ES2829259T3

ES2829259T3 - Preparación enzimática líquida y procedimiento de preparación de la misma

Info

Publication number: ES2829259T3
Application number: ES16890284T
Authority: ES
Inventors: Fangming Wang; Yongqiang Xie; Baodi Xu
Original assignee: Kinry Biotech Jinan Co Ltd; Kinry Food Ingredients Co Ltd
Current assignee: Kinry Biotech Jinan Co Ltd; Kinry Food Ingredients Co Ltd
Priority date: 2016-02-16
Filing date: 2016-05-16
Publication date: 2021-05-31
Anticipated expiration: 2036-05-16
Also published as: CN105462950A; CN107326019A; EP3447137A1; NZ743779A; AU2016392823B2; CN105462950B; US20200270598A1; LT3447137T; PH12018501382A1; JP6894907B2; AU2016392823A1; CN107245481B; EP3447137B1; MX2018005385A; RU2712517C1; CN107245481A; EP3447137A4; WO2017140051A1; CN107177582B; JP2020146049A

Abstract

Una preparación enzimática líquida, caracterizada porque la preparación enzimática líquida es una preparación enzimática líquida de transglutaminasa EC2.3.2.13 que tiene una actividad enzimática de 10 - 1000 u/ml caracterizada porque la preparación enzimática líquida tiene las siguientes propiedades fisicoquímicas: 1) tener un pH de 5,0 - 9,0; 2) tener una actividad de agua Aw de <= 0,89; y 3) tener un potencial redox de - 400 mv a +50 mv.

Description

DESCRIPCIÓN

Preparación enzimática líquida y procedimiento de preparación de la misma

Campo técnico

La invención divulga una preparación enzimática líquida y un procedimiento para preparar la misma, en particular, se refiere a una preparación líquida de transglutaminasa (EC2.3.2.13) y un procedimiento de preparación de la misma, en el que la preparación líquida se puede almacenar a temperatura ambiente, es estable en propiedad, con la actividad enzimática mantenida a un nivel por encima del 80 %. La invención pertenece al campo de las preparaciones enzimáticas y al campo de los aditivos alimenticios.

Antecedentes

La transglutaminasa (EC.2.3.2.13, nombre completo: amina Y-glutamil-transferasa, abreviada comoTG) es una enzima de proteína de entrecruzamiento que puede catalizar la formación de un enlace de isopéptido £-(Y-glutamil) lisina en una molécula o moléculas de proteína entre proteínas al utilizar un grupo £-amino de lisina en la cadena de péptidos de una proteína como aceptor de Acilo, mejorar las propiedades de la proteína tales como emulsibilidad, característica reológica, solubilidad y espumabilidad, conferir características de textura específica de proteína y adhesividad, y mejorar el color, sabor y aroma de los productos, por lo que tienen un gran valor comercial.

La transglutaminasa se aisló por primera vez del hígado de conejillo de indias por Clarke et al. En 1989, Ando et al. de Amano Pharmaceutical Co., Ltd. (Japón) inventaron un proceso de fermentación microbiana para la producción de transglutaminasa. En 1997, Ajinomoto Co., Inc. (Japón) logró la producción a escala comercial de transglutaminasa. En 2001, la transglutaminasa fue aprobada oficialmente como aditivo alimenticio en China. Actualmente, el principal fabricante de fermentación en el mundo es Ajinomoto Co., Inc. (Japón), cuyo producto transglutaminasa tiene la marca Acvita. Los principales fabricantes en China son Shanghai Kinry Food Ingredients Co., Ltd., Kinry Biotech (Jinan) Co., Ltd., Taixing Dongsheng Bio-Tech Co., Ltd., Taixing Yiming Biological Product Co. Ltd., Henan Yangshao Bio-products Co., Ltd., etc. Sus productos son preparaciones enzimáticas en forma de polvo sólido, siendo Shanghai Kinry Food Ingredients Co., Ltd. la primera en utilizar el envasado al vacío. Ajinomoto Co., Inc. (Japón) actualmente emplea envases llenos de nitrógeno para productos en polvo.

Aunque se han producido a gran escala preparaciones en polvo de transglutaminasa y ahora se aplican ampliamente en la industria de procesamiento de alimentos, todavía existen muchos problemas en su producción, transporte, almacenamiento y aplicación.

1) Coste de producción: durante la producción de transglutaminasa, primero se obtiene un líquido de fermentación, que requiere varias etapas de procesamiento durante su refinamiento, tal como precipitación, secado y molido; debido a los procesos complicados, aumenta el coste de producción.

2) Protección de seguridad: dado que las preparaciones en polvo de transglutaminasa son fáciles de dispersar durante la producción y el uso, en el entorno del lugar de trabajo empeora y los equipos son difíciles de limpiar. El lugar de trabajo está lleno de polvo, que es difícil de controlar y proteger. Una vez que el polvo de enzima se inhala en el cuerpo humano, provoca una fuerte respuesta anafiláctica y daña gravemente los órganos del tubo respiratorio de los operarios, quienes pueden tener síntomas tales como fiebre alta, neumonía y choque, y por lo tanto es bastante dañino para la salud de los operarios. Hasta ahora, los eventos de síntomas de alergia provocados por la transglutaminasa, tales como tos y fiebre, han ocurrido en las fábricas muchas veces.

3) Problemas de envasado: el envasadp al vacío se utiliza para preparaciones enzimáticas en polvo de transglutaminasa. Sin embargo, el polvo entra fácilmente en el equipo al aspirar, lo que resulta en una pérdida considerable. Si el envasado de preparación enzimática no se cierra herméticamente y se produce una fuga de aire, se humidificará, aglomerará y reducirá la actividad enzimática. Si se utiliza el envasado lleno de nitrógeno, la operación de llenado de nitrógeno es tediosa y conduce a la formación de polvo, y el coste de producción aumenta considerablemente.

4) Con respecto a la aplicación: es bien sabido que la transglutaminasa solo puede actuar cuando se disuelve en agua. Debido a la disolución secundaria de una preparación en polvo durante su producción y aplicación, la duración de la acción de la enzima se reduce considerablemente. Más aún, a menudo aparece una disolución incompleta después de la adición de agua, mientras que la adición directa de polvo conduce fácilmente a una distribución desigual. Adicionalmente, cuando se utiliza un dispositivo para llevar a cabo la operación de laminado y frotamiento, el polvo se adhiere fácilmente al dispositivo, lo que reduce la tasa de utilización de las preparaciones en polvo y afecta negativamente la aplicación. Por lo tanto, se debe aumentar la cantidad de preparación en polvo de transglutaminasa.

5) Tendencia de desarrollo de las preparaciones enzimáticas: en el campo de las preparaciones enzimáticas biológicas y en diversos campos industriales, ya se encuentran disponibles varios tipos de preparaciones enzimáticas en formas de dosificación líquidas, resolviéndose los problemas de almacenamiento, transporte y aplicación, y se han logrado la producción y la aplicación de los mismos económica y ambientalmente, por ejemplo, celulasa líquida (Publicación de Patente No: CN103981168A, CN10138l716), fitasa líquida (Publicación de Patente No: CN101617740), pectinasa líquida (Publicación de Patente No: CN104531653A), lipasa líquida (Publicación de Patente No: CN103525797A). Sin embargo, en todo el mundo, las preparaciones líquidas de transglutaminasa, que se pueden almacenar de manera estable a temperatura ambiente durante mucho tiempo, aún no están disponibles comercialmente.

