CN107177582A - 一种液体酶制剂及制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种液体酶制剂及制备方法。本发明主要解决谷氨酰胺转氨酶液体制剂在常温下难保存的技术问题，其技术方案为：该酶制剂为谷氨酰胺转氨酶EC2.3.2.13的液体制剂，其组分含量为：谷氨酰胺转氨酶液体制剂的酶活为10‑1000u/ml、水分活度调节剂重量体积百分含量30‑80％、氧化还原电位调节剂重量体积百分含量0.0075‑1％、食品防腐剂重量体积百分含量0‑0.1％、pH调节剂补齐到100％体积。其制备方法为：酶液纯化、混合、除菌、灌装、得到成品。本发明实现了酶制剂常温下保持6个月酶活80％以上、性状稳定、无微生物腐败、使用效果良好。

Description

一种液体酶制剂及制备方法
技术领域
本发明公开了一种液体酶制剂及制备方法，具体涉及到一种可常温存储、性状稳定、酶活保存率超过80％的谷氨酰胺转氨酶(EC.2.3.2.13)液体制剂及制备方法，属于酶制剂领域和食品添加剂领域。
背景技术
谷氨酰胺转氨酶(EC.2.3.2.13，英文全称Amineγ-glutamyl-transferase，英文简称Transglutaminase，缩写名为TG)是一种蛋白交联酶，能以蛋白质肽链中赖氨酸的ε-氨基为酰基受体，催化蛋白质分子内和分子间形成ε-(γ-谷氨酰基)赖氨酸的异型肽键，改善蛋白质的乳化性、流变性、溶解性、起泡性等多种性质，赋予蛋白质特有的质构特性和粘合性，提高产品的色香味，具有很大的市场价值。
谷氨酰胺转氨酶最早是由Clarke等人从豚鼠肝脏中分离得到。1989年由日本Amano公司的Ando等人发明了微生物发酵法生产谷氨酰胺转氨酶，1997年由日本味之素公司实现了商业规模化生产，2001年我国将谷氨酰胺转氨酶正式列为食品添加剂。目前全球范围内主要发酵生产厂家为日本味之素公司，谷氨酰胺转氨酶产品品牌为Acvita，国内主要生产企业有上海青瑞食品科技有限公司，济南青瑞生物科技有限公司、泰兴市东圣食品科技有限公司、泰兴市一鸣生物制品有限公司、河南仰韶生化工程有限公司等企业，产品为固体粉末型酶制剂，并由上海青瑞食品科技有限公司率先使用立体真空包装，日本味之素公司至今采用粉末充氮包装。
目前谷氨酰胺转氨酶粉末制剂虽然已经实现规模化生产，并在食品加工行业获得广泛应用。但在生产、运输、贮存、应用中还存在很多问题：
1)生产成本：由于在谷氨酰胺转氨酶生产过程过程中，首先获得的发酵液体，酶液精制过程中，需要沉淀，干燥，粉碎等加工步骤，工序繁杂，导致生产成本上升；
2)安全防护：在生产和使用过程中谷氨酰胺转氨酶粉末制剂，容易扩散，导致车间环境变恶劣，设备难以清洗；操作空间充斥粉尘，防护困难，酶粉末被人体吸入后，引发强烈过敏性反应，严重损害操作人员的呼吸道器官，出现高烧、肺炎、休克等症状，对操作人员健康产生很大危害，目前为止，工厂里已经多次发生谷氨酰胺转氨酶引起咳嗽、发烧等过敏变态反应症状的事件；
3)包装问题：谷氨酰胺转氨酶粉末酶制剂采用真空包装，在抽真空时粉末容易吸入设备，造成一定损失；如果酶制剂包装封口不严，产生漏气现象，则容易发生吸潮、结块、酶活降低等现象，若采用充氮包装，由于充氮操作繁琐并导致大量扬尘，且生产成本大幅增加；
4)应用方面：众所周知，谷氨酰胺转氨酶只有在水中溶解状态才能发挥作用。在生产应用中，粉末制剂存在二次溶解过程，大大减少了酶发挥作用的时间。并且经常出现加水没完全溶解的现象或者直接添加粉末容易出现分布不均匀，同时使用设备进行滚揉操作时，容易黏连到设备上，导致粉末制剂利用率降低、应用效果差，从而不得不增加谷氨酰胺转氨酶粉末制剂用量；
5)酶制剂发展趋势：在生物酶制剂及各工业领域，已经有很多类型酶制剂采用了液体剂型，并解决了保存、运输以及应用过程中存在问题，实现了经济化绿色化生产和使用，如液体纤维素酶(专利公开号：CN103981168A、CN101381716)、液体植酸酶(专利公开号：CN101617740)、液体果胶酶(专利公开号：CN104531653A)、液体脂肪酶(专利公开号：CN103525797A)等，但目前在全球范围内尚未有商业化的常温长期稳定储存的谷氨酰胺转氨酶的液体制剂。
专利公开号CN 104024406A提供了一种谷氨酰转氨酶的液体酶制剂的制造方法，鉴于该方法为低温下最长保存期180天，且需要在冷冻的条件下储运，限制了该方法商业化使用，至今未见应用此方法制造的成品。开发一种可在常温条件(25℃，下同)下稳定的液体谷氨酰胺转氨酶稳定酶制剂成为当前食品工业急需解决的课题。
发明内容
本发明的目的之一是提供一种谷氨酰胺转氨酶(EC2.3.2.13)的液体制剂，其可以在常温下保存6个月，酶活保存率80％以上。
本发明的目的之二是提供一种谷氨酰胺转氨酶(EC2.3.2.13)的液体制剂的制备方法，该法制备得到的谷氨酰胺转氨酶液体制剂具有良好稳定性，可以在常温下保存6个月，酶活保存率80％以上。
本发明主要解决谷氨酰胺转氨酶液体制剂在常温下难保存的技术问题，可满足商业化生产和使用要求。
为了实现上述目的，需要先用实验和理论阐述发明技术方案，随后总结并给出本发明的技术方案，具体如下：
首先，通过考察pH、水分活度、氧化还原电位等理化因素对影响谷氨酰转氨酶液体在常温条件下酶活保存率(稳定性)的影响，确定谷氨酰胺转氨酶在常温下能够稳定保持的最佳pH范围，水分活度，氧化还原电位范围。
1、不同pH值下谷氨酰胺转氨酶酶液稳定性
取浓缩酶液，添加盐酸以及氢氧化钠，制成不同pH值谷氨酰胺转氨酶溶液，无菌过滤后置常温下2天考察酶活稳定性，具体结果如表1。
表1.不同pH值下的纯化浓缩酶液的酶活变化
pH调节剂 pH值 调节后酶活(u/ml) 2天后酶活(u/ml) 保存率％
HCL 4.0 85.6 60.5 70.68％
HCL 5.0 95.2 90.3 94.85％
NaOH 6.0 99.4 98.6 99.20％
NaOH 7.0 99.6 98.5 98.90％
NaOH 7.5 99.2 93.5 93.80％
NaOH 8.0 98.9 89.1 90.10％
NaOH 9.0 95.5 78.1 81.78％
NaOH 10.0 90.2 50.4 55.88％
由表1数据说明，谷氨酰胺转氨酶在pH值为5.0-9.0时，纯化酶液的酶活保存率达到80％以上，当pH高于9.0或低于4.0时，酶活降低很快，酶液的保存可选择pH值为5.0-9.0，其中优选pH为5.0-7.5。
2、不同水分活度下谷氨酰胺转氨酶液稳定性
取纯化酶液，先用pH调节剂调节pH到6.0，并用调节缓冲液稀释到1000u/ml，取10ml酶液，加入不同质量丙三醇(表2)，用缓冲液稀释到100ml，无菌过滤后，获得不同水分活度的液体酶制剂，常温放置10天后考察液体酶液稳定性，结果如表2。
表2.不同水分活度下的纯化浓缩酶液的酶活稳定性
液体酶量(ml) 丙三醇量(g) Aw 调节后酶活(u/ml) 10天后酶活(u/ml) 酶活保存率％
10 0 0.99 100 57.11 57.10
10 10 0.95 100 69.96 69.96
10 20 0.92 100 75.25 75.25
10 30 0.89 100 85.92 85.92
10 40 0.85 100 92.19 92.19
10 50 0.80 100 96.61 96.61
10 60 0.75 100 96.01 96.01
10 70 0.62 100 96.69 96.69
10 80 0.52 100 98.54 98.54
10 90 0.31 100 98.10 98.10
由表2数据说明，添加水分活度调节剂，能够延长谷氨酰胺转氨酶液体制剂的常温稳定性，当水分活度低于0.89时，10天酶活保存率达到85％以上，水分活度低于0.85时，酶活保存率到达92％；水分活度继续降低，对酶活的保存率影响不大。因此，水分活度低于0.89就能达到较好的保存率，但从原料添加成本考虑，故优选水分活度值区间为0.60-0.85。
3、不同氧化还原电位条件下谷氨酰转氨酶酶液常温稳定性
取纯化浓液酶液，添加pH调节剂，调节pH到6.0，然后用氧化还原电位调节剂硼氢化钠以及双氧水进行调节酶液的氧化还原电位到不同值，无菌过滤后，置常温下放置30、60、90天，检测样品酶液的酶活保存率，结果见表3。
表3.谷氨酰转氨酶液体制剂不同氧化还原电位酶活保存率
由表3数据说明，氧化还原电位对谷氨酰转氨酶液体制剂的稳定性影响非常大，氧化还原电位在(-400mv)-50mv时，常温下30天的保存率均超过80％，当液体酶制剂额的氧化还原电位低于50mv时，酶活保存率大大提升，电位值在-400mv到0mv之间，90天保存率会达到80％以上。优选液体酶制剂的电位区间为-400mv到0mv。
其次，考察各pH调节剂，水分活度调节剂，氧化还原电位调节剂对液体谷氨酰胺转氨酶稳定性的影响，筛选出合适的pH调节剂，水分活度调节剂，氧化还原调剂。
4、不同pH调节剂对谷氨酰胺转氨酶酶液稳定性影响
选择盐酸、硫酸、醋酸、乳酸、柠檬酸、苹果酸、植酸、磷酸、硝酸、草酸、氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸钠、碳酸氢钠、碳酸钾、碳酸氢钾、柠檬酸三钠、柠檬酸三钾、醋酸钠、醋酸钾、乳酸钠、乳酸钾、磷酸氢二钠、磷酸氢二钾、磷酸钠、磷酸钾以及自来水，纯净水，矿泉水中的一种，或者多种pH调节剂组成的缓冲液体系来调节纯化的谷氨酰胺转氨酶液体的pH到表1的范围内，考察不同pH调节剂和随机不同组合pH调节剂对液体谷氨酰胺转氨酶在常温下的稳定性，结果见表4-1、4-2、4-3。
表4-1.不同碱性pH调节剂对液体谷氨酰胺转氨酶稳定性影响
表4-2.不同酸性pH调节剂对液体谷氨酰胺转氨酶稳定性影响
表4-3.不同组合型pH调节剂对液体谷氨酰胺转氨酶稳定性影响
品种 pH 调节后酶活(u/ml) 2天后酶活(u/ml) 保存率(％)
纯水 5.8 99.1 98.8 99.70
自来水 6.7 99.5 98.8 99.30
矿泉水 5.9 99.7 98.4 98.70
0.02M磷酸钠缓冲液 7.0 99.8 98.1 98.30
0.02M柠檬酸钠缓冲液 6.0 99.5 98.4 98.89
0.02M乙酸钠缓冲液 5.5 99.6 99.1 99.50
0.02M乳酸钠缓冲液 5.5 99.3 98.4 99.09
由表4-1、4-2、4-3数据说明，所选的酸性pH调节剂、碱性pH调节剂等溶液等对酶液的常温保存无明显区别和变化，因此可以任意选择盐酸、硫酸、醋酸、乳酸、柠檬酸、苹果酸、植酸、磷酸、硝酸、草酸、氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸钠、碳酸氢钠、碳酸钾、碳酸氢钾、柠檬酸三钠、柠檬酸三钾、醋酸钠、醋酸钾、乳酸钠、乳酸钾、磷酸氢二钠、磷酸氢二钾、磷酸钠、磷酸钾、自来水、纯净水、矿泉水中的一种，或者多种pH调节剂组成的缓冲液体系来调节谷氨酰胺转氨酶液体的pH调节剂，考虑到生产操作上安全性以及在调节的操作中强酸强碱瞬间极端pH对谷氨酰胺转氨酶活的影响，优选含磷酸、醋酸、乳酸或柠檬酸中的一种或其盐的缓冲液等具有pH缓冲能力的调节剂。
5、不同水分活度调节剂及其用量对液体谷氨酰胺转氨酶常温稳定性影响
考察了常温无菌条件下，在谷氨酰胺转氨酶酶液中加入山梨糖醇、麦芽糖醇、丙二醇、丙三醇、木糖醇、聚乙二醇400、聚乙二醇600、聚乙二醇800、聚乙二醇20000、葡萄糖、海藻糖、蔗糖、麦芽糖、异麦芽糖、麦芽糊精、木糖醇一种或几种组合，调节液体酶制剂水分活度到0.75，无菌条件下放置10天，验证不同水分活度调节剂对谷氨酰胺转氨酶酶液稳定性的影响，具体结果表5-1。
表5-1.不同水分活度调节剂对谷氨酰胺转氨酶的酶活影响
由表5-1数据说明，山梨糖醇、麦芽糖醇、丙二醇、丙三醇、木糖醇、聚乙二醇400、聚乙二醇600、聚乙二醇800、聚乙二醇20000、海藻糖、蔗糖、麦芽糖、异麦芽糖、麦芽糊精、木糖醇一种或几种组合作为液体谷氨酰胺转氨酶水分活度调节剂在0.75的水分活度情况下，对常温液体酶制剂的稳定性均有较好的保护作用，从结果来看，优选含有山梨糖醇、麦芽糖醇、丙三醇的一种或者多元复配。用量为30-80％(w/v)，优选30-70％(w/v)。
选取表5-1中的几种水分活度调节剂，进一步考察其用量于常温下酶活保存率的关系，并放置于无菌条件和pH6.0保存，测定常温下10天后酶活保存率(％)，获得结果如表5-2。
表5-2.不同水分活度调节剂对谷氨酰胺转氨酶的酶活影响
注：表中A为麦芽糖醇；B为丙三醇；C为海藻糖；D为聚乙二醇600；E为丙三醇：山梨糖醇(9：1)；F为丙三醇：麦芽糖醇(7：3)；G为麦芽糖醇：山梨糖醇(9：1)；H为丙二醇：丙三醇：麦芽糖醇(1：5：4)；
由表5-2数据说明，在最佳pH条件下，当水分调节剂用量超过30％时，以上单体或者组合的水分活度调节剂获得常温下10天后液体酶活保存率均超过80％，当水分活度调节剂超过40％用量时，酶活保存率均超过86％；随着水分活度调节剂用量提高，酶活保存率均有所提高，但幅度不是很大。从成本角度出发，优选水分活度调节剂含量在30-70％(w/v)之间。
6、不同氧化还原电位调节剂对液体谷氨酰胺转氨酶常温稳定性影响
在优选的氧化还原电位范围内，我们考察了不同氧化还原电位调节剂对液体谷氨酰胺转氨酶稳定性的影响，氧化还原电位调节剂用根据GB2760-2014标准规定最大用量。实验将谷氨酰胺酶酶液用pH6.0柠檬酸缓冲液调节pH到6.0，丙三醇调节水分活度到0.73-0.75。
由表6和表7数据说明，通过不同氧化还原电位调节剂对液体谷氨酰转氨酶的氧化还原电位进行调节，在50mv到-150mv之间，在加有氧化还原电位调节剂的配方中，常温下90天酶活保存率都达到80％以上，已经具备一定的商业应用价值。除乳酸钠，乳酸钙等氧化还原电位调节剂外，其他所有氧化还原电位调节剂配方180天常温酶活保存率均在80％以上。
表6不同氧化还原电位调节剂对液体谷氨酰胺转氨酶液体制剂稳定性影响
表7中一种或多种(包括两种)氧化还原电位调节剂组合使用时，液体谷氨酰胺转氨酶酶活保存率在常温180天后都能获得80％以上，完全达到工业上生产应用的要求。考虑到成本以及人们对绿色天然的食品追求，我们优选天然来源的L-抗坏血酸及其盐，L-丝氨酸及其盐，L-半胱氨酸及其盐，茶多酚，大豆蛋白水解物，小麦蛋白水解物，酪蛋白水解物，壳聚糖水解物，竹叶抗氧化物，迷迭香提取物，甘草抗氧化提取物等天然电位调节剂；或低成本的超氧基歧化酶，葡萄糖氧化酶，亚硫酸氢钠，焦亚硫酸钠，焦亚硫酸钾，亚硫酸钠，低亚硫酸钠，植酸等，依据表6和表7所列的添加量，氧化还原电位调节剂的添加量设定为0.0075-1％。
表7多种氧化还原电位调节剂对对液体谷氨酰胺转氨酶液体制剂稳定性影响
电位调节剂 添加量(％) 添加量(％) 添加量(％) 添加量(％)
乙二胺四乙酸二钠 0.0030％ 0.0030％ 0.0030％ 0.0030％
还原型谷肤甘肽 0.10％ 0.10％ 0.10％
超氧歧化酶 100/ml 10U/ml
甘草抗氧化物 0.02％
电位(mv) -3 -41 -45 -53
起始酶活(U/ml) 99.7 99.4 99.8 99.2
180天酶活(U/ml) 81.8 89.5 90.3 90.3
酶活保存率(％) 82.0％ 90.0％ 90.5％ 91.0％
L-半胱氨酸盐酸盐 0.12％ 0.12％ 0.12％ 0.12％
抗坏血酸钠 0.50％ 0.50％ 0.50％
硫代二丙酸二月桂酯 0.02％ 0.02％
小麦蛋白水解物 1％
电位(mv) -130 -108 -126 -110
起始酶活(U/ml) 99.6 99.1 98.9 99.5
180天酶活(U/ml) 84.7 84.7 86.0 85.6
酶活保存率(％) 85.0％ 85.5％ 87.0％ 86.0％
亚硫酸氢钠 0.02％ 0.02％ 0.02％ 0.02％
大豆蛋白水解物 1％ 1％ 1％
竹叶抗氧化物 0.05％ 0.05％
D-异抗坏血酸钠 0.50％
电位(mv) 5 -8 -57 -52
起始酶活(U/ml) 98.8 99.3 99.1 98.9
180天酶活(U/ml) 80.0 85.7 87.2 87.5
酶活保存率(％) 81.0％ 86.3％ 88.0％ 88.5％
酪蛋白酸钠 1％ 1％ 1％ 1％
壳聚糖水解物 0.25％ 0.25％ 0.25％
茶多酚 0.01％ 0.01％
葡萄糖氧化酶 5U/ml
电位(mv) -30 -36 -42 -38
起始酶活(U/ml) 99.2 99.9 99.4 99.7
180天酶活(u/ml) 85.3 89.9 88.5 88.4
酶活保存率(％) 86.0％ 90.0％ 89.0％ 88.7％
通过添加pH调节剂，水分活度调节剂，以及氧化还原电位调节剂，我们将液体谷氨酰胺转氨酶调节到(pH5.0-9.0，水分活度＜0.89，氧化还原电位在-400mv到+50mv)范围内，液体酶制剂在无菌条件下实现了常温180天80％以上的保存率，基本达到了可商业上应用的稳定型液体谷氨酰胺转氨酶制剂。
然后，根据GB25594-2010要求，作为食品工业用酶制剂还需要达相应的微生物指标等卫生学标准。
进一步地考察水分活度、食品防腐剂，无菌过滤灌装等方法对液体谷氨酰胺转氨酶制剂菌落总数以及有害微生物指标的影响。
7、不同浓度水分活度调节剂对液体谷氨酰胺转氨酶常温保存菌落总数影响
谷氨酰胺转氨酶浓缩酶液调节pH到6.0，加入1％小麦水解蛋白(w/v)调节氧化还原电位，加入不同质量的丙三醇％(w/v)并添加pH调节剂补齐体积，获得液体酶制剂不同水分活度，在开放条件下分装，考察常温储存过程中酶制剂的菌落总数的变化，结果如表8。
表8.不同浓度水分活度调节剂对液体酶制剂中菌落总数的影响
由表8数据说明，当水分活度高于0.85时，甘油含量低于40％，谷氨酰胺转氨酶液体酶制剂在没有防腐剂的情况下，微生物会大量繁殖，在180天常温保存期内，其菌落总数超过有关法规要求。当水分活度调节剂大于40％的时候，由于本身的水分活度较低，基本能够抑制微生物的生长繁殖。考虑到食品工业用酶制剂的卫生指标要求，我们优选水分活度调节剂大于40％-80％的配方组成。
8、不同食品防腐剂对酶液中微生物的影响
取谷氨酰胺转氨酶酶液，加0.02M pH6.0柠檬酸钠缓冲溶液稀释到1000u/ml，取稀释后的酶液100ml，加入丙三醇300g，添加10g小麦蛋白水解物电位调节剂，加入0.02M pH6.0柠檬酸钠缓冲溶液定容到1000ml。按表9中加入GB2760-2014所列明的食品防腐剂，对照分别为A：未加任何防腐剂，B：未加防腐剂但采用0.1-0.22微米膜过滤无菌灌装；实验样品酶液开放条件下装入PET不透明的瓶子，置常温下放置180天，参照GB4789.2-2010食品安全国家标准《食品微生物学检验菌落总数测定》、GB 4789.3食品安全国家标准《食品微生物学检验大肠菌群计数》、GB/T 4789.38食品安全国家标准《食品微生物学检验大肠埃希氏菌计数》、GB 4789.4-2010食品安全国家标准《食品微生物学检验沙门氏菌检验》进行微生物检测，具体结果见表9。
表9.不同食品防腐剂对液体酶制剂中微生物的影响
由表9数据说明，在水分活度调节剂浓度低至30％(w/v)时，各食品防腐剂在法规允许添加量的条件下，均可以有效抑制微生物繁殖，从而保证谷氨酰胺转氨酶酶液的卫生安全。考虑到客户偏好和各种食品防腐剂的应用范围，生产中可以选择一种或者几种复配用于液体谷氨酰胺转氨酶的生产，优选天然食品防腐剂ε-聚赖氨酸，纳他霉素，溶菌酶，乳酸链球菌素等或者在工艺上采用0.1微米膜过滤除菌后无菌灌装，从应用成本考虑也可以选择添加山梨酸及山梨酸钾、双乙酸钠、脱氢乙酸钠、对羟基苯甲酸甲酯、焦亚硫酸钾、焦亚硫酸钠中的一种或多种。或者在工艺上采用0.1微米膜过滤除菌后无菌灌装。
9、不同酶活力的液体制剂在常温下的稳定性影响
取不同量的纯化浓缩酶液，加入50％(w/v)丙三醇，0.1％(w/v)亚硫酸氢钠，并添加pH调节剂补齐体积至1000ml，无菌过滤后置常温下放置180天后测定酶活比较酶活保存率％。
表10.不同酶活的酶液对液体谷氨酰胺转氨酶的稳定性
酶液添加重％(v/v) 酶液添加体积(ml) 调节后酶(u/ml) 180天后酶(u/ml) 酶活保存率％
0.4％ 4ml 10.2 10.1 99.02
2％ 20ml 50.1 49.2 98.20
4％ 40ml 99.9 98.2 98.30
8％ 80ml 200.1 197.2 98.55
20％ 200ml 498.8 495.8 99.40
30％ 300ml 749.9 742.3 98.99
40％ 400ml 1000.0 991.3 99.13
45％ 450ml 1124.5 1112.4 98.92
由表10可以看出不同酶活的酶液对液体谷氨酰胺转氨酶的稳定性影响不是很明显，但从实际使用情况看，液体制剂的酶活应控制在10-1000酶活为最合适。
通过上述各种理化因素对谷氨酰胺转氨酶酶液在常温条件下酶活保存率(稳定性)的影响的考察，我们确定谷氨酰胺转氨酶液体制剂的在常温下能够稳定保持的最佳pH范围以及pH调节剂的种类，水分活度范围以及水分调剂用量，氧化还原电位范围以及可以应用于谷氨酰胺转氨酶液体制剂的氧化还原电位调节剂的种类。
进一步地，确定了生产上可以采用无菌过滤灌装或添加防腐剂的方法实现液体酶制剂常温稳定保存的方法。
本发明以多方法联合使用提高酶稳定性、达到协同增强酶稳定性为原则，并通过对生产过程中的中间指标参数控制，成功解决了谷氨酰胺转氨酶液体制剂在常温下保存问题，并研究出一种常温下稳定性良好、可长期保存、可商业规模化生产的谷氨酰胺转氨酶液体制剂，对于谷氨酰胺转氨酶的生产成本降低、节能环保、健康使用、市场推广具有重要意义。
综上所述，本发明的技术方案具体内容如下：
一种液体酶制剂，该液体酶制剂为一种含10-1000u/ml酶活力的谷氨酰胺转氨酶EC2.3.2.13液体酶制剂；
一种液体酶制剂，各组分含量为：谷氨酰胺转氨酶液体制剂的酶活为10-1000u/ml、水分活度调节剂重量体积百分含量30-80％、氧化还原电位调节剂重量体积百分含量0.0075-1％、食品防腐剂重量体积百分含量0-0.1％、pH调节剂补齐到100％体积。
该液体酶制剂的理化性质有如下特点：
(1)液体酶制剂的pH5.0-9.0；优选pH5.0-7.5；
(2)水分活度Aw≤0.89；优选水分活度0.60-0.85；
(3)氧化还原电位为(-400mv)-50mv；优选氧化还原电位为(-400mv)-0mv；
所述的pH调节剂为盐酸、硫酸、醋酸、乳酸、柠檬酸、苹果酸、植酸、磷酸、硝酸、草酸、氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸钠、碳酸氢钠、碳酸钾、碳酸氢钾、柠檬酸三钠、柠檬酸三钾、醋酸钠、醋酸钾、乳酸钠、乳酸钾、磷酸氢二钠、磷酸氢二钾、磷酸钠、磷酸钾、自来水、纯净水、矿泉水中的一种，或者多种pH调节剂组成的缓冲液体系；优选含磷酸、醋酸、乳酸或柠檬酸中的一种或其盐的缓冲液等具有较强pH缓冲能力的调节剂；
所述的水分活度调节剂为山梨糖醇、麦芽糖醇、丙二醇、丙三醇、木糖醇、聚乙二醇、海藻糖、蔗糖、麦芽糖、异麦芽糖、麦芽糊精、木糖醇、甘露糖醇中的一种或者多种，优选含有山梨糖醇、麦芽糖醇、丙三醇的一种或者多元复配。用量为30-80％(w/v)，优选30-70％(w/v)；
所述的氧化还原电位调节剂包括L-抗坏血酸及其盐、L-丝氨酸及其盐、L-半胱氨酸及其盐、茶多酚、大豆蛋白水解物、小麦蛋白水解物、酪蛋白水解物、壳聚糖水解物、竹叶抗氧化物、迷迭香提取物、甘草抗氧化提取物、超氧基歧化酶、葡萄糖氧化酶、亚硫酸氢钠、焦亚硫酸钠、焦亚硫酸钾、亚硫酸钠、低亚硫酸钠、植酸等一种或者几种，用量为0.0075％-1％；
所述的食品防腐剂为ε-聚赖氨酸、纳他霉素、溶菌酶、乳酸链球菌素、山梨酸钾、脱氢乙酸钠、双乙酸钠、对羟基苯甲酸甲酯、月桂酰精氨酸乙酯盐酸盐、焦亚硫酸钾、焦亚硫酸钠中的一种或多种，一般添加量为0％-0.1％。
一种液体酶制剂的制备方法，其特征在于，步骤具体如下：
(1)酶液纯化：将粗酶液压滤、微滤、二次超滤，得到纯化的浓缩酶液；
(2)混合：定量量取称取纯化浓缩酶液，水分活度调节剂、氧化还原电位调节剂，添加食品防腐剂或不添加，混合，用pH调节剂补齐到100％体积，混合均匀，检测液体酶制剂相关参数使其满足pH5.0-9.0、水分活度Aw≤0.89、氧化还原电位为(-400mv)-+50mv；
(3)除菌：采用0.1-0.22μm膜过滤除菌无菌灌装；
(4)包装：采用无菌灌装或其他相关的液体包装工艺。
本发明首次实现了谷氨酰胺转氨酶液体制剂在常温下保持6个月酶活不低于80％，溶液性状稳定，达到了市场商业化要求，便于生产、使用效果好，无须冷藏或冷链运输。
本发明创新点：
本发明首次实现了谷氨酰胺转氨酶液体酶制剂在常温条件下存储6个月，酶活保存率超过80％，溶液性状稳定，达到了市场商业化要求，便于生产、使用效果良好，无须冷藏或冷链运输。本发明对推进谷氨酰胺转氨酶市场应用和发展具有重大意义。
本发明首次发现，体系中氧化还原电位是保持液体谷氨酰胺转氨酶常温稳定性的最关键因素。当液体酶制剂的氧化还原电位在(-400mv)-+50mv区间时，谷氨酰胺转氨酶液体活性在常温下的稳定性获得大大提升。谷氨酰胺转氨酶作为一种有催化活性的大分子蛋白，要保持酶分子的稳定性，必须最大限度地保持三级结构的稳定性。而作为大分子内部的基团和片段由于组成的氨基酸序列的差异，具有不同的荷电特征。在液体体系中，表现出典型的两性电解质的特性。由于三级结构依赖于基团和片段间的范德华力等非共价键来维护，这种较弱的电荷作用非常容易受到酶分子所处的液体体系的氧化还原电位影响。当液体体系氧化还原电位高于酶分子的稳定电位时，谷氨酰胺转氨酶分子在体系中作为还原剂被氧化；当氧化还原电位低于的酶分子的稳定电位时，谷氨酰胺转氨酶分子在体系中作为氧化剂被还还原，导致酶分子三级结构的崩溃失活。本发明通过选择合适的氧化还原电位调节剂，将液体酶制剂的电位调节到上述电位区间，谷氨酰胺转氨酶所处的环境氧化还原电位刚好在酶分子的稳定区间，从而获得常温稳定的液体型谷氨酰胺转氨酶制剂。
因此，本发明配方首次创新性地添加了氧化还原电位调节剂，如还原型谷胱甘肽、L-半胱氨酸及其盐酸盐、小麦蛋白水解物、壳聚糖水解物、竹叶抗氧化物、迷迭香提取物、甘草抗氧化提取物、亚硫酸盐等，从根本上实现了谷氨酰胺转氨酶液体制剂的常温稳定性，是关键性配方。
本发明的配方还采用了水分活度调节剂和pH调节剂，其中缓冲液可有效缓冲加入各添加物后，引起液体酶制剂pH变化，并使得液体谷氨酰胺转氨酶保持在最佳pH范围内。加入水分活度调节剂，可使得液体酶制剂处于较低水分活度Aw，同时有利于抑制微生物繁殖和提高酶分子空间稳定性，如本发明使用了含有丰富羟基单元的水分活度调节剂，如海藻糖、聚乙二醇、山梨糖醇等物质，可极大稳定谷氨酰胺转氨酶分子的空间结构。将水分活度调节剂、氧化还原电位调节剂、pH调节剂联合使用，可起到协调维持酶稳定性，达到最佳的稳定效果。
在制备工艺上，本发明采用了混合法制备液体谷氨酰胺转氨酶制剂，先将谷氨酰胺转胺酶浓缩酶液或酶粉进行纯化，由于谷氨酰胺转氨酶本身分子量约为38-45KDa，故先进行压滤、微滤(孔径0.1-1μm)，此步骤可起到除去菌体固形物、颗粒等沉淀作用；然后经过超滤(截留分子量100-200KDa)此步骤可除去大部分微生物，减缓微生物腐败，减少微生物对酶的影响；最后超滤(截留分子量10-30KDa)得到截留的纯化浓缩酶液。之后根据配方将水分活度调节剂、氧化还原电位调节剂、食品防腐剂等调配后，用pH调节剂调节pH，混合均匀，检测相关参数，再通过调节剂进行微调，使满足该制剂的理化性质，将混合后溶液再次通过膜过滤除菌，之后灌装，使得整个溶液达到无菌或少菌环境，同时可选用食品防腐剂防止液体酶制剂在储运过程中的细菌滋生。根据本发明配方和此制备方法，可极大提升谷氨酰胺转氨酶的热稳定性，延长了液体酶制剂的保质期。
本发明中液体谷氨酰胺转胺酶酶制剂配方中所涉及到各种成分成本低廉易得，具有食品级别来源。该谷氨酰胺转胺酶液体酶制剂配方也符合食品安全和食品添加剂等相关国家标准要求。该液体酶制备工艺科学合理，生产高效，相比冻干法制备粉末酶制剂工艺以及成本大大简化，几乎无酶活损失，大大提高了生产效率。符合国家推广的节能环保、健康用酶、绿色经济的理念。
附图说明
图1为一种液体酶制剂的制备流程示意图。
具体实施方式
以下实施例是为了更好地理解本发明，本发明的权利包括但不限于以下实施例叙述的内容，任何根据本行业的常规知识所做的修订和改进均不影响本发明的权利。实施过程如图1所示。
实施例1
谷氨酰胺转氨酶粗液的制备使用微生物发酵法，可参照专利(专利公开号：EP0379606B1)：以茂原链轮丝菌(Streptomyces mobaraensis)为出发菌株，用接种环挑取少许生长良好的菌落接种于斜面培养基上，30℃恒温培养7天。经活化后的菌种，再接入种子培养基中，30℃培养48小时，按照10％接种量添加到发酵培养基中，30℃培养48-72小时，得到谷氨酰胺转氨酶粗液，酶粗液的纯化浓缩依照下面步骤进行：
1)压滤：孔径1μm，操作压力为0.20MPa，温度20℃，取滤液；
2)微滤：孔径0.25μm，操作压力为0.25MPa，温度20℃，取滤液；
3)超滤：截留分子量为100KDa，操作压力为0.30MPa，温度20℃，取滤液；
4)超滤：截留分子量为10KDa，操作压力为0.30MPa，温度20℃，取截留液，即纯化的浓缩酶液。
检测酶活用氧肟酸法(彭灿.微生物谷氨酰胺转胺酶稳定性的研究[D].华东师范大学，2007)，(下同)，获得酶活为2500u/ml的谷氨酰胺转氨酶纯化浓缩酶液。检测得pH为5.80，水分活度0.95，氧化还原电位为60mv，备用。
实施例2
谷氨酰胺转氨酶粗液的制备使用酶粉溶解法，称取一定量纯水，置带搅拌功能的容量中，将酶活为5000-8000u/ml的谷氨酰胺转氨粉末(上海青瑞食品科技有限公司生产的酶粉末)缓缓加入，边加边搅拌进行溶解得一定浓度的酶液，经微滤除菌，获得澄清的谷氨酰胺转氨酶溶液，酶活力为2500u/ml获得酶活为2500u/ml的谷氨酰胺转氨酶纯化浓缩酶液。检测得pH为6.30，水分活度0.95，氧化还原电位58mv，备用。
实施例3
一种液体谷氨酰胺转氨酶的制备方法，该液体酶总重量为1000ml，制备方式如下，根据配料表11称取，
表11.一种液体谷氨酰胺转氨酶的制备
称取配方中的物料，混合均匀，通过0.1微米无菌膜过滤制得性状为浅黄色溶液，测定氧化还原电位为-100mv、水分活度0.79、pH6.0、酶活为498.1u/ml，灌装于10瓶100mL的PET不透光瓶中，最终制备成的液体型谷氨酰胺转氨酶制剂，置常温下保存180天后观察本配方酶制剂，并检测酶活，计算酶活保存率，参照GB4789.2-2010食品安全国家标准《食品微生物学检验菌落总数测定》、GB 4789.3食品安全国家标准《食品微生物学检验大肠菌群计数》、GB/T 4789.38食品安全国家标准《食品微生物学检验大肠埃希氏菌计数》、GB 4789.4-2010食品安全国家标准《食品微生物学检验沙门氏菌检验》进行微生物检测。结果发现，液体酶制剂外观，气味等未发现明显变化，酶活保存率为86％，微生物指标符合GB25594-2010标准要求，可以用于商业化。
实施例4
取实施例2中谷氨酰胺转氨酶纯化浓缩酶液，按表12配方配制液体谷氨酰胺转氨酶制剂，混合均匀后，按实施例3中的有关方法测定pH，水分活度，氧化还原电位，起始酶活，然后采用0.1微米无菌膜过滤，无菌条件下分装于PET瓶中，常温180天后观察本方法制得的谷氨酰胺转氨酶液体制剂的外观，并按实施例3的有关方法测定终点酶活，微生物指标等，计算酶活保存率。
表12.一种液体谷氨酰胺转氨酶的制备
结果发现，本方法制得的谷氨酰胺转氨酶制剂具有良好的稳定性，外观没有明显可见变化，酶活保存率为82％。微生物指标达到GB25594-2010标准要求，可以用于商业化。采用0.1微米无菌膜过滤以及无菌灌装可以确保液体酶制剂酶活保存率达到80％，并确能够控制30％水分活度调节剂液体酶制剂配方在保存期的微生物指标。
实施例5
表13.一种液体谷氨酰胺转氨酶的制备
以上物料混合均匀后，于开放的环境中直接灌装于PET瓶中，常温下放置180天，本方法制得的谷氨酰胺转氨酶制剂具有良好的稳定性，外观没有明显可见变化，酶活保存率为84％。微生物指标达到GB25594-2010标准要求，可以用于商业化。
实施例6
表14.一种液体谷氨酰胺转氨酶的制备
取表14中的有关组分，混合均匀制成谷氨酰胺转氨酶液体制剂，测定相关参数，开放条件下灌装于规格为1L的PET瓶中，常温放置180天，观察液体酶制剂的外观，测定酶活和微生物指标。结果表明，180天常温放置，酶活保存率达到87％，微生物指标符合要求，获得了一种稳定型谷氨酰转氨酶液体制剂。
实施例7
表15.一种液体谷氨酰胺转氨酶的制备
取表15中的有关组分，混合均匀制成谷氨酰胺转氨酶液体制剂，测定相关参数，开放条件下灌装于规格为1L的PET瓶中，常温放置180天，观察液体酶制剂的外观，测定酶活和微生物指标。结果表明：在添加防腐剂的情况下，180天常温放置，酶活保存率达到89％，微生物指标符合要求，获得了一种稳定型谷氨酰转氨酶液体制剂。
实施例8
取表16中的有关组分，混合均匀制成谷氨酰胺转氨酶液体制剂，测定相关参数，开放条件下灌装于规格为1L的PET瓶中，常温放置180天，观察液体酶制剂的外观，测定酶活和微生物指标。结果表明：180天常温放置，酶活保存率达到88％，微生物指标符合要求，获得一种稳定型谷氨酰转氨酶液体制剂，其电位调节剂，水分活度调节剂为混合组份，并含有防腐剂。
表16.一种液体谷氨酰胺转氨酶的制备
实施例9
表17.一种液体谷氨酰胺转氨酶的制备
取表17中的有关组分，混合均匀制成谷氨酰胺转氨酶液体制剂，测定相关参数，开放条件下灌装于规格为1L的PET瓶中，常温放置180天，观察液体酶制剂的外观，测定酶活和微生物指标。结果表明：180天常温放置，酶活保存率达到88％，微生物指标符合要求，获得一种酶活力单位为1000u/ml的稳定型谷氨酰转氨酶液体制剂。
实施例10
取表18中的有关组分，混合均匀制成谷氨酰胺转氨酶液体制剂，测定相关参数，开放条件下灌装于规格为1L的PET瓶中，常温放置180天，观察液体酶制剂的外观，测定酶活和微生物指标。结果表明：180天常温放置，酶活保存率达到81.5％，微生物指标符合要求，获得一种酶活力单位为10u/ml，pH5.5稳定型谷氨酰转氨酶液体制剂。
表18.一种液体谷氨酰胺转氨酶的制备
实施例11
取表19中的有关组分，混合均匀制成谷氨酰胺转氨酶液体制剂，测定相关参数，开放条件下灌装于规格为1L的PET瓶中，常温放置180天，观察液体酶制剂的外观，测定酶活和微生物指标。结果表明：180天常温放置，酶活保存率达到81％，微生物指标符合要求，获得一种酶活力单位为99.8u/ml，pH＝8.0稳定型谷氨酰转氨酶液体制剂。
表19.一种液体谷氨酰胺转氨酶的制备
实施例12
取表20中的有关组分，混合均匀制成谷氨酰胺转氨酶液体制剂，测定相关参数，开放条件下灌装于规格为1L的PET瓶中，常温放置180天，观察液体酶制剂的外观，测定酶活和微生物指标。结果表明：180天常温放置，酶活保存率达到81％，微生物指标符合要求，获得一种酶活力单位为100u/ml，pH＝6.0，氧化还原电位为-400mv稳定型谷氨酰转氨酶液体制剂。鉴于此制剂中硼氢化钠不符合食品卫生法规要求，因此，本配方液体酶制剂仅仅可用于科研或其他非食品添加目的。
表20.一种液体谷氨酰胺转氨酶的制备
实施例13
取表21中的有关组分，混合均匀制成谷氨酰胺转氨酶液体制剂，测定相关参数，开放条件下灌装于规格为1L的PET瓶中，常温放置180天，观察液体酶制剂的外观，测定酶活和微生物指标。结果表明：180天常温放置，酶活保存率达到82％，微生物指标符合要求，获得了一种酶活力单位为50u/ml，pH＝6.0，氧化还原电位为50mv稳定型谷氨酰转氨酶液体制剂，
表21.一种液体谷氨酰胺转氨酶的制备
实施例14
表22.一种液体谷氨酰胺转氨酶的制备
取表22中的有关组分，混合均匀制成谷氨酰胺转氨酶液体制剂，测定相关参数，开放条件下灌装于规格为1L的PET瓶中，常温放置180天，观察液体酶制剂的外观，测定酶活和微生物指标。结果表明：180天常温放置，酶活保存率达到84％，微生物指标符合要求，获得了一种酶活力单位为100u/ml，pH＝6.0，氧化还原电位为0mv稳定型谷氨酰转氨酶液体制剂。
实施例15
取表23中的有关组分，混合均匀制成谷氨酰胺转氨酶液体制剂，测定相关参数，开放条件下灌装于规格为1L的PET瓶中，常温放置180天，观察液体酶制剂的外观，测定酶活和微生物指标。结果表明：180天常温放置，酶活保存率达到89％，微生物指标符合要求，获得了一种酶活力单位为50u/ml，水分活度0.61，氧化还原电位为-140mv稳定型谷氨酰转氨酶液体制剂，本方案不含防腐剂。
表23.一种液体谷氨酰胺转氨酶的制备
实施例16
按实施例15配方中的有关组份，混合均匀制成谷氨酰胺转氨酶液体制剂，测定相关参数，开放条件下灌装于规格为1L的不透光PET瓶中，常温放置180天，观察液体酶制剂的外观，测定酶活和微生物指标。结果表明：180天常温放置，酶活保存率达到88％，微生物指标符合要求，获得了一种酶活力单位为101u/ml，水分活度0.85，氧化还原电位为-38mv稳定型谷氨酰转氨酶液体制剂，酶制剂包装为不透光材料，对酶稳定性没有明显影响。
实施例17
将实施例7制得的液体谷氨酰胺酶液体制剂，常温放置180天后，测定酶活为98.79u/ml。用于香肠制作中，具体配方和工艺如表24-1，对照采用济南青瑞生物科技有限公司市售谷氨酰胺转氨酶粉末型制剂，使用前测定酶活为100u/g。
表24-1.液体、粉末谷氨酰胺转氨酶用于香肠制造
香肠制备完成后测定成品凝胶强度、弹性、感官评分等指标，实验结果如下表24-2所示。
表24-2.液体、粉末型谷氨酰胺转氨酶制剂对香肠指标的影响
项目 样品A 样品B 样品C
凝胶强度g/cm2) 463 396 244
弹性(mm) 2.502 2.071 1.105
蒸煮损失(％) 2.8％ 2.9％ 4％
感官评分(满分100分) 92.1分 87.7分 75.6分
实验测试结果表明液体谷氨酰胺转氨酶制剂在香肠应用中取得良好效果，在香肠成品的凝胶强度，弹性等性能指标对比同剂量的粉末谷氨酰胺转氨酶制剂，有明显提升。蒸煮损失虽然有所改善，但不是很明显，感官评定上有明显提高。
实施例18
将实施例5制得液体谷氨酰胺转氨酶产品(99.5u/mL)应用于制备千页豆腐，对照采用市售粉末酶制剂产品A(谷氨酰胺转氨酶，生产单位：泰兴市东圣食品科技有限公司，型号TG-TI，批号：B20150926，标称酶活116u/g，我实验室实测酶活108u/g)，B(谷氨酰胺转氨酶，生产单位：泰兴市一鸣生物制品有限公司，型号TG-B，批号：20150824：，标称酶活：110u/g，我实验室实测酶活100u/g)，大豆分离蛋白生产商为山东禹王集团，木薯变性淀粉为玫瑰牌，大豆油为中粮集团供应，I+G以及食盐购自麦德龙超市，C对照为济南青瑞生物科技有限公司粉末酶制剂百帮TG-I，实测酶活110u/ml。按表25-1配方和工艺制作千页豆腐。
表25-1.液体、粉末谷氨酰胺转氨酶用于千页豆腐生产
取上述不同谷氨酰胺酶制剂制得的千页豆腐，测定其凝胶强度，弹性，并对色泽，口感等。结果如表25-2
表25-2.液体、粉末谷氨酰胺转氨酶生产千页豆腐品质评价
测定项目 实施例14样品 对照A 对照B 对照C
凝胶强度(g/cm2) 1036 958 946 963
弹性(mm) 7.188 6.771 6.282 6.845
颜色 乳白色 乳白色 乳白色 乳白色
口感 优 优 偏软 优
质地 细腻 细腻 细腻 细腻
风味 醇正适口 醇正 醇正 醇正适口
沸水耐煮能力 优 优 良 优
-18℃冷冻48小时变化 无可见冰晶 无可见冰晶 无可见冰晶 无可见冰晶
实验测试结果表明液体谷氨酰胺转氨酶制剂在千页豆腐应用中相比较粉末型谷氨酰胺转氨酶制剂，在千页豆腐生产过程中，能够完全替代粉末型制剂。所生产的千页豆腐品质有适当改善。有商业化推广价值。
以上所述仅为本发明的优选实施案例和应用案例而已，并不局限于本发明，对于本领域及相关领域的科研与技术人员来说，本发明可以很容易有各种更改和变化。凡在本发明的思路和原则之内，所作的任何修改、等同替换、方法改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种液体酶制剂，其特征在于该液体酶制剂为一种含10-1000u/ml酶活力的谷氨酰胺转氨酶EC2.3.2.13液体酶制剂，各组分含量为：谷氨酰胺转氨酶液体制剂的酶活为10-1000u/ml、水分活度调节剂重量体积百分含量30-80％、氧化还原电位调节剂重量体积百分含量0.0075-1％、食品防腐剂重量体积百分含量0-0.1％、pH调节剂补齐到100％体积，所述液体酶制剂的氧化还原电位为-400mv-+50mv。
2.根据权利要求1所述的一种液体酶制剂，其特征在于该液体酶制剂的理化性质为：
1)液体酶制剂的pH5.0-9.0；
2)水分活度Aw≤0.89。
3.根据权利要求1或2所述的一种液体酶制剂，其特征在于该液体酶制剂的理化性质为：
1)液体酶制剂的pH为5.0-7.5；
2)水分活度Aw为0.6-0.85；
3)氧化还原电位为-400mv-0mv。
4.根据权利要求1所述的一种液体酶制剂，其特征在于所述的水分活度调节剂为山梨糖醇、麦芽糖醇、丙二醇、丙三醇、木糖醇、聚乙二醇、海藻糖、蔗糖、麦芽糖、异麦芽糖、麦芽糊精、木糖醇、甘露糖醇中的一种或多种。
5.根据权利要求1所述的一种液体酶制剂，其特征在于所述的氧化还原电位调节剂包括L-抗坏血酸及其盐、L-丝氨酸及其盐、L-半胱氨酸及其盐、茶多酚、大豆蛋白水解物、小麦蛋白水解物、酪蛋白水解物、壳聚糖水解物、竹叶抗氧化物、迷迭香提取物、甘草抗氧化提取物、超氧基歧化酶、葡萄糖氧化酶、亚硫酸氢钠、焦亚硫酸钠、焦亚硫酸钾、亚硫酸钠、低亚硫酸钠、植酸等一种或多种。
6.根据权利要求1所述的一种液体酶制剂，其特征在于所述的食品防腐剂为ε-聚赖氨酸、纳他霉素、溶菌酶、乳酸链球菌素、山梨酸钾、脱氢乙酸钠、双乙酸钠、对羟基苯甲酸甲酯、月桂酰精氨酸乙酯盐酸盐、焦亚硫酸钾、焦亚硫酸钠中的一种或多种。
7.根据权利要求1所述的一种液体酶制剂，其特征在于所述的pH调节剂为盐酸、硫酸、醋酸、乳酸、柠檬酸、苹果酸、植酸、磷酸、硝酸、草酸、氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸钠、碳酸氢钠、碳酸钾、碳酸氢钾、柠檬酸三钠、柠檬酸三钾、醋酸钠、醋酸钾、乳酸钠、乳酸钾、磷酸氢二钠、磷酸氢二钾、磷酸钠、磷酸钾、自来水、纯净水、矿泉水中的一种，或者多种pH调节剂组成的缓冲液体系。
8.根据权利要求1所述的一种液体酶制剂，其特征在于所述的水分活度调节剂为含有山梨糖醇、麦芽糖醇、丙三醇中的一种或者多元复配；所述的pH调节剂为含磷酸、醋酸、乳酸或柠檬酸中的一种或其盐的缓冲液。
9.权利要求1-8所述的一种液体酶制剂的制备方法，其特征在于包括以下步骤：酶液纯化、混合、除菌、包装；
1)酶液纯化：将粗酶液压滤、微滤、二次超滤，得到纯化的浓缩酶液；
2)混合：定量量取称取纯化浓缩酶液，水分活度调节剂、氧化还原电位调节剂，添加食品防腐剂或不添加，混合，用pH调节剂补齐到100％体积，混合均匀，检测液体酶制剂相关参数使其满足pH5.0-9.0、水分活度Aw≤0.89、氧化还原电位为-400mv-50mv；
3)除菌：采用0.1-0.22μm膜过滤除菌无菌灌装；
4)包装：采用无菌灌装或其他相关的液体包装工艺。
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