JP2005073628A - トランスグルタミナーゼの工業的結晶化方法及びトランスグルタミナーゼ製剤の製造方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】ストレプトミセス(Streptomyces)属の微生物が生産するトランスグルタミナーゼの粗酵素又は粗酵素を部分精製したものに塩化ナトリウム及び/又は塩化カリウムを添加して塩析を行うことを特徴とするトランスグルタミナーゼの工業的結晶化方法。
この発明において、塩化ナトリウム及び/又は塩化カリウムを飽和量まで徐々に添加しても良い。また、ストレプトミセス(Streptomyces)属の微生物は、ストレプトミセス・モバラエンシス(Streptomyces mobaraensis)又はストレプトミセス・ラベンデュラエ(Streptomyces lavendulae)でも良い。
【選択図】図1
Description
したがって、現在、工業的に製造されているTGaseは、発酵混合物から菌体等を除いた粗酵素液を限外濾過膜により脱塩濃縮後、アルコール分画沈殿等により部分精製されたものであるが、部分精製酵素であることに起因して以下のような様々な問題点があったため、TGaseの工業的な結晶化が強く望まれていた。
(1)プロテアーゼやアミラーゼ等の夾雑酵素や着色物質を含むため、使用目的により好ましくない影響を受けることがあり、厳格な品質管理を設定した製品の製造管理が必要で煩雑であった。また、これらの夾雑物を除き品質を上げようとすると収率が悪くコストも高くなるという問題があった。
(2)比活性の低下等の理由で安定化剤の種類や添加量に限界があり、乾燥時における失活などによる収率の低下の問題があった。
(3)結晶酵素であれば液状や高濃度懸濁液などの製剤化が容易であるが、部分精製では粉末以外、例えば、液状にするとプロテアーゼ等の夾雑酵素による失活の虞があり、また、沈殿剤等を添加して懸濁状又はペースト状にすると比活性が低いことから使用量が多くなり、最終製品への安定化剤や沈殿剤の添加の影響が大きくなるという問題があり、事実上粉末以外の製剤化は困難であった。
(4)上記(3)の理由から、現在、TGaseは粉末品として供給されているが、粉末を水に溶解する等の取り扱い時に粉末が飛散し易く、特に目、鼻にプロテアーゼと同様の軽い炎症を招く虞があった。
すなわち、本発明は、ストレプトミセス(Streptomyces)属の微生物が生産するトランスグルタミナーゼの粗酵素又は粗酵素を部分精製したものに塩化ナトリウム及び/又は塩化カリウムを添加して塩析を行うことを特徴とするトランスグルタミナーゼの工業的結晶化方法を要旨とする。ここで、粗酵素とは、ストレプトミセス(Streptomyces)属の微生物が生産するTGaseを含む培養濾液をいう。また、粗酵素を部分精製したものとは、粗酵素に簡便な精製操作を加え、TGaseが均一になるまで精製されないTGaseをいう。
TGaseを結晶化する塩類の種類について検討を行った。
市販品のTGase(味の素社製ActivaTG、ストレプトミセス・モバラエンシス(Streptomyces mobaraensis)が生産するTGaseの部分精製酵素製剤)から賦形剤等を除く目的で、0.2Mトリス−塩酸緩衝液pH6.0に溶解後、硫安塩析を行い、得られた沈殿物を同緩衝液に溶解した。この溶解液を限外濾過膜(旭化成社製ACP1010)を用いて脱塩濃縮した。この操作で賦形剤等が除かれたTGaseの部分精製酵素液を得た。なお、本酵素液のTGase活性は、326u/ml、比活性は8.7u/Ab280nmであった。
試薬A:0.2Mトリス塩酸緩衝液(pH6.0)、0.1Mヒドロキシルアミン、0.01M還元型グルタチオン、0.03Mベンジルオキシカルボニル−L−グルタミニルグリシン
試薬B:3N塩酸、12%トリクロロ酢酸、5%FeCl3・6H2O(O.1N−HClに溶解)
これらの溶液の1:1:1の混合液を試薬Bとした。
酵素液の0.05mlに試薬Aを0.5mlを加えて混合し、37℃で10分間反応後、試薬Bを加えて反応停止とFe錯体の形成を行った後、525nmの吸光度を測定する。対照として予め熱失活させた酵素液を用いて同様に反応させたものの吸光度を測定し、酵素液との吸光度差を求める。別に酵素液のかわりにL−グルタミン酸−γ−モノヒドロキサム酸を用いて検量線を作成し、前記吸光度差より生成されたヒドロキサム酸の量を求め、1分間に1μモルのヒドロキサム酸を生成する酵素活性を1単位とした。
また、比活性は、波長280nmにおける紫外線の吸光度を測定し、その吸光度当たりの酵素活性で表した。TGaseの活性の測定及び比活性の測定は、後記の各実施例においても同様に行った。
TGase生産菌のストレプトミセス・モバラエンシス(Streptomyces mobaraensis)S-8112株とストレプトミセス・ラベンデュラエ(Streptomyces lavendulae)No.466株を使用して可溶性デンプン2%、ショ糖5%、ポリペプトン2%、酵母エキス0.2%、硫酸マグネシウム0.1%、リン酸二カリウム0.2%、アデカノール0.05%を含む培地を用い、500ml容坂口フラスコに入れ、4日間30℃にて振とう培養しそれぞれ粗酵素液450mlと930mlを得た。なお、%は重量%で以下の各実施例においても同様である。
実施例2に記載のTGase生産菌のストレプトミセス・モバラエンシス(Streptomyces mobaraensis)S-8112株を使用して、可溶性澱粉4%、極東ペプトン2%、酵母エキス0.2%、肉エキス 0.2%、リン酸1カリウム 0.5%、リン酸2カリウム0.5%、硫酸マグネシウム0.05%、アデカノール0.04%を含む培地を用いて3L容ミニジャーファーメンターにより培養を行い、珪藻土を用いる濾過により粗酵素液を2800ml得た。
実施例2に記載のストレプトミセス・モバラエンシス(Streptomyces mobaraensis)S-8112株の変異により得たNo.140226株を使用して、可溶性デンプン4%、極東ペプトン2%、酵母エキス0.2%、肉エキス0.2%、リン酸一カリウム0.5%、リン酸二カリウム0.5%、硫酸マグネシウム0.05%、アデカノール0.04%含む培地を用い、3L容ミニジャーファーメンターにより培養を行い、珪藻土を用いる濾過により粗酵素液3800mlを得た。
実施例2に記載のストレプトミセス・モバラエンシス(Streptomyces mobaraensis)S-8112株の変異により得たNo.W42228株を使用して、可溶性澱粉4%、極東ペプトン2%、酵母エキス0.2%、肉エキス 0.2%、リン酸1カリウム 0.5%、リン酸2カリウム0.5%、硫酸マグネシウム0.05%、アデカノール0.04%を含む培地を用いて3L容ミニジャーファーメンターにより培養を行い、珪藻土を用いる濾過により粗酵素液を3600ml得た。
市販品のTGase(味の素社製ActivaTG、ストレプトミセス・モバラエンシス(Streptomyces mobaraensis)が生産するTGaseの部分精製酵素製剤)200gを0.2Mトリス−塩酸緩衝液pH6.0 1000mlに溶解した後、賦形剤等を除く目的で不溶物を珪藻土を用いた濾過により除き(濾液:1000ml)、硫安を450g加えて塩析した。4℃、3時間放置後、遠心分離により沈殿を集め、約1000mlの上記緩衝液に溶解後、限外濾過膜(旭化成社製ACP1010)を用いて脱塩濃縮して500mlとした。この部分精製酵素液に塩化ナトリウムを徐々に加え塩析結晶化を行った。得られた粗結晶の比活性は、結晶化前が8.7u/Ab280nmであったのに対し、10.9u/Ab280nmであった。また、珪藻土で濾過した製品溶解濾液の比活性は、7.1u/Ab280nmであった。回収率は、部分精製酵素液(表6の限外濾過膜処理液を参照)からは66%で、製品溶解濾液(表6の珪藻土濾過処理液を参照)からは60%であった。結晶化における各工程の結果を表6に示した。
Claims (8)
- ストレプトミセス(Streptomyces)属の微生物が生産するトランスグルタミナーゼの粗酵素又は粗酵素を部分精製したものに塩化ナトリウム及び/又は塩化カリウムを添加して塩析を行うことを特徴とするトランスグルタミナーゼの工業的結晶化方法。
- 塩化ナトリウム及び/又は塩化カリウムを飽和量まで徐々に添加することを特徴とする請求項1に記載のトランスグルタミナーゼの工業的結晶化方法。
- ストレプトミセス(Streptomyces)属の微生物がストレプトミセス・モバラエンシス(Streptomyces mobaraensis)又はストレプトミセス・ラベンデュラエ(Streptomyces lavendulae)である請求項1又は請求項2に記載のトランスグルタミナーゼの工業的結晶化方法。
- 結晶化に供される粗酵素又は粗酵素を部分精製したものの比活性が、2u/Ab280nm以上である請求項1〜請求項3のいずれかに記載のトランスグルタミナーゼの工業的結晶化方法。
- ストレプトミセス(Streptomyces)属の微生物が夾雑蛋白の少ないトランスグルタミナーゼを生産するものである請求項1〜請求項4のいずれかに記載のトランスグルタミナーゼの工業的結晶化方法。
- 請求項1〜請求項5のいずれかに記載のトランスグルタミナーゼの工業的結晶化方法を利用し、結晶化されたトランスグルタミナーゼに添加剤を含ませることを特徴とするトランスグルタミナーゼ製剤の製造方法。
- 添加剤がトランスグルタミナーゼの安定化に寄与する物質であることを特徴とする請求項6に記載のトランスグルタミナーゼ製剤の製造方法。
- トランスグルタミナーゼの安定化に寄与する物質がグルタミンペプチド、ペプチーノなどの蛋白質部分分解物、トレハロース、システィン、グルタチオン、亜硫酸水素ナトリウム、クエン酸塩及びリン酸塩から選ばれた1種又は2種以上であることを特徴とする請求項7に記載のなるトランスグルタミナーゼ製剤の製造方法。
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