La Solicitud de Patente Europea EP2251421 divulga el uso de soluciones de transglutaminasa estabilizadas que pueden contener varios grupos de estabilizantes tales como trehalosa, sacarosa, soja o extractos de trigo o leche, y antioxidantes en general, y que además pueden contener sales específicas, tales como citrato, carbonato o ascorbato.

La Publicación de Patente No.: CN104024406A proporciona un procedimiento de preparación para una preparación enzimática líquida de transglutaminasa. Sin embargo, dado que el procedimiento solo logra el almacenamiento a baja temperatura hasta por 180 días, y el almacenamiento y transporte del producto se debe realizar bajo condiciones de congelación, se ha limitado el uso comercializado del procedimiento, y todavía no existen productos finales del procedimiento. Cómo desarrollar una preparación enzimática líquida de transglutaminasa, que sea estable a temperatura ambiente (25 °C, lo mismo a continuación), se ha convertido en un problema que se debe resolver con urgencia en la industria alimenticia.

Descripción de la invención

Un objeto de la invención es proporcionar una preparación líquida de transglutaminasa (EC2.3.2.13), que se puede almacenar a temperatura ambiente durante 6 meses y mantiene la actividad enzimática por encima del 80 %.

Otro objeto de la invención es proporcionar un procedimiento para preparar una preparación líquida de transglutaminasa (EC2.3.2.13), en la que la preparación líquida de transglutaminasa preparada por el procedimiento tiene buena estabilidad, se puede almacenar a temperatura ambiente durante 6 meses y mantiene la actividad enzimática por encima del 80 %.

La invención resuelve principalmente el problema técnico relativo a la dificultad de almacenamiento de preparaciones líquidas de transglutaminasa a temperatura ambiente, y las preparaciones líquidas de transglutaminasa pueden cumplir los requisitos de producción y aplicación comerciales.

Para lograr los objetivos anteriores, las soluciones técnicas de la invención se deben primero ilustrar experimental y teóricamente y luego resumir. Los detalles son los siguientes.

En primer lugar, al investigar los efectos de factores fisicoquímicos tales como el pH, la actividad del agua y el potencial redox sobre la tasa de conservación de la actividad enzimática (estabilidad) de una solución de transglutaminasa a temperatura ambiente, el intervalo óptimo de pH, la actividad del agua y el redox. Se determinó el intervalo potencial para el almacenamiento estable de transglutaminasa a temperatura ambiente.

1. Estabilidad de las soluciones de transglutaminasa a diferentes valores de pH

A las soluciones enzimáticas concentradas se les agregó ácido clorhídrico e hidróxido de sodio para preparar soluciones de transglutaminasa a diferentes valores de pH. Después de la filtración estéril, las soluciones de transglutaminasa se mantuvieron a temperatura ambiente durante 2 días para evaluar su actividad enzimática (estabilidad). Los resultados se muestran en la Tabla 1.

Tabla 1. Cambios en las actividades enzimáticas de soluciones enzimáticas concentradas purificadas a diferentes pH

Los datos en la Tabla 1 muestran que, cuando se mantiene la transglutaminasa a un pH de 5,0 - 9,0, las soluciones enzimáticas purificadas tenía una tasa de conservación de actividad enzimática por encima de 80 %, mientras que cuando se mantiene la transglutaminasa a un pH por encima de 9,0 o por debajo de 4,0, se reduce rápidamente la actividad enzimática. Por lo tanto, se puede almacenar la solución enzimática a un pH de 5,0 - 9,0, y el pH preferido es 5,0 - 7,5.

2. Estabilidad de soluciones de transglutaminasa en diferentes actividades de agua

Primero se utilizó un regulador de pH para ajustar el pH de una solución enzimática purificada a 6,0, y la solución enzimática se diluyó con un tampón de regulación a 1000 u/ml. A 10 ml de solución enzimática diluida, se agregó glicerol en diferentes cantidades (Tabla 2), y las soluciones resultantes se diluyeron con tampón a un volumen de 100 ml. Después de filtración estéril, se obtuvieron preparaciones enzimáticas líquidas con diferentes actividades de agua. Después de que se mantiene a temperatura ambiente durante 10 días, se evaluó la estabilidad de las preparaciones enzimáticas líquidas, y se mostraron los resultados en la Tabla 2.

Tabla 2. Las actividades enzimáticas (estabilidad) de soluciones enzimáticas concentradas purificadas en diferentes actividades de agua

Los datos en la Tabla 2 muestran que la adición de un regulador de actividad de agua podría mejorar la estabilidad de la preparación líquida de transglutaminasa a temperatura ambiente. Cuando la actividad de agua fue menor que 0,89, la tasa de conservación de actividad enzimática alcanzó más del 85 % en el Día 10, y cuando la actividad de agua fue menor que 0,85, la tasa de conservación de actividad enzimática alcanzó 92 %. Sin embargo, una reducción adicional en la actividad de agua tuvo poco efecto sobre la tasa de conservación de actividad enzimática. Por lo tanto, se podría obtener una buena tasa de conservación cuando la actividad de agua fuera menor que 0,89. Sin embargo, en vista del coste de la materia prima, la actividad de agua preferida estuvo en el intervalo de 0,60 - 0,85.

3. Estabilidad de soluciones de transglutaminasa a temperatura ambiente bajo diferentes condiciones potenciales de redox

Se agregó un regulador de pH para ajustar el pH de una solución enzimática concentrada purificada a 6,0. Y luego, los potenciales de redox de la solución enzimática se ajustaron a diferentes valores con los reguladores de potencial redox de borohidruro de sodio y peróxido de hidrógeno. Después de filtración estéril, la solución enzimática se mantuvo a temperatura ambiente durante 30, 60, y 90 días, y se determinaron las actividades enzimáticas y las tasas de conservación de las soluciones enzimáticas de muestra. Los resultados se mostraron en la Tabla 3.

Tabla 3. Las actividades enzimáticas y tasas de conservación de preparaciones líquidas de transglutaminasa a diferentes potenciales de redox

Los datos en la Tabla 3 muestran que el potencial redox tuvo un gran efecto sobre la estabilidad de una preparación líquida de transglutaminasa. Cuando el potencial redox estaba en el intervalo de - 400 mv a 50 mv, la tasa de conservación fue más del 80 % a temperatura ambiente después de 30 días. Cuando el potencial redox de una preparación enzimática líquida fue menor que 50 mv, se incrementó considerablemente la tasa de conservación de actividad enzimática. Cuando el potencial estuvo entre - 400 mv y 0 mv, la tasa de conservación llegaría por encima de 80 % después de 90 días. El potencial preferido para la preparación enzimática líquida estuvo entre - 400 mv y 0 mv.

En segundo lugar, se evaluaron los reguladores de pH, reguladores de actividad de agua, y reguladores de potencial redox en términos de sus efectos sobre la estabilidad de una transglutaminasa líquida, seleccionando de esta manera reguladores de pH adecuados, reguladores de actividad de agua, y reguladores de potencial redox.

4. Efecto de diferentes reguladores de pH sobre la estabilidad de soluciones de transglutaminasa

Se seleccionó uno de ácido clorhídrico, ácido sulfúrico, ácido acético, ácido láctico, ácido cítrico, ácido málico, ácido fítico, ácido fosfórico, ácido nítrico, ácido oxálico, hidróxido de sodio, hidróxido de potasio, carbonato de sodio, bicarbonato de sodio, carbonato de potasio, bicarbonato de potasio, citrato de trisodio, citrato de trispotasio, acetato de sodio, acetato de potasio, lactato de sodio, lactato de potasio, hidrógeno fosfato de disodio, hidrógeno fosfato de dipotasio, fosfato de sodio, fosfato de potasio, agua potable, agua purificada, y agua mineral, o un sistema tampón que consiste en varios reguladores de pH para ajustar el pH de una solución purificada de transglutaminasa al intervalo que se enumera en la Tabla 1. Se investigaron diferentes reguladores de pH y combinaciones aleatorias de diferentes reguladores de pH por su efecto sobre la estabilidad de una transglutaminasa líquida a temperatura ambiente. Los resultados se mostraron en las Tablas 4 -1, 4 -2 , y 4 - 3.

Tabla 4 - 1. Efectos de diferentes reguladores de pH alcalinos sobre la estabilidad de una transglutaminasa líquida

T - a

continuación

Tabla 4 - 3. Efectos de diferentes combinaciones de reguladores de pH sobre la estabilidad de una transglutaminasa líquida

Los datos en las Tablas 4 - 1 , 4 -2, y 4 - 3 muestran que no se presentaron diferencias significativas ni cambios con respecto a los efectos de los reguladores de pH ácidos seleccionados, reguladores de pH alcalinos, y similares sobre el almacenamiento de la solución enzimática a temperatura ambiente. Por lo tanto, cualquiera del ácido clorhídrico, ácido sulfúrico, ácido acético, ácido láctico, ácido cítrico, ácido málico, ácido fítico, ácido fosfórico, ácido nítrico, ácido oxálico, hidróxido de sodio, hidróxido de potasio, carbonato de sodio, bicarbonato de sodio, carbonato de potasio, bicarbonato de potasio, citrato de trisodio, citrato de trispotasio, acetato de sodio, acetato de potasio, lactato de sodio, lactato de potasio, hidrógeno fosfato de disodio, hidrógeno fosfato de dipotasio, fosfato de sodio, fosfato de potasio, agua potable, agua purificada, y agua mineral, o un sistema tampón que consiste en varios reguladores de pH de lo anterior se podría seleccionar como el regulador de pH para ajustar el pH de un líquido de transglutaminasa. En vista de la seguridad en las operaciones de producción y los efectos del pH extremo transitorio de un ácido fuerte o una base fuerte sobre la actividad de la transglutaminasa durante la operación de ajuste, un tampón que comprenda ácido fosfórico, ácido acético, ácido láctico o ácido cítrico o un se prefiere una sal del mismo.

5. Efectos de diferentes reguladores de actividad de agua y cantidades de los mismos sobre la estabilidad de transglutaminasa líquida a temperatura ambiente

Se prueban los efectos de diferentes reguladores de actividad de agua sobre la estabilidad de soluciones de transglutaminasa como sigue: bajo temperatura ambiente y condiciones estériles, a una solución de transglutaminasa, se agregaron uno o más de sorbitol, maltitol, propilenglicol, glicerol, xilitol, polietilenglicol (PEG) 400, PEG 600, PEG 800, PEG 20000, glucosa, trehalosa, sacarosa, maltosa, isomaltosa, maltodextrina, y xilitol, para ajustar la actividad de agua de la preparación enzimática líquida a 0,75, y la preparación enzimática líquida se mantuvo bajo condiciones estériles para 10 días. Los resultados se mostraron en la Tabla 5-1.

Tabla 5 - 1. Efectos de diferentes reguladores de actividad de agua sobre la actividad enzimática de transglutaminasa

continuación

Los datos en la Tabla 5 -1 muestran que, cuando se utilizaron uno o más de sorbitol, maltitol, propilenglicol, glicerol, xilitol, PEG 400, PEG 600, PEG 800, PEG 20000, trehalosa, sacarosa, maltosa, isomaltosa, maltodextrina, y xilitol como un regulador de actividad de agua para ajustar la actividad de agua de la transglutaminasa líquida a 0,75, tuvieron un efecto protector sobre la estabilidad de la preparación enzimática líquida a temperatura ambiente. Como se muestra en los resultados, se prefirió sorbitol, maltitol, glicerol o cualquier combinación de los mismos. Se pueden utilizar en una cantidad de 30 - 80 % (p/v), preferentemente 30 - 70 % (p/v).

Se probaron varios reguladores de actividad de agua en la Tabla 5 -1 para la relación entre la cantidad utilizada y la tasa de conservación de actividad enzimática a temperatura ambiente. La preparación enzimática líquida se mantuvo bajo una condición estéril en pH 6,0, luego se determinaron las tasas de conservación de actividad enzimática (%) a temperatura ambiente 10 días después. Los resultados se mostraron en la Tabla 5-2.

Tabla 5 - 2. Efectos de diferentes reguladores de actividad de agua sobre la actividad enzimática de transglutaminasa

Los datos en la Tabla 5 -2 muestran que a un pH óptimo, cuando el regulador de actividad de agua se utilizó en una cantidad por encima de 30 %, los reguladores de actividad de agua anteriores solos o en combinación resultaron en una tasa de conservación de actividad enzimática por encima de 80 % a temperatura ambiente 10 días después para la preparación enzimática líquida. Cuando el regulador de actividad de agua se utilizó en una cantidad por encima de 40 %, la tasa de conservación de actividad enzimática estuvo por encima 86 %. Con el aumento en la cantidad de reguladores de actividad de agua, aumenta la tasa de conservación de actividad enzimática, pero no en gran medida. En vista del coste producción, la cantidad de reguladores de actividad de agua es preferentemente entre 30 y 70 % (p/v).

6. Efectos de diferentes reguladores de potencial redox sobre la estabilidad de una transglutaminasa líquida a temperatura ambiente

Dentro del intervalo de potencial redox preferido, los inventores investigaron los efectos de diferentes reguladores de potencial redox sobre la estabilidad de una transglutaminasa líquida, con el regulador de potencial redox utilizado en una cantidad máxima como se especifica en el Estándar GB2760-2014. En el experimento, un tampón de citrato (pH 6,0) se utilizó para ajustar el pH de una solución detransglutaminasa a 6,0, y se agregó glicerol para ajustar la actividad de agua a 0,73 - 0,75.

Los datos en la Tabla 6 y Tabla 7 muestran que, cuando se utilizaron los diferentes reguladores de potencial redox para ajustar los potenciales de redox de transglutaminasa líquida entre 50 mv y -150 mv; la tasa de conservación de actividad enzimática la preparación con la adición de reguladores de potencial redox alcanzó más del 80 % después de almacenamiento durante 90 días a temperatura ambiente, que indica que la preparación fue de valor comercial. Excepto para algunos reguladores de potencial redox tal como lactato de sodio y lactado de calcio, todas las otras fórmulas que comprendían los reguladores de potencial redoxtenían una tasa de conservación de actividad enzimática por encima de 80 % después de almacenamiento durante 180 días a temperatura ambiente.

Como se muestra en la Tabla 7, cuando se utilizaron uno o más reguladores de potencial redox, la transglutaminasa líquida tenía una tasa de conservación de actividad enzimática por encima de 80 % después de almacenamiento a temperatura ambiente durante 180 días, que había cumplido completamente los requisitos para la producción industrial y la aplicación. En vista del coste producción y el deseo de la gente por alimentos naturales verdes, se prefirieron reguladores potenciales de fuentes naturales, tal como ácido L-ascórbico y una sal del mismo, L-serina y una sal de la misma, L-cisteína y una sal de la misma, glutatión reducido, polifenol del té, hidrolizado de proteína de soja, hidrolizado de proteína de trigo, hidrolizado de caseína, hidrolizado de quitosano, antioxidante de hoja de bambú, extracto de romero, y extracto antioxidante de regaliz; o se prefirieron superóxido dismutasa de bajo coste, glucosa oxidasa, bisulfito de sodio, metabisulfito de sodio, metabisulfito de potasio, sulfito de sodio, hiposulfito de sodio, ácido fítico, etc. A partir de los resultados como se muestra en la Tabla 6 y Tabla 7, se determinó el regulador de potencial redox a ser agregado en un intervalo de 0,0075 - 1 %.

Tabla 7. Efectos de reguladores de potencial redox sobre la estabilidad de preparaciones líquidas de transglutaminasa

Al agregar un regulador de pH, un regulador de actividad de agua, y un regulador de potencial redox, la transglutaminasa líquida se ajustó dentro de un intervalo de un pH de 5,0 - 9,0, una actividad de agua de < 0,89, y un potencial redox de - 400 mv a 50 mv. La preparación enzimática líquida alcanzó una tasa de conservación por encima de 80 % después de almacenamiento a temperatura ambiente bajo condiciones estériles para 180 días, que cumple sustancialmente los requisitos de una preparación líquida de transglutaminasa estable que es comercialmente aplicable.

A continuación, como se requiere en GB25594-2010, una preparación en enzimas para uso en la industria alimenticia tiene que cumplir con los estándares de higiene correspondientes tales como índices de microorganismos.

Por lo tanto, la actividad de agua, el conservante de alimentos, y los procedimientos de preparación tales como la filtración estéril y el llenado se investigaron adicionalmente por sus efectos sobre el número total de colonias e índices de microorganismos perjudiciales en una preparación líquida de transglutaminasa.

7. Efecto de concentraciones diferentes de los reguladores de actividad de agua sobre el número total de colonias de una transglutaminasa líquida almacenada a temperatura ambiente

El pH de la solución de transglutaminasa concentrada se ajustó a 6,0, y se agregó hidrolizado de proteína de trigo al 1 % (p/v) para ajustar el potencial redox, se agregó glicerol en diferentes cantidades % (p/v), y se agregó un regulador de pH para alcanzar un volumen de 100 %, obtener una preparación enzimática líquida con diferentes actividades de agua. La preparación enzimática líquida se suministró y envasó bajo condiciones abiertas, y se investigaron los cambios en el número total de colonias en la preparación enzimática durante almacenamiento a temperatura ambiente. Los resultados se mostraron en la Tabla 8.

Tabla 8. Efectos de concentraciones diferentes de reguladores de actividad de agua sobre los números totales de colonias en una preparación enzimática líquida

Los datos de la Tabla 8 mostraron que, cuando la actividad del agua fue mayor que 0,85, el glicerol estaba presente en una cantidad mayor que 40 % y no estaban presentes conservantes en la preparación enzimática líquida de transglutaminasa, los microorganismos proliferaron rápidamente y el número total de colonias superó el número máximo especificado en las leyes y reglamentos pertinentes durante el almacenamiento durante 180 días a temperatura ambiente. Cuando el regulador de la actividad del agua estaba presente en una cantidad mayor que el 40 %, el crecimiento y la proliferación de microorganismos se inhibieron sustancialmente debido a la baja actividad del agua en sí misma. En vista de los requisitos sobre los índices higiénicos de las preparaciones enzimáticas para su uso en la industria alimenticia, se prefirieron las fórmulas con un regulador de la actividad del agua superior al 40 % -80 %.

8. Efectos de diferentes conservantes de alimentos sobre microorganismos en una solución enzimática

Una solución de transglutaminasa se diluyó con tampón de citrato de sodio 0,02 M (pH 6,0) a 1000 u/ml. A 100 ml de solución enzimática diluida, se agregó 300 g glicerol y 10 g de un regulador potencial de hidrolizado de proteína de trigo y luego tampón de citrato de sodio 0,02 M, pH 6,0 a un volumen final de 1000 ml. Se agregaron los conservantes de alimentos que se enumeran en GB2760-2014 como se muestra en la Tabla 9, los controles fueron A: no conservante, y B: no conservante, pero la solución se filtró a través de una membrana de 0,1 - 0,22 pm y se llenó bajo condiciones estériles. Bajo condiciones abiertas, las botellas opacas de PET se llenaron con la solución enzimática como muestra experimental y se colocaron a temperatura ambiente durante 180 días. De acuerdo con el Estándar Nacional de Seguridad Alimenticia GB4789.2-2010 “Examen microbiológico de alimentos: recuento de aerobios en placa”, Estándar de Seguridad Alimenticia Nacional GB 4789.3 “Examen microbiológico de alimentos: Recuento de coliformes”, Estándar de Seguridad Alimenticia Nacional GB/T 4789.38 “Examen microbiológico de alimentos : Recuento de Escherichia coli’ y Estándar de Seguridad Alimenticia Nacional GB 4789.4-2010 “Examen microbiológico de alimentos: Salmonella", se llevó a cabo un examen microbiológico. Los resultados se muestran en la Tabla 9.

Tabla 9. Efectos de diferentes conservantes de alimentos sobre microorganismos en las preparaciones enzimáticas líquidas

Los datos en la Tabla 9 muestran que, cuando el regulador de actividad de agua estuvo a una concentración tan baja como 30 % (p/v), los varios conservantes de alimentos agregados en las cantidades permisivas bajo las leyes y reglamentos pueden inhibir eficazmente la proliferación de microorganismos, garantizando de esta manera la higiene y seguridad de una solución de transglutaminasa. En vista de la preferencia del cliente y el intervalo aplicado de varios conservantes de alimentos, se podría utilizar un conservante de alimentos o una combinación de varios conservantes de alimentos en la producción de una transglutaminasa líquida; preferentemente conservantes de alimentos naturales, tales como e-polilisina, natamicina, lisozima y Nisina. O el líquido se puede filtrar a través de una membrana de 0,1 |jm seguido de un llenado estéril. O alternativamente, en vista del coste de la aplicación, se pueden utilizar uno o más de ácido sórbico y sorbato de potasio, diacetato de sodio, deshidroacetato de sodio, p-hidroxibenzoato de metilo, metabisulfito de potasio y metabisulfito de sodio; o se puede emplear en el proceso la filtración a través de una membrana de 0,1 jm seguida de un llenado estéril.

9. Efectos de diferentes actividades enzimáticas sobre la estabilidad de preparaciones líquidas a temperatura ambiente

A diferentes cantidades de soluciones enzimáticas concentradas purificadas, se agregaron glicerol al 50 % (p/v), y bisulfito de sodio al 0,1 % (p/v), y se agregó un regulador de pH a un volumen final de 1000 ml. Después de filtración estéril, la solución resultante se colocó a temperatura ambiente durante 180 días, y luego se determinó la actividad enzimática y se comparó la tasa de conservación de actividad enzimática (%).

Tabla 10. Efectos de diferentes actividades enzimáticas de solución enzimática sobre la estabilidad de una transglutaminasa líquida

Como se muestra en la Tabla 10, los efectos de diferentes actividades enzimáticas de solución enzimática sobre la estabilidad de una transglutaminasa líquida no fueron significativos. Sin embargo, en las aplicaciones prácticas, es preferible controlar la actividad enzimática de una preparación líquida dentro del intervalo de 10 - 1000 u/ml.

Al investigar los efectos de los factores fisicoquímicos mencionados anteriormente sobre la tasa de conservación de la actividad enzimática (estabilidad) de una solución de transglutaminasa a temperatura ambiente, los inventores determinaron el intervalo de pH óptimo, los tipos de reguladores de pH, el intervalo de actividad de agua y la cantidad de un regulador de la actividad del agua, el intervalo de potencial redox y los tipos de reguladores de potencial redox, que se pueden utilizar/aplicar para mantener estable la preparación líquida de transglutaminasa a temperatura ambiente.

Adicionalmente, se verificó que, mediante filtración estéril y llenado o adición de un conservante en la producción, se puede almacenar de manera estable una preparación enzimática líquida a temperatura ambiente.

En base al principio de que se utilizan varios procedimientos en combinación para mejorar la estabilidad de la enzima con el fin de lograr el propósito de mejorar sinérgicamente la estabilidad de la enzima, la invención resuelve con éxito el problema relativo al almacenamiento de una preparación líquida de transglutaminasa a temperatura ambiente al controlar los índices y parámetros intermedios durante la producción, y desarrollar una preparación líquida de transglutaminasa que tiene buena estabilidad a temperatura ambiente, se puede almacenar durante un tiempo prolongado y se puede producir a escala comercial. Es de gran importancia para reducir los costes de producción de transglutaminasa, conservación de energía, protección del medio ambiente, uso saludable y promoción del mercado.

Para resumir, las soluciones técnicas de la invención son como sigue:

una preparación enzimática líquida, caracterizada porque la preparación enzimática líquida es una preparación enzimática líquida de transglutaminasa EC2.3.2.13 que tiene una actividad enzimática de 10 -1000 u/ml;

una preparación enzimática líquida, caracterizada porque sus componentes y cantidades de los mismos son como sigue: la preparación líquida de transglutaminasa tiene una actividad enzimática de 10 - 1000 u/ml, un regulador de actividad de agua está presente en una cantidad de 30 - 80 % p/v, un regulador de potencial redox está presente en una cantidad de 0,0075 - 1 % p/v, un conservante de alimentos está presente en una cantidad de 0 - 0,1 % p/v, y se agrega un regulador de pH a un volumen final de 100 %.

La preparación enzimática líquida tiene las siguientes propiedades fisicoquímicas:

1) tener un pH de 5,0 - 9,0; preferentemente un pH de 5,0 - 7,5

2) tener una actividad de agua Aw de < 0,89; preferentemente una actividad de agua Aw de 0,60 - 0,85; y

3) tener un potencial redox de - 400 mv a 50 mv; preferentemente, un potencial redox de - 400 mv a 0 mv. el regulador de pH es uno de ácido clorhídrico, ácido sulfúrico, ácido acético, ácido láctico, ácido cítrico, ácido málico, ácido fítico, ácido fosfórico, ácido nítrico, ácido oxálico, hidróxido de sodio, hidróxido de potasio, carbonato de sodio, bicarbonato de sodio, carbonato de potasio, bicarbonato de potasio, citrato de trisodio, citrato de trispotasio, acetato de sodio, acetato de potasio, lactato de sodio, lactato de potasio, hidrógeno fosfato de disodio, hidrógeno fosfato de dipotasio, fosfato de sodio, fosfato de potasio, agua potable, agua purificada, y agua mineral, o un sistema tampón que consiste en varios reguladores de pH; preferentemente un regulador que tiene una capacidad de tampón de pH, tal como un tampón que comprende uno de ácido fosfórico, ácido acético, ácido láctico o ácido cítrico, o una sal del mismo,

el regulador de actividad de agua se selecciona del grupo que comprende sorbitol, maltitol, propilenglicol, glicerol, xilitol, PEG, trehalosa, sacarosa, maltosa, isomaltosa, maltodextrina, xilitol, y manitol, preferentemente que comprende sorbitol, maltitol, o glicerol, o una combinación de los mismos. La cantidad es 30 - 80 % (p/v), preferentemente 30 - 70 % (p/v).

El regulador de potencial redox comprende uno o más de ácido L-ascórbico y una sal del mismo, L-serina y una sal de la misma, L-cisteína y una sal de la misma, glutatión reducido, polifenol del té, hidrolizado de proteína de soja, hidrolizado de proteína de trigo, hidrolizado de caseína, hidrolizado de quitosano, antioxidante de hoja de bambú, extracto de romero, extracto antioxidante de regaliz, superóxido dismutasa, glucosa oxidasa, bisulfito de sodio, metabisulfito de sodio, metabisulfito de potasio, sulfito de sodio, hiposulfito de sodio, ácido fítico, etc., y se utiliza en una cantidad de 0,0075 % -1 %.

El conservante de alimentos se selecciona del grupo que comprende e-polilisina, natamicina, lisozima, Nisina, sorbato de potasio, deshidroacetato de sodio, diacetato de sodio, p-hidroxibenzoato de metilo, arginato de etil lauroi1HCl, metabisulfito de potasio, y metabisulfito de sodio, y se agrega generalmente en una cantidad de 0 % - 0,1 %.

Un procedimiento para preparación de una preparación enzimática líquida, caracterizado por las siguientes etapas:

1) purificación de una solución enzimática: someter una solución enzimática cruda a filtración a presión, microfiltración, y ultrafiltración secundaria, para obtener una solución enzimática concentrada purificada;

2) mezcla: pesar la solución enzimática concentrada purificada, un regulador de actividad de agua, y un regulador de potencial redox cuantitativamente, agregar un conservante de alimentos si está presente, y mezclar; agregar un regulador de pH a un volumen final de 100 %; después de mezclar de forma homogénea, probar y ajustar la preparación enzimática líquida para los siguientes parámetros: un pH de 5,0 - 9,0, una actividad de agua Aw de < 0,89, y un potencial redox de - 400 mv a 50 mv;

3) eliminación de bacterias: filtrar la mezcla resultante a través de una membrana de 0,1 - 0,22 pm para esterilización, seguido de llenado estéril;

4) empaque: envasar la preparación enzimática líquida mediante llenado estéril u otro proceso de empaque de líquidos relevante.

La invención logró por primera vez una preparación líquida de transglutaminasa que tiene una actividad enzimática no menor que 80 % y es estable en la forma de solución después de almacenamiento a temperatura ambiente durante 6 meses, cumple con los requisitos en comercialización de mercado, es conveniente para producción, tiene un buen efecto de aplicación, y no necesita refrigeración o transporte de cadena de frío.

Nivel inventivo de la invención:

La invención logró por primera vez una preparación líquida de transglutaminasa que tiene una tasa de conservación de actividad enzimática por encima de 80 % y es estable en la forma de solución después de almacenamiento a temperatura ambiente durante 6 meses, cumple con los requisitos en comercialización de mercado, es conveniente para producción, tiene un buen efecto de aplicación, y no necesita refrigeración o transporte de cadena de frío. La invención tiene un significado importante en la promoción de la aplicación y el desarrollo del mercado de transglutaminasa.

La invención por primera vez encontró que el potencial redox en un sistema es el factor más importante para mantener una transglutaminasa líquida estable a temperatura ambiente. Cuando el potencial redox de la preparación enzimática líquida está entre (- 400 mv) y 50 mv, se mejora en gran manera la estabilidad de la solución de transglutaminasa a temperatura ambiente. La transglutaminasa, como una proteína macromolecular que tiene la actividad catalítica, tiene que mantener la estabilidad de su estructura tridimensional en la mayor medida posible para mantener la estabilidad de las moléculas enzimáticas. Sin embargo, los grupos y fragmentos dentro de la macromolécula tienen diferentes características de carga debido a la diferencia en sus secuencias de aminoácidos. En un sistema líquido, exhibe un carácter electrolítico anfótero típico. Dado que una estructura tridimensional necesita ser mantenida por enlaces no covalentes tales como la fuerza de van der Waals entre grupos y fragmentos, y dicha acción de carga débil es fácilmente influenciada por el potencial redox del sistema líquido en el que están presentes las moléculas enzimáticas. Cuando el potencial redox de un sistema líquido es mayor que el potencial constante de las moléculas enzimáticas, las moléculas de transglutaminasa como reductor se oxidan en el sistema; cuando el potencial redox del sistema líquido es menor que el potencial constante de las moléculas enzimáticas, las moléculas de transglutaminasa como oxidante se reducen en el sistema, lo que resulta en la pérdida de la estructura tridimensional y la actividad de las moléculas enzimáticas. En la invención, se obtuvo una preparación líquida de transglutaminasa que es estable a temperatura ambiente, al ajustar el potencial de la preparación líquida de enzima para que esté dentro del intervalo de potencial mencionado anteriormente con un regulador de potencial redox adecuado, en el que el potencial redox del entorno fue la transglutaminasa está presente en el intervalo en el que la molécula enzimática es estable.

Por lo tanto, en la fórmula de la invención, se agregó un regulador de potencial redox durante la primera vez, tal como glutatión reducido, L-cisteína y clorhidrato del mismo, hidrolizado de proteína de trigo, hidrolizado de quitosano, antioxidante de hoja de bambú, extracto de romero, extracto antioxidante de regaliz, y sulfito, que asegura sustancialmente la estabilidad de una preparación líquida de transglutaminasa a temperatura ambiente, y es clave en la fórmula.

En la fórmula de la invención, también se utilizan un regulador de la actividad del agua y un regulador del pH, en los que un tampón puede tamponar eficazmente el cambio en el pH de una preparación enzimática líquida provocado por la adición de varios aditivos y mantener el pH de la transglutaminasa líquida en el intervalo óptimo. La adición de un regulador de la actividad del agua puede mantener la preparación líquida de la enzima en una actividad de agua más baja Aw, y también es favorable para inhibir la proliferación de microorganismos y mejorar la estabilidad estérica de las moléculas enzimáticas. Por ejemplo, en la invención se utilizan reguladores de la actividad del agua que comprenden abundantes unidades hidroxilo, tales como trehalosa, PEG y sorbitol, que pueden estabilizar en gran medida la estructura estérica de las moléculas de transglutaminasa. El uso de un regulador de la actividad del agua, un regulador de potencial redoxy un regulador de pH en combinación pueden mantener sinérgicamente la estabilidad de la enzima y lograr el mejor efecto estabilizador.

En el proceso de preparación de la invención, se prepara una preparación líquida de transglutaminasa por medio de mezcla. En primer lugar, se purifica una solución concentrada de transglutaminasa o un polvo de transglutaminasa. Dado que la propia transglutaminasa tiene un peso molecular de aproximadamente 38-45 KDa, primero se llevan a cabo la filtración a presión y la microfiltración (con un tamaño de poro de 0,1 - 1 pm). Esta etapa puede eliminar precipitados como partículas y sólidos bacterianos. Luego, la solución resultante se somete a ultrafiltración (corte de peso molecular: 100 - 200 KDa), y esta etapa puede eliminar la mayoría de los microorganismos, mitigar el deterioro microbiano y reducir el efecto de los microorganismos sobre la enzima. Finalmente, se lleva a cabo una ultrafiltración (corte de peso molecular: 10-30 KDa) para obtener una solución enzimática concentrada purificada. A continuación, se agregan un regulador de la actividad de agua, un regulador de potencial redox y un conservante de alimentos de acuerdo con la fórmula, se utiliza un regulador de pH para ajustar el pH. Después de mezclar homogéneamente, se determinan los parámetros relevantes. Se realiza un ligero ajuste al agregar los reguladores, para cumplir con las propiedades fisicoquímicas de la preparación. La solución mezclada se somete adicionalmente a filtración por membrana para eliminar las bacterias, seguido de llenado, de modo que toda la solución esté en un entorno estéril o en un entorno con pocas bacterias. Mientras tanto, se puede utilizar opcionalmente un conservante de alimentos para prevenir el crecimiento de bacterias en la preparación enzimática líquida durante el almacenamiento y transporte. La fórmula y el procedimiento de preparación de acuerdo con la invención pueden mejorar en gran medida la estabilidad térmica de la transglutaminasa y prolongar la vida útil de la preparación líquida de enzima.

Los componentes utilizados en la fórmula de la preparación líquida de transglutaminasa de acuerdo con la invención son baratos y se pueden obtener fácilmente, y sus fuentes de calidad alimenticia están disponibles. La fórmula de la preparación líquida de transglutaminasa también cumple con los estándares nacionales de seguridad alimenticia y aditivos alimenticios. El proceso para preparar una preparación enzimática líquida es científico y razonable, y tiene una alta eficiencia en producción. Está muy simplificado en términos de proceso y coste de producción en comparación con el proceso de preparación de una preparación enzimática en polvo por liofilización. Casi no hay pérdida de actividad enzimática y la eficiencia de producción se mejora enormemente. Está en consonancia con los conceptos de conservación de energía, protección del medio ambiente, uso saludable de enzimas y economía verde promovidos en China.

Descripción de los dibujos

La Figura 1 es un esquema del procedimiento de preparación de una preparación líquida de enzima.

Realizaciones detalladas de la invención

Se proporcionan los siguientes ejemplos para comprender mejor la invención, el alcance según se reivindica en la invención incluye, pero no se limita a, los contenidos descritos en los siguientes ejemplos, y cualquier modificación y mejora realizada de acuerdo con el conocimiento convencional en la técnica estará dentro del alcance según se reivindica en la invención. El esquema se muestra en la Figura 1.

Ejemplo 1

Se preparó una solución cruda de transglutaminasa por medio de fermentación microbiológica, que se pudo realizar por referencia a la Patente (Publicación de Patente No: EP0379606B1): Se utilizó Streptomyces mobaraensis como la cepa original, se recogieron algunas colonias bacterianas en buen estado de crecimiento con un asa de inoculación, se inocularon en un medio de cultivo de semillas y se cultivaron a una temperatura constante de 30 °C durante 7 días. Las cepas activadas se inocularon adicionalmente en un medio de cultivo de semillas, se cultivaron a 30 °C durante 48 h, se agregaron a un medio de fermentación en una cantidad de inoculación del 10 % y se cultivaron a 30 °C durante 48 - 72 h, obteniendo de esta manera una solución cruda de transglutaminasa. La solución enzimática cruda se purificó y concentró mediante las siguientes etapas:

1) filtración a presión: a un tamaño de poro de 1 pm, una presión de operación de 0,20 MPa y una temperatura de 20 °C, obteniendo un filtrado;

2) microfiltración: a un tamaño de poro de 0,25 |jm, una presión de operación de 0,25 MPa y una temperatura de 20 °C, obteniendo un filtrado;

3) ultrafiltración: a un corte de peso molecular de 100 KDa, una presión de operación de 0,30 MPa y una temperatura de 20 °C, obteniendo un filtrado;

4) ultrafiltración: a un corte de peso molecular de 10 KDa, una presión de operación de 0,30 MPa y una temperatura de 20 °C, manteniendo el retenato (es decir, una solución enzimática concentrada purificada).

La actividad enzimática se determinó mediante el procedimiento del ácido hidroxámico (Peng Can, Stabilization Study of Microbial Transglutaminase [D]. East China Normal University, 2007), (lo mismo a continuación), y una solución de transglutaminasa concentrada purificada que tiene una actividad enzimática de Se obtuvieron 2500 u/ml. Por medición, tenía un pH de 5,80, actividad de agua de 0,95 y un potencial redox de 60 mv. La solución se guarda para su uso posterior.

Ejemplo 2

Se preparó una solución cruda de transglutaminasa al disolver polvo de enzima. Se pesó una cierta cantidad de agua pura y se colocó en un recipiente equipado con un agitador. Se agregó lentamente con agitación un polvo de transglutaminasa con una actividad enzimática de 5000 - 8000 u/ml (un polvo de enzima producido por Shanghai Kinry Food Ingredients Co., Ltd) para obtener una solución enzimática disuelta a una cierta concentración. Las bacterias se eliminaron por microfiltración para obtener una solución de transglutaminasa transparente con una actividad enzimática de 2500 u/ml, es decir, una solución de transglutaminasa concentrada purificada con una actividad enzimática de 2500 u/ml. Por medición, tenía un pH de 6,30, actividad de agua de 0,95 y un potencial redox de 58 mv. La solución se guarda para su uso posterior.

Ejemplo 3

Un procedimiento para la preparación de una transglutaminasa líquida: se preparó la enzima líquida en un volumen total de 1000 ml como se indica a continuación, y las materias primas se pesaron de acuerdo con la Tabla 11.

Tabla 11. Preparación de una transglutaminasa líquida

Las materias primas de la fórmula se pesaron y mezclaron homogéneamente, y después de filtración a través de una membrana estéril de 0,1 jm , se obtuvo una solución de color amarillo claro. Mediante medición, tenía un potencial redox de - 100 mv, actividad de agua de 0,79, un pH de 6,0, y una actividad enzimática de 498,1 u/ml. Se llenaron diez botellas opacas de PET de 100 ml, para obtener finalmente una preparación de transglutaminasa en una forma líquida. Después de almacenamiento a temperatura ambiente durante 180 días, se observó la preparación enzimática de la fórmula, se midió la actividad enzimática, y se calculó la tasa de conservación de actividad enzimática. Mediante referencia al Estándar Nacional de Seguridad Alimenticia GB4789.2-2010 “Examen microbiológico de alimentos: Recuento de placas aeróbicas”, Estándar Nacional de Seguridad Alimenticia GB 4789.3 “Examen microbiológico de alimentos: Enumeración de coliformes”, Estándar Nacional de Seguridad Alimenticia GB/T 4789.38 “Examen microbiológico de alimentos: Recuento de Escherichia coli’, y Estándar Nacional de Seguridad Alimenticia GB 4789.4 2010 “Examen microbiológico de alimentos: Salmonella", se llevó a cabo un examen microbiológico. Los resultados muestran que la preparación enzimática líquida no tiene cambio significativo en apariencia, sabor y similares. Tenía una tasa de conservación de actividad enzimática de 86 %, y sus índices de microorganismos cumplen los requisitos en el Estándar GB25594-2010. Por lo tanto, se podría utilizar para comercialización.

Ejemplo 4

La solución de transglutaminasa concentrada purificada preparada en el Ejemplo 2 se utilizó para preparar una preparación líquida de transglutaminasa de acuerdo con la fórmula en la Tabla 12. Después de mezclar homogéneamente, se midieron el pH, actividad de agua, potencial redox, y actividad enzimática inicial de acuerdo con los procedimientos relevantes como se describe en el Ejemplo 3. La preparación líquida de transglutaminasa luego se filtró a través de una membrana estéril de 0,1 jm , y se suministró y envasó en botellas de PET bajo condiciones estériles. Después de almacenamiento a temperatura ambiente durante 180 días, se observó la apariencia de la preparación líquida de transglutaminasa, y se midieron la actividad enzimática de criterios de valoración, índices de microorganismos y similares de acuerdo con los procedimientos relevantes como se describe en el Ejemplo 3, y se calculó la tasa de conservación de actividad enzimática.

Tabla 12. Preparación de una transglutaminasa líquida

Los resultados muestran que la preparación de transglutaminasa preparada por el procedimiento tenía buena estabilidad, no tuvo ningún cambio significativo y visible en la apariencia, y tenía una tasa de conservación de actividad enzimática de 82 %. Los índices de microorganismos cumplieron los requisitos en el Estándar GB25594-2010. Se podría utilizar para comercialización. El uso de filtración a través de una membrana estéril de 0,1 pm y llenado estéril podría asegurar que la preparación enzimática líquida tenga una tasa de conservación de actividad enzimática de hasta 80 %, y podría controlar los índices de microorganismos en la preparación enzimática líquida de una fórmula con 30 % de regulador de actividad de agua durante el periodo de almacenamiento.

Ejemplo 5

Tabla 13. Preparación de una transglutaminasa líquida

Después de mezclar dichas materias primas homogéneamente, con la mezcla se llenaron directamente las botellas de PET bajo ambientes abiertos. Después de almacenamiento a temperatura ambiente durante 180 días, la preparación de transglutaminasa preparada por el procedimiento tenía buena estabilidad, no tuvo ningún cambio significativo y visible en la apariencia, y tenía una tasa de conservación de actividad enzimática de 84 %. Los índices de microorganismos cumplieron los requisitos en el Estándar GB25594-2010, y se podría utilizar para comercialización.

Ejemplo 6

Tabla 14. Preparación de una transglutaminasa líquida

Los componentes como se enumeran en la Tabla 14 se mezclaron homogéneamente para preparar una preparación líquida de transglutaminasa, y se midieron los parámetros relevantes. Con la preparación líquida de transglutaminasa se llenaron botellas de PET de 1 l bajo condiciones abiertas. Después de almacenamiento a temperatura ambiente durante 180 días, se observó la apariencia de la preparación enzimática líquida, y se midieron la actividad enzimática e índices de microorganismos. Los resultados muestran que, después de almacenamiento a temperatura ambiente durante 180 días, la tasa de conservación de actividad enzimática alcanzó 87 %, los índices de microorganismos cumplieron los requisitos, y por lo tanto, se obtuvo una preparación líquida de transglutaminasa estable.

Ejemplo 7

Tabla 15. Preparación de una transglutaminasa líquida

Los componentes como se enumeran en la Tabla 15 se mezclaron homogéneamente para preparar una preparación líquida de transglutaminasa, y se midieron los parámetros relevantes. Con la preparación líquida de transglutaminasa se llenaron botellas de PET de 1 l bajo condiciones abiertas. Después de almacenamiento a temperatura ambiente durante 180 días, se observó la apariencia de la preparación enzimática líquida, y se midieron la actividad enzimática e índices de microorganismos. Los resultados muestran que, en la presencia de un conservante, después de almacenamiento a temperatura ambiente durante 180 días, la tasa de conservación de actividad enzimática alcanzó 89 %, y los índices de microorganismos cumplieron los requisitos, por lo tanto, se obtuvo una preparación líquida de transglutaminasa estable.

Ejemplo 8

Los componentes como se enumeran en la Tabla 16 se mezclaron homogéneamente para preparar una preparación líquida de transglutaminasa, y se midieron los parámetros relevantes. Con la preparación líquida de transglutaminasa se llenaron botellas de PET de 1 l bajo condiciones abiertas. Después de almacenamiento a temperatura ambiente durante 180 días, se observó la apariencia de la preparación enzimática líquida, y se midieron las actividades enzimáticas e índices de microorganismos. Los resultados muestran que, después de almacenamiento a temperatura ambiente durante 180 días, la tasa de conservación de actividad enzimática alcanzó 88 %, y los índices de microorganismos cumplieron los requisitos, por lo tanto, se obtuvo una preparación líquida de transglutaminasa estable, en la que los reguladores potenciales y los reguladores de actividad de agua fueron componentes combinados, y se agregó un conservante.

Tabla 16. Preparación de una transglutaminasa líquida

Ejemplo 9

Tabla 17. Preparación de una transglutaminasa líquida

continuación

Los componentes como se enumeran en la Tabla 17 se mezclaron homogéneamente para preparar una preparación líquida de transglutaminasa, y se midieron los parámetros relevantes. Con la preparación líquida de transglutaminasa se llenaron botellas de PET de 1 l bajo condiciones abiertas. Después de almacenamiento a temperatura ambiente durante 180 días, se observó la apariencia de la preparación enzimática líquida, y se midieron las actividades enzimáticas e índices de microorganismos. Los resultados muestran que, después de almacenamiento a temperatura ambiente durante 180 días, la tasa de conservación de actividad enzimática alcanzó 88 %, y los índices de microorganismos cumplieron los requisitos, por lo tanto se obtuvo una preparación líquida de transglutaminasa estable con una actividad enzimática de 1000 u/ml.

Ejemplo 10

Los componentes como se enumeran en la Tabla 18 se mezclaron homogéneamente para preparar una preparación líquida de transglutaminasa, y se midieron los parámetros relevantes. Con la preparación líquida de transglutaminasa se llenaron botellas de PET de 1 l bajo condiciones abiertas. Después de almacenamiento a temperatura ambiente durante 180 días, se observó la apariencia de la preparación enzimática líquida, y se midieron las actividades enzimáticas e índices de microorganismos. Los resultados muestran que, después de almacenamiento a temperatura ambiente durante 180 días, la tasa de conservación de actividad enzimática alcanzó 81,5 %, y los índices de microorganismos cumplieron los requisitos, por lo tanto, se obtuvo una preparación líquida de transglutaminasa estable con una actividad enzimática de 10 u/ml y un pH de 5,5.

Tabla 18. Preparación de una transglutaminasa líquida

____ ___

continuación

Ejemplo 11

Los componentes como se enumeran en la Tabla 19 se mezclaron homogéneamente para preparar una preparación líquida de transglutaminasa, y se midieron los parámetros relevantes. Con la preparación líquida de transglutaminasa se llenaron botellas de PET de 1 l bajo condiciones abiertas. Después de almacenamiento a temperatura ambiente durante 180 días, se observó la apariencia de la preparación enzimática líquida, y se midieron las actividades enzimáticas e índices de microorganismos. Los resultados muestran que, después de almacenamiento a temperatura ambiente durante 180 días, la tasa de conservación de actividad enzimática alcanzó 81 %, y los índices de microorganismos cumplieron los requisitos, por lo tanto, se obtuvo una preparación líquida de transglutaminasa estable con una actividad enzimática de 99,8 u/ml y un pH de 8,0.

Tabla 19. Preparación de una transglutaminasa líquida

Ejemplo 12

Los componentes como se enumeran en la Tabla 20 se mezclaron homogéneamente para preparar una preparación líquida de transglutaminasa, y se midieron los parámetros relevantes. Con la preparación líquida de transglutaminasa se llenaron botellas de PET de 1 l bajo condiciones abiertas. Después de almacenamiento a temperatura ambiente durante 180 días, se observó la apariencia de la preparación enzimática líquida, y se midieron las actividades enzimáticas e índices de microorganismos. Los resultados muestran que, después de almacenamiento a temperatura ambiente durante 180 días, la tasa de conservación de actividad enzimática alcanzó 81 %, y los índices de microorganismos cumplieron los requisitos, por lo tanto una preparación líquida de transglutaminasa estable con una actividad enzimática de 100 u/ml, un pH de 6,0 y se obtuvo un potencial redox de - 400 mv. Dado que el borohidruro de sodio en la preparación no cumple con el requisito de las Regulaciones de Higiene de Alimentos, la preparación enzimática líquida de esta fórmula solo se puede aplicar con fines de investigación científica o adición no alimenticia.

Tabla 20. Preparación de una transglutaminasa líquida

Ejemplo 13

Los componentes como se enumeran en la Tabla 21 se mezclaron homogéneamente para preparar una preparación líquida de transglutaminasa, y se midieron los parámetros relevantes. Con la preparación líquida de transglutaminasa se llenaron botellas de PET de 1 l bajo condiciones abiertas. Después de almacenamiento a temperatura ambiente durante 180 días, se observó la apariencia de la preparación enzimática líquida, y se midieron las actividades enzimáticas e índices de microorganismos. Los resultados muestran que, después de almacenamiento a temperatura ambiente durante 180 días, la tasa de conservación de actividad enzimática alcanzó 82 %, y los índices de microorganismos cumplieron los requisitos, por lo tanto, se obtuvo una preparación líquida de transglutaminasa estable con una actividad enzimática de 50 u/ml, un pH de 6,0 y un potencial redox de 50 mv.

Tabla 21. Preparación de una transglutaminasa líquida

Ejemplo 14

Tabla 22. Preparación de una transglutaminasa líquida

Los componentes como se enumeran en la Tabla 22 se mezclaron homogéneamente para preparar una preparación líquida de transglutaminasa, y se midieron los parámetros relevantes. Con la preparación líquida de transglutaminasa se llenaron botellas de PET de 1 l bajo condiciones abiertas. Después de almacenamiento a temperatura ambiente durante 180 días, se observó la apariencia de la preparación enzimática líquida, y se midieron las actividades enzimáticas e índices de microorganismos. Los resultados muestran que, después de almacenamiento a temperatura ambiente durante 180 días, la tasa de conservación de actividad enzimática alcanzó 84 %, y los índices de microorganismos cumplieron los requisitos, por lo tanto ,se obtuvo una preparación líquida de transglutaminasa estable con una actividad enzimática de 100 u/ml, un pH de 6,0 y un potencial redox de 0 mv.

Ejemplo 15

Los componentes como se enumeran en la Tabla 23 se mezclaron homogéneamente para preparar una preparación líquida de transglutaminasa, y se midieron los parámetros relevantes. Con la preparación líquida de transglutaminasa se llenaron botellas de PET de 1 l bajo condiciones abiertas. Después de almacenamiento a temperatura ambiente durante 180 días, se observó la apariencia de la preparación enzimática líquida, y se midieron las actividades enzimáticas e índices de microorganismos. Los resultados muestran que, después de almacenamiento a temperatura ambiente durante 180 días, la tasa de conservación de actividad enzimática alcanzó 89 %, y los índices de microorganismos cumplieron los requisitos, por lo tanto, se obtuvo una preparación líquida de transglutaminasa estable con una actividad enzimática de 50 u/ml, actividad de agua de 0,61, y un potencial redox de -140 mv. No se incluyó conservante en la fórmula.

Tabla 23. Preparación de una transglutaminasa líquida

continuación

Ejemplo 16

Los componentes en la fórmula de Ejemplo 15 se mezclaron homogéneamente para preparar una preparación líquida de transglutaminasa, y se midieron los parámetros relevantes. Con la preparación líquida de transglutaminasa se llenaron botellas de PET opacas de 1 l bajo condiciones abiertas. Después de almacenamiento a temperatura ambiente durante 180 días, se observó la apariencia de la preparación enzimática líquida, y se midieron las actividades enzimáticas e índices de microorganismos. Los resultados muestran que, después de almacenamiