000 ｇ，２０℃，１２時間）を行なった。遠心
後、紫外線照射下でプラスミドＤＮＡ層を得た。次にＴ
Ｅで飽和したブタノールによる抽出を行ないエチジウム
ブロマイドを除いた。この抽出は、３回繰り返して行な
った。得られたものは、ＴＥで４℃、１晩透析を行なっ
た。その後、ＴＥ飽和フェノールで１回、クロロホルム
・イソアミルアルコールで２回抽出した。次に、 1／10
容量の３Ｍ酢酸ナトリウム（pH 5.2）溶液と２倍容量の
エタノールを加え、−８０℃に３０分間静置した。その
後、遠心分離（12,000ｇ，４℃，１５分間）により沈澱
を回収し、沈澱を７０％エタノールで洗浄し、乾燥させ
た。これをＴＥ２００μｌに溶かした。最終的に得られ
たＤＮＡ量は、約１０μｇであった。

【０１４０】（２）宿主の取得 pIJ702含有Streptomyces lividans 3131をＹＥＭＥ培地
で３０℃、７日間培養した。

【０１４１】次に、培養液をＹＥＭＥ培地で１０⁵ 〜１
０⁹ 倍に希釈し、それぞれの希釈液を１００μｌずつＹ
ＥＭＥ寒天培地（ＹＥＭＥ培地に１．５％寒天を加えた
プレート寒天培地）５枚にまいた。そして３０℃、１週
間培養した。培養後、RepliPlate^TM Colony Transfer P
ad（宝酒造）を用い、２００μｇ／mlチオストレプトン
を含むＹＥＭＥ寒天培地にレプリケイションし、３０
℃、１週間培養した。そして分離できたチオストレプト
ン感受性株１株を Streptomyces lividans 3131-TSと
し、宿主として用いた。

【０１４２】（３）Streptomyces lividans 3131-TS プ
ロトプラストの調製 （２）で得られたStreptomyces lividans 3131-TS をＹ
ＥＭＥ培地＋０．５％グリシンで３０℃、２日間培養し
た。培養液２００mlを遠心分離（1,300 ｇ，室温，１０
分間）し、得られた菌体を0.35Ｍサッカロース７２mlに
懸濁した。次に、この懸濁液を遠心分離（1,300 ｇ，室
温，１０分間）し、菌体を１mg／mlのリゾチーム（シグ
マ）を含むＰ緩衝液（下記）６０mlに再懸濁し、これを
３０℃、２．５時間インキュベートした。インキュベー
ト後、この懸濁液を脱脂綿で濾過し残渣を取り除いた。
次に、得られた濾液を遠心分離（1,300 ｇ，室温，１０
分間）し、Ｐ緩衝液２５mlで洗浄した。この洗浄を２回
繰り返した後、沈澱をＰ緩衝液１mlに懸濁し、プロトプ
ラスト懸濁液とした。

【０１４３】 ［Ｐ緩衝液］ TES[N-Tris(hydroxymethyl) methyl -2-aminoethane sulphonic acid] ５．７３ｇ サッカロース １０３ｇ 塩化マグネシウム ２．０３ｇ 硫酸カリウム ０．５ｇ 塩化カルシウム ３．６８ｇ Trace element solution ２ml ／ｌ（pH 7.4） なお、１％リン酸一カリウム溶液を別調製し、使用直前
に１００mlＰ緩衝液当り１ml加えた。

【０１４４】［Trace element solution］ 塩化亜鉛 ４０ｍｇ 塩化第二鉄 ２００ｍｇ 塩化第二銅 １０ｍｇ 塩化マンガン １０ｍｇ 四硼酸ナトリウム １０ｍｇ モリブデン酸アンモニウム １０ｍｇ ／ｌ （４）放線菌における発現型ＢＴＧ遺伝子断片（Mp-BTG
spm）の構築 ＢＴＧ遺伝子は、ＤＮＡシーケンスの結果、プレプロ体
を形成することが予想された。そこで、ＢＴＧ生産菌で
あるStreptoverticillium sp. と同じ放線菌であるStre
ptomyces lividans 3131-TS で発現させることは、他の
微生物の場合に比べて前駆体から成熟体へのプロセッシ
ングがスムーズに行なわれるのではないかと考えた。そ
こで以下の様に発現型ＢＴＧ遺伝子を構築した。

【０１４５】ｉ）ＢＴＧ遺伝子シグナル、プロ領域、構
造遺伝子を含む断片の取得 ＰＣＲ法により、３．６kbp BTG 遺伝子NcoI断片を鋳型
としてＢＴＧ遺伝子シグナル、プロ領域、構造遺伝子を
含む断片（以下「BTG spm 断片」と言う。）を取得し
た。

【０１４６】ＰＣＲに用いたPrimer #3 及びPrimer #4
の配列を以下に示す。

【０１４７】

【表１８】

【０１４８】なお、ＰＣＲ法の詳細な条件は、実施例１
と同様である。

【０１４９】ii）ｍｅｌ（メラニン合成遺伝子）プロモ
ーター領域断片の取得 ＢＴＧ遺伝子の発現プロモーター領域としてｍｅｌ遺伝
子を選択した。そこで、ＰＣＲ法により、pIJ702を鋳型
として、ｍｅｌ遺伝子のプロモーター領域の断片（以下
「Ｍｐ断片」と言う。）を取得した。

【０１５０】ＰＣＲに用いたPrimer #5 及びPrimer #6
の配列を以下に示す。

【０１５１】

【表１９】

【０１５２】なお、ＰＣＲ法の詳細な条件は、実施例１
と同様である。

【０１５３】iii)ＢＴＧ遺伝子断片（Mp-BTG spm）の構
築 ＰＣＲで増幅されたＭｐ断片とｐＵＣ19をそれぞれ Eco
RI, SacI(TOYOBO)で切断したのち、目的のサイズのもの
を低融点アガロースを用いて回収した。次に、これらを
ライゲーションし、大腸菌ＤＨ５αを、X-gal 及びIPTG
存在下で形質転換した。そして、アンピシリン耐性白色
コロニーから得られたＭｐ断片がｐＵＣ19のEcoRI-SacI
サイトに組み込まれたプラスミドをpUC19-Mpとし、以下
の実験に使用した。

【０１５４】次に、同様にＰＣＲで増幅されたBTG spm
断片とpUC19-Mpをそれぞれ BamHI,SacI(TOYOBO)で処理
し、サブクローニングを行なった。こうして得られたBT
G spm 断片が pUC19-Mp の BamHI-SacI サイトに組み込
まれたプラスミドを pUC19-Mp-BTG spm として、以下の
実験に使用した。

【０１５５】得られたプラスミドpUC19-Mp-BTG spmはPs
tI, BglII(TOYOBO) で処理し、 1.4kbp Mp-BTG spm断片
を取得した。

【０１５６】なお、ライゲーションには、ライゲーショ
ンキット（宝酒造）を用いた。

【０１５７】（５）ＢＴＧ遺伝子のStreptomyces livid
ans 3131-TS への導入 前項で得られた1.4kbp Mp-BTG spm 断片と5.1kbp pIJ70
2 Pst-BglII 断片をライゲーションした。なお、ライゲ
ーションは、以下の反応液を調製し、４℃で１晩インキ
ュベートした。

【０１５８】 1.4kbp Mp-BTG spm 断片 8.5 μｌ（約500 ng） 5.1kbp pIJ702 PstI-BglII断片 8.5 μｌ（約500 ng） 5 units/μl T4 DNA ligase （ベーリンガー） 1.0 μｌ 10x ligation buffer （ベーリンガー） 2.0 μｌ インキュベート後、このＤＮＡでStreptomyces lividan
s 3131-TS を形質転換した。形質転換は下記のように行
った。

【０１５９】１．以下の反応液を調製し、全量１４０μ
ｌにした。

【０１６０】 ＤＮＡ溶液 ２０μｌ Streptomyces lividans 3131-TS プロトプラスト １００μｌ 0.35Ｍ サッカロース ２０μｌ ２．２０％ポリエチレングリコール1000を含むＰ緩衝液
を１．５ml加えピペッティングにより穏やかに混和し
た。

【０１６１】３．室温で２分間静置した。

【０１６２】４．遠心分離（1,700 ｇ，室温，１０分
間）し、ペレットを集めた。

【０１６３】５．得らたれペレットをＰ緩衝液で洗浄し
た。なお、この操作は２回繰り返した。

【０１６４】６．ペレットを１mlのＰ緩衝液に再懸濁し
た後に、２００μｌずつＲ−２培地に塗布した。

【０１６５】［Ｒ−２培地］以下に示したＲ−２／Ａ及
びＲ−２／Ｂを別調製し、プレート培地作製時にＲ−２
／Ａ，Ｒ−２／Ｂを混合し、さらに１％ KH₂ PO₄ を最
終容量２００ml当り１mlの割合で混合した。

【０１６６】 Ｒ−２／Ａ 硫酸カリウム ０．５ｇ 塩化マグネシウム ２０．２ｇ 塩化カルシウム ５．９ｇ グルコース ２０．０ｇ プロリン ６．０ｇ カザミノ酸 ０．２ｇ Trace element solution ４ ml 寒 天 ４４．０ｇ ／ｌ Ｒ−２／Ｂ ＴＥＳ １１．５ｇ イースト・エキス １０．０ｇ サッカロース ２０３ｇ ／ｌ（ｐＨ７．４） ７．３０℃で１８時間インキュベートした。

【０１６７】８．２００μｇ／mlチオストレプトン及び
４００μｇ／mlチロシンを含むＰ緩衝液１mlを加え、寒
天の全表面を覆った。

【０１６８】９．さらに、３０℃で７日間インキュベー
トした後にチオストレプトン耐性白色コロニーを得た。
なお、外来ＤＮＡ断片が挿入されていないpIJ702を保持
するものは、ｍｅｌ遺伝子によりメラニンを合成し、黒
色のコロニーとして出現する。こうして得られたいくつ
かの白色コロニーからプラスミドを調製し、目的とする
ＢＴＧ遺伝子が挿入されているかどうか確認した。

【０１６９】そして得られたＢＴＧ発現分泌ベクターを
pIJ702-BTG と名付けた。

【０１７０】（６）ＢＴＧ遺伝子の発現 ＢＴＧ遺伝子を組み込んだ pIJ702-BTG で形質転換した
放線菌をStreptomyceslividans AKW-1 として以下の培
地条件で３０℃、５日間培養した。

【０１７１】 ポリペプトン ２％ 可溶性デンプン ２％ イースト・エキス ０．２％ リン酸二カリウム ０．２％ 硫酸マグネシウム ０．１％ アデカノールＬＧ 126 ０．０５％ ５０mg/ml チオストレプトン溶液 ０．１％ 上記条件下で培養した培養培地１００mlを遠心分離（1
2,000ｇ，４℃，１０分間）し、得られた上清を分画分
子量 1000 の限外濾過膜（アミコン）を用いて約１７倍
に濃縮した。

【０１７２】次に、調製したサンプルを、精製したＢＴ
Ｇを用いてウサギで作製した抗ＢＴＧ抗体によるＥＩＡ
法により定量した。その結果約０．１mg／ｌのＢＴＧを
検出できた。

【０１７３】なお、ＥＩＡは以下の様に行なった。

【０１７４】１．サンプル５０μｌに緩衝液Ａ 500μｌ
を加え混合し、そこに抗体結合ビーズ（ビーズはセキス
イのポリスチレン製＃８０を使用した。）を１個加え、
３７℃、３０分間インキュベートした。

【０１７５】２．反応液を除き、ビーズを１０mMリン酸
緩衝液（pH 7.0）で２回洗浄した。

【０１７６】３．洗浄したビーズにβ−ガラクトシダー
ゼ標識抗体（５０mu／５００μｌ緩衝液Ａ）５００μｌ
を加え、３７℃で３０分間インキュベートした。

【０１７７】４．反応液を除き、ビーズを１０mMリン酸
緩衝液（pH 7.0）で２回洗浄した。

【０１７８】５．洗浄したビーズをＣＰＲＧ溶液５００
μｌに加え、３７℃で３０分間インキュベートした。

【０１７９】６．反応停止液２mlを加えた後、５７５nm
の吸光度を測定した。

【０１８０】 ［緩衝液Ａ］ ０．１Ｍ 塩化ナトリウム ０．１％ ＢＳＡ １ｍＭ 塩化マグネシウム ０．１％ アジ化ナトリウム １０ｍＭ リン酸緩衝液（pH 7.0） ［ＣＰＲＧ溶液］ ＣＰＲＧ（クロロフェノールレッドβ−Ｄ− ガラクトピラノシド，ベーリンガー） 1 ｇ ＢＳＡ 333.2 mg リン酸一カリウム 833.2 mg 亜硫酸ナトリウム 166.8 mg ＧＨ 333.2 ml /l(pH 5.0) ［ＧＨ］ ５％ 加水分解ゼラチン ０．３Ｍ 塩化ナトリウム １ｍＭ 塩化マグネシウム ０．１％ アジ化ナトリウム ０．１％ ＢＳＡ ５０ｍＭ リン酸緩衝液（pH 7.0） ［反応停止液］ １０ｍＭ エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム １％ ガラクトース ０．１％ アジ化ナトリウム ５０ｍＭ リン酸緩衝液（pH 7.0） さらにこの組み換えＢＴＧをウエスタンブロットにより
解析した。まず、サンプルを既往の方法により処理し、
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動を行なった。ＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅ電気泳動後、ゲル上のタンパク質をElectrophoretic
Transfer Kit(LKB) を用いてメンブレン(Immobilon
^TM（ミリポア）) にトランスファーした。トランスファ
ーの条件は、Electrophoretic Transfer Kitに添付され
ている説明書に従った。トランスファー後、メンブレン
をBlocking Buffer(20mM Tris-HCl(pH7.9) ，５％スキ
ムミルク）１０ml中にて１時間インキュベートした。そ
の後、メンブレンを、ＢＴＧ抗血清を２００倍にRinse
Buffer(10mM Tris-HCl(pH 7.9), 0.15M NaCl, 0.1mM ED
TA(3Na), 0.25 ％スキムミルク，0.01％ NaN₃ ）で希釈
した溶液10ml中にて１晩、４℃でインキュベートした。
インキュベート後、溶液を捨て、メンブレンを２０mlの
Rinse Bufferで２度洗浄した後、次にメンブレンを Ant
i rabbit ¹²⁵Ｉラベルwhole antibody（アマシャム）１
μCiを含む RinseBuffer １０ml中に移し４℃で４時間
インキュベートした。インキュベート後、メンブレンを
２０mlのRinse Bufferで２回洗浄し、その後メンブレン
を取り出し、風乾した。風乾後、メンブレンをオートラ
ジオグラフィーにかけ、シグナルを検出した。

【０１８１】結果は、精製ＢＴＧと同一分子量である約
３７KDa の位置に成熟体タンパク質としてのＢＴＧが認
められた（第２図参照）。この事は、Streptomyces liv
idans AKW-1 によるＢＴＧ遺伝子発現において、前駆体
遺伝子を導入したにもかかわらず成熟体タンパク質を分
泌したことを示し、正しくプロセッシングがなされたこ
とを示唆する。

【０１８２】実施例５：ＢＴＧ遺伝子（合成型）の酵母
での発現 酵母におけるＢＴＧの発現には、シグナル配列遺伝子の
下流にＢＴＧ成熟体遺伝子或いはＢＴＧプロ配列遺伝子
とＢＴＧ成熟体遺伝子を組み込んだ発現ベクターを用い
るという二つの方法をとった。

【０１８３】発現ベクターとしては、酵母において強力
なプロモーター活性を有すとして知られている解糖系の
エノラーゼ遺伝子（ＥＮＯ１）のプロモーター配列を含
む大腸菌・酵母シャトルベクターpNJ 1053を用いた。Ｅ
ＮＯ１のプロモーターを利用した酵母での発現は、ヒト
リゾチーム（Ichikawa, K.等、Agric. Biol. Chem.,53,
2687(1989)など）が知られているが本ベクターはpBR32
2由来の大腸菌における複製オリジン、アンピシリン耐
性遺伝子及び酵母の２μｍ複製オリジン、選択マーカー
としてはＬＥＵ２遺伝子とを併せ持つ高コピー型（ＹＥ
ｐ）ベクターである。

【０１８４】ここで、シグナル配列としてはヒトガスト
リンシグナル配列（ Kato, K. 等、Gene, 26, 53-57 (1
983)）を用いた。２１アミノ酸残基よりなるこのシグナ
ル配列は、シグナルペプチダーゼにより２１位のアラニ
ンのカルボキシル末端側が切断されるものであり、ヒト
−αアミラーゼをはじめ酵母での異種タンパク質発現分
泌に利用されている（Sato, T.等、Gene, 83, 355-365
(1989)）。

【０１８５】また、シグナル配列と成熟体遺伝子配列の
間に介在するプロ配列は、枯草菌でも知られているよう
に翻訳されたタンパク質の活性発現において重要な役割
を果すと考えられている（Ikemura, H. 等、J. Biol. C
hem., 262, 7859-7864 (1987)など）。なお、この実施
例で用いたＢＴＧプロ配列とは、実施例１で明らかにな
ったＢＴＧシグナル様配列の下流に存在する−３９位リ
ジンから−１位プロリンまでの３９アミノ酸残基を示
す。

【０１８６】（１）ＢＴＧ成熟体発現分泌ベクターｐＮ
Ｊ１０５３−ＢＴＧの構築 まず、ガストリンシグナル配列を有するベクター（Sat
o, T.等、Gene, 83,355-365(1989)）よりシグナル配列
をコードする遺伝子を含む約９０bpのXhoI・HindIII 断
片を切り出し、あらかじめXhoIとHindIII で切断処理し
たベクター pHSG396 （宝酒造，Takeshita, S. 等、Gen
e, 61, 63-74 (1987)）に挿入し、 pHSG396-GSを得た。
このHindIII 消化物と、下記に示す約３０bpの合成オリ
ゴヌクレオチド及び実施例２で化学合成されたＢＴＧ遺
伝子のPvuII-HindIII 断片（約１kb）とを連結し、ＢＴ
Ｇ成熟体遺伝子がシグナル配列遺伝子の下流に正しく挿
入されたものを選択した。

【０１８７】

【表２０】 5′− AGCTTGGGAT TCTGATGACA GAGTCACTCC ACCAG − 3′ 3′− ACCCTA AGACTACTGT CTCAGTGAGG TGGTC − 5′ HindIII PvuII さらにこれを XhoI 認識部位上流に存在するSalIとHind
III で切断し、約1.1kbpの断片を得、酵母発現ベクター
pNJ1053 のＥＮＯ１プロモーターの下流に存在するSal
I、HindIII 間に挿入した。これを大腸菌ＪＭ109 株に
導入し、発現分泌ベクターpNJ1053-BTG を得た。

【０１８８】（２）ＢＴＧプロ配列−成熟体発現分泌ベ
クター pNJ1053-proBTG の構築 まず、ＢＴＧプロ配列部分をコードする遺伝子を合成し
た。その際、大腸菌や酵母のコドン使用頻度を考慮し、
またシグナル配列遺伝子や成熟体遺伝子との連結のため
の制限酵素認識部位を配置した。即ち、プロ配列遺伝子
の５′末端にはシグナル配列遺伝子との連結のためのHi
ndIII 粘着末端配列を、３′末端には実施例２で化学合
成されたＢＴＧ遺伝子のPvuII 認識部位に連結するため
の配列を配置した。

【０１８９】

【表２１】

【０１９０】本配列の合成には、１本あたり約５０塩基
のＤＮＡ鎖を３本表裏で合計６本化学合成した。（ＤＮ
Ａ合成は、アプライドバイオシステムズ社のＤＮＡ合成
機３８０Ａを使用した。）化学合成したオリゴヌクレオ
チドは、実施例２で化学合成されたＢＴＧ遺伝子の合成
の時と同様の手順によりリン酸化、アニーリング、ライ
ゲーションという反応を行なった。反応後、１０％ポリ
アクリルアミドゲル電気泳動を行ない、約１５０bpのＤ
ＮＡ断片をゲルから回収した。次に、（１）と同様に p
HSG396-GS のHindIII 消化物と、回収した約１５０bpの
合成オリゴヌクレオチド及び実施例２で化学合成された
ＢＴＧ遺伝子の PvuII・HindIII 断片（約１kb）とを連
結し、ＢＴＧプロ配列遺伝子がシグナル配列とＢＴＧ成
熟体遺伝子の間に正しく挿入されたものを選択した。さ
らにこれをXhoI認識部位上流に存在するSalIとHindIII
で切断し、約1.2 kbp の断片を得、酵母発現ベクター p
NJ1053のＥＮＯ１プロモーターの下流に存在するSalI、
HindIII 間に挿入した。これを大腸菌ＪＭ109 株に導入
し、発現分泌ベクター pNJ1053-proBTG を得た。

【０１９１】（３）酵母におけるＢＴＧ遺伝子の発現 （１），（２）で各々得られた発現分泌ベクターpNJ105
3-BTG と pNJ1053-proBTG の宿主酵母Saccharomyces
cerevisiae KSC22-1C （MATa，ssl1，leu2，his ^- ，ur
a3）への導入は、アルカリ金属処理法（Ito, H. 等、J.
Bacteriol, 153, 163-168 (1983)）を用いた。その
際、栄養要求性変異を相補する遺伝子を組み込んだプラ
スミドで形質転換されたクローンの選択、培養には最少
培地が必要であるが、形質転換体の選択に用いた最少培
地は、Difco 社より市販されているbacto yeast nitrog
en base (YNB) の0.67％溶液に２％グルコース、そして
宿主酵母の栄養要求性に応じて２０mg／l Ｌ−ヒスチジ
ン塩酸塩、２０mg／l ウラシルを添加したものである
（プレートの場合はさらに２％アガーを加える）。 Leu
⁺ となった形質転換体は、３０℃で培養すると２〜４日
でコロニーを形成した。

【０１９２】これら分泌発現ベクターpNJ1053-BTG ある
いは pNJ1053-proBTG を保持する形質転換体をそれぞ
れ、プラスミドの脱落を防ぐため最少培地で３０℃、一
晩前培養した後、下に示す組成の合成培地１０mlに植え
つぎ（５％）３０℃、２日間振盪培養した。

【０１９３】 合成培地 ０．６７％ ＹＮＢ ８％ グルコース ２０mg／ｌ Ｌ−ヒスチジン塩酸塩 ２０mg／ｌ ウラシル ０．５％ Casamino acid （Difco 社） 次いでガラスビーズ法（Hitzeman, R.A.等 Science ,
219, 620-625 (1983)など）により菌体抽出液を調製し
た。すなわち培養液１０mlから遠心分離により集菌し、
滅菌水で１回洗浄後、１mlのTris-HCl (pH 6.0) に懸濁
する。これに１mlのガラスビーズ（ビーブラウン社、径
0.45-0.5mm）を加え、Vortexミキサーを用い０〜４℃で
１分間激しく撹拌を３回行う。低速遠心でガラスビーズ
を分離後、上清をエッペンドルフチューブに移し、さら
に12,000 rpmで５分間遠心し、その上清を取り抽出液と
した。

【０１９４】そこで、ＢＴＧ遺伝子産物が生成している
ことを確認するため、精製ＢＴＧを用いてウサギで作製
した抗ＢＴＧ抗体によるウェスタン・ブロッティング
を、ベクター社のVectastain ABC kitを用いて行なっ
た。発現分泌ベクターpNJ1053-BTG あるいはpNJ1053-pr
oBTGを保持する各々の酵母の菌体抽出液の総タンパク量
にして約１μｇになる量をＳＤＳ−ポリアクリルアミド
ゲル電気泳動にかけ、泳動後のゲルをメンブレン（Immo
bilon,ミリポア社）にトランスファーして抗原となるタ
ンパク質をメンブレンに結合させた。その後、ウサギ抗
ＢＴＧ抗体（抗体価６４倍のものを１０００倍希釈し
た）によるウェスタン・ブロッティングを行ない、遺伝
子産物をタンパクレベルで確認した。

【０１９５】その結果、以下の１，３，４のレーンにお
いて同一の位置に発色したバンドが現われ、抗ＢＴＧ抗
体との反応を示すタンパク質が精製ＢＴＧと同一分子量
の位置に検出できた。

【０１９６】１．：精製ＢＴＧ（コントロール） ２．：pNJ1053 を保持する酵母の菌体抽出液 ３．：pNJ1053-BTG （ＢＴＧ成熟体遺伝子）を保持する
酵母の菌体抽出液 ４．：pNJ1053-proBTG（ＢＴＧプロ配列−成熟体遺伝
子）を保持する酵母の菌体抽出液 なお、各々について培養上清もウェスタン・ブロッティ
ングを行なったが、培養上清にはバンドが検出されなか
った。また、レーン４のＢＴＧプロ配列−成熟体遺伝子
を組み込んだ分泌発現ベクターpNJ1053-proBTGを保持す
る酵母では、酵母内で合成したプロ配列のプロセシング
が、正しく行われたため、精製ＢＴＧと同一分子量の位
置にバンドが現われたものと考えられる。

【０１９７】

【配列表】配列番号：1 配列の長さ：993 配列の型：核酸 配列 GATTCTGATG ACAGAGTCAC TCCACCAGCT GAACCATTGG ATAGAATGCC AGATCCATAC 60 AGACCATCTT ACGGTAGAGC TGAAACTGTT GTCAACAACT ACATTAGAAA GTGGCAACAA 120 GTCTACTCTC ACAGAGATGG TAGAAAGCAA CAAATGACTG AAGAACAAAG AGAATGGTTG 180 TCTTACGGTT GTGTTGGTGT TACTTGGGTT AACTCTGGTC AATACCCAAC TAACAGATTG 240 GCTTTCGCTT CTTTCGATGA AGATAGATTC AAGAACGAAT TGAAGAACGG TAGACCAAGA 300 TCCGGTGAAA CTAGAGCTGA ATTCGAAGGT AGAGTTGCTA AGGAATCTTT CGATGAAGAA 360 AAGGGTTTCC AAAGAGCTAG AGAAGTTGCT TCTGTTATGA ACAGAGCTCT AGAAAACGCT 420 CACGATGAAT CTGCTTACTT GGATAACTTG AAGAAGGAAT TGGCCAACGG TAACGATGCT 480 TTGAGAAACG AAGATGCTAG ATCCCCATTC TACTCTGCTT TGAGAAACAC TCCATCTTTC 540 AAGGAAAGAA ACGGTGGTAA CCACGATCCA TCCAGAATGA AGGCTGTTAT TTACTCTAAG 600 CACTTCTGGT CTGGTCAAGA TAGATCTTCT TCTGCTGATA AGAGAAAGTA CGGTGATCCA 660 GATGCTTTCA GACCAGCTCC AGGTACCGGT TTGGTCGACA TGTCCAGAGA TAGAAACATT 720 CCAAGATCCC CAACTTCTCC AGGTGAAGGT TTCGTCAACT TCGATTACGG TTGGTTCGGT 780 GCTCAAACTG AAGCTGATGC TGATAAGACT GTTTGGACCC ATGGTAACCA CTACCACGCT 840 CCAAACGGTT CTTTGGGTGC TATGCACGTC TACGAATCTA AGTTCAGAAA CTGGTCTGAA 900 GGTTACTCTG ATTTCGATAG AGGTGCTTAC GTTATTACTT TCATTCCAAA GTCTTGGAAC 960 ACTGCTCCAG ACAAGGTCAA GCAAGGTTGG CCA ９
９３ 配列番号：２ 配列の長さ：117 配列の型：核酸 配列 AAGAGAAGAT CTCCAACTCC AAAGCCAACT GCTTCTAGAA GAATGACTTC TAGACACCAA 60 AGAGCTCAAA GATCTGCTCC AGCTGCTTCT TCTGCTGGTC CATCTTTCAG AGCTCCA 117 配列番号：3 配列の長さ：1322 配列の型：核酸 配列 TGCGGCGACG CGTAGGCAAT GGGGGTTCAT CGCGACGTGC TTCCGCACGG CCGCGTTCAA 60 CGATGTTCCA CGACAAAGGA GTTGCAGGTT TCCATGCGCT ATACGCCGGA GGCTCTCGTC 120 TTCGCCACTA TGAGTGCGGT TTATGCACCG CCGGATTCAT GCCGTCGGCC GGCGAGGCCG 180 CCGCCGACAA TGGCGCGGGG GAAGAGACGA AGTCCTACGC CGAAACCTAC CGCCTCACGG 240 CGGATGACGT CGCGACATCA ACGCGCTCAA CGAAGCGCTC CGGCCGCTTC GAGCGCCGGC 300 CCGTCGTTCC GGGCCCCCGA CTCCGACGAC AGGGTCACCC CTCCCGCCGA GCCGCTCGAC 360 AGGATGCCCG ACCCGTACCG TCCCTCGTAC GGCAGGGCCG AGACGGTCGT CAACAACTAC 420 ATACGCAAGT GGCAGCAGGT CTACAGCCAC CGCGACGGCA GGAAGCAGCA GATGACCGAG 480 GAGCAACGGG AGTGGCTGTC CTACGGCTGC GTCGGTGTCA CCTGGGTCAA TTCGGGTCAG 540 TACCCCACGA ACAGACTGGC CTTCGCGTCC TTCGACGAGG ACAGGTTCAA GAACGAGCTG 600 AAGAACGGCA GGCCCCGGTC CGGCGAGACG CGGGCGGAGT TCGAGGGCCG CGTCGCGAAG 660 GAGAGCTTTG ATGAAGAGAA GGGGTTCCAG CGGGCGCGTG AGGTGGCGTC CGTGATGAAC 720 AGGGCCCTGG AGAACGCCCA CGACGAGAGC GCTTACCTCG ACAACCTCAA GAAGGAACTG 780 GCGAACGGCA ACGACGCCCT GCGCAACGAG GACGCCCGTT CCCCGTTCTA CTCGGCGCTG 840 CGGAACACGC CGTCCTTTAA GGAGCGGAAC GGAGGCAATC ACGACCCGTC CAGGATGAAG 900 GCCGTCATCT ACTCGAAGCA CTTCTGGAGC GGCCAGGACC GGTCGAGTTC GGCCGACAAG 960 AGGAAGTACG GCGACCCGGA CGCTTTCCGC CCGGCCCCCG GGACCGGCCT GGTCGACATG 1020 TCGAGGGACA GGAACATTCC GCGCAGCCCC ACCAGCCCCG GTGAGGGATT CGTCAATTTC 1080 GACTACGGCT GGTTCGGCGC CCAGACGGAA GCGGACGCCG ACAAGACCGT CTGGACCCAC 1140 GGAAATCACT ATCACGCGCC CAATGGCAGC CTTGGTGCCA TGCATGTATA CGAGAGCAAG 1200 TTCCGCAACT GGTCCGAAGG TTACTCCGAC TTCGACCGCG GAGCCTATGT GATCACCTTC 1260 ATCCCCAAGA GCTGGAACAC CGCCCCCGAC AAGGTAAAGC AGGGCTGGCC GTGATGTGAG 1320 CG 1322

【図面の簡単な説明】

【図１】第１図。Streptoverticillium sp. 由来のクロ
ーンＤＮＡの制限地図。

【図２】第２図。Streptomyces lividans で発現したＢ
ＴＧのウェスタンブロット解析結果。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｎ 15/70 // Ｃ０７Ｋ 13/00 8619−4Ｈ (Ｃ１２Ｎ 15/54 Ｃ１２Ｒ 1:625） (Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｒ 1:865） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:465） (Ｃ１２Ｎ 9/10 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 15/70 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者 松井 裕 神奈川県川崎市川崎区鈴木町１番１号 味 の素株式会社中央研究所内 (72)発明者 鷲津 欣也 茨城県つくば市御幸が丘22番 天野製薬株 式会社筑波研究所内 (72)発明者 安藤 啓一 茨城県つくば市御幸が丘22番 天野製薬株 式会社筑波研究所内 (72)発明者 小池田 聡 茨城県つくば市御幸が丘22番 天野製薬株 式会社筑波研究所内

Claims (17)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 下記に示すアミノ酸配列をコードする塩
   基配列を含むＤＮＡ： 【表１】
2. 【請求項２】 下記に示す塩基配列を有する請求項１記
   載のＤＮＡ： 【表２】 GAT TCT GAT GAC AGA GTC ACT CCA CCA GCT GAA CCA TTG GAT AGA ATG CCA GAT CCA TAC AGA CCA TCT TAC GGT AGA GCT GAA ACT GTT GTC AAC AAC TAC ATT AGA AAG TGG CAA CAA GTC TAC TCT CAC AGA GAT GGT AGA AAG CAA CAA ATG ACT GAA GAA CAA AGA GAA TGG TTG TCT TAC GGT TGT GTT GGT GTT ACT TGG GTT AAC TCT GGT CAA TAC CCA ACT AAC AGA TTG GCT TTC GCT TCT TTC GAT GAA GAT AGA TTC AAG AAC GAA TTG AAG AAC GGT AGA CCA AGA TCC GGT GAA ACT AGA GCT GAA TTC GAA GGT AGA GTT GCT AAG GAA TCT TTC GAT GAA GAA AAG GGT TTC CAA AGA GCT AGA GAA GTT GCT TCT GTT ATG AAC AGA GCT CTA GAA AAC GCT CAC GAT GAA TCT GCT TAC TTG GAT AAC TTG AAG AAG GAA TTG GCC AAC GGT AAC GAT GCT TTG AGA AAC GAA GAT GCT AGA TCC CCA TTC TAC TCT GCT TTG AGA AAC ACT CCA TCT TTC AAG GAA AGA AAC GGT GGT AAC CAC GAT CCA TCC AGA ATG AAG GCT GTT ATT TAC TCT AAG CAC TTC TGG TCT GGT CAA GAT AGA TCT TCT TCT GCT GAT AAG AGA AAG TAC GGT GAT CCA GAT GCT TTC AGA CCA GCT CCA GGT ACC GGT TTG GTC GAC ATG TCC AGA GAT AGA AAC ATT CCA AGA TCC CCA ACT TCT CCA GGT GAA GGT TTC GTC AAC TTC GAT TAC GGT TGG TTC GGT GCT CAA ACT GAA GCT GAT GCT GAT AAG ACT GTT TGG ACC CAT GGT AAC CAC TAC CAC GCT CCA AAC GGT TCT TTG GGT GCT ATG CAC GTC TAC GAA TCT AAG TTC AGA AAC TGG TCT GAA GGT TAC TCT GAT TTC GAT AGA GGT GCT TAC GTT ATT ACT TTC ATT CCA AAG TCT TGG AAC ACT GCT CCA GAC AAG GTC AAG CAA GGT TGG CCA
3. 【請求項３】 下記に示すアミノ酸配列の全部又は一部
   を更に５′末端にコードする塩基配列を含む請求項１記
   載のＤＮＡ： 【表３】
4. 【請求項４】 下記に示す塩基配列を更に５′末端に含
   む請求項３記載のＤＮＡ： 【表４】 AAGAGAAGATCTCCAACTCCAAAGCCAACTGCTTCTAGAAGAATGACTTCTAGACACCAA ^{AGAGCTCAAAGATCTGCTCCAGCTGCTTCTTCTGCTGGTCCATCTTTCAGAGCTCCA}
5. 【請求項５】 下記に示す塩基配列を有する請求項３記
   載のＤＮＡ： 【表５】 ATGCGCTATA CGCCGGAGGC TCTCGTCTTC GCCACTATGA GTGCGGTTTA TGCACCGCCG GATTCATGCC GTCGGCCGGC GAGGCCGCCG CCGACAATGG CGCGGGGGAA GAGACGAAGT CCTACGCCGA AACCTACCGC CTCACGGCGG ATGACGTCGC GACATCAACG CGCTCAACGA AGCGCTCCGG CCGCTTCGAG CGCCGGCCCG TCGTTCCGGG CCCCCGACTC CGACGACAGG GTCACCCCTC CCGCCGAGCC GCTCGACAGG ATGCCCGACC CGTACCGTCC CTCGTACGGC AGGGCCGAGA CGGTCGTCAA CAACTACATA CGCAAGTGGC AGCAGGTCTA CAGCCACCGC GACGGCAGGA AGCAGCAGAT GACCGAGGAG CAACGGGAGT GGCTGTCCTA CGGCTGCGTC GGTGTCACCT GGGTCAATTC GGGTCAGTAC CCCACGAACA GACTGGCCTT CGCGTCCTTC GACGAGGACA GGTTCAAGAA CGAGCTGAAG AACGGCAGGC CCCGGTCCGG CGAGACGCGG GCGGAGTTCG AGGGCCGCGT CGCGAAGGAG AGCTTTGATG AAGAGAAGGG GTTCCAGCGG GCGCGTGAGG TGGCGTCCGT GATGAACAGG GCCCTGGAGA ACGCCCACGA CGAGAGCGCT TACCTCGACA ACCTCAAGAA GGAACTGGCG AACGGCAACG ACGCCCTGCG CAACGAGGAC GCCCGTTCCC CGTTCTACTC GGCGCTGCGG AACACGCCGT CCTTTAAGGA GCGGAACGGA GGCAATCACG ACCCGTCCAG GATGAAGGCC GTCATCTACT CGAAGCACTT CTGGAGCGGC CAGGACCGGT CGAGTTCGGC CGACAAGAGG AAGTACGGCG ACCCGGACGC TTTCCGCCCG GCCCCCGGGA CCGGCCTGGT CGACATGTCG AGGGACAGGA ACATTCCGCG CAGCCCCACC AGCCCCGGTG AGGGATTCGT CAATTTCGAC TACGGCTGGT TCGGCGCCCA GACGGAAGCG GACGCCGACA AGACCGTCTG GACCCACGGA AATCACTATC ACGCGCCCAA TGGCAGCCTT GGTGCCATGC ATGTATACGA GAGCAAGTTC CGCAACTGGT CCGAAGGTTA CTCCGACTTC GACCGCGGAG CCTATGTGAT CACCTTCATC CCCAAGAGCT GGAACACCGC CCCCGACAAG GTAAAGCAGG GCTGGCCG
6. 【請求項６】 化学合成により得られることを特徴とす
   る、請求項１〜４のいずれか一項記載のＤＮＡ。
7. 【請求項７】 クローニングにより得られることを特徴
   とする、請求項１，３又は５記載のＤＮＡ。
8. 【請求項８】 請求項１〜７のいずれか一項記載のＤＮ
   Ａを組込んだ発現分泌ベクター。
9. 【請求項９】 pOMPA-BTG である請求項８記載の発現分
   泌ベクター。
10. 【請求項１０】 pNJ1053-proBTGである請求項８記載の
    発現分泌ベクター。
11. 【請求項１１】 pNJ1053-BTG である請求項８記載の発
    現分泌ベクター。
12. 【請求項１２】 pIJ702-BTGである請求項８記載の発現
    分泌ベクター。
13. 【請求項１３】 請求項８〜１２のいずれか一項記載の
    発現分泌ベクターにより形質転換された形質転換体。
14. 【請求項１４】 大腸菌であることを特徴とする請求項
    １３記載の形質転換体。
15. 【請求項１５】 酵母であることを特徴とする請求項１
    ３記載の形質転換体。
16. 【請求項１６】 放線菌であることを特徴とする請求項
    １３記載の形質転換体。
17. 【請求項１７】 請求項１３〜１６のいずれか一項記載
    の形質転換体を培養することを特徴とする、トランスグ
    ルタミナーゼ活性を有するタンパク質の製造方法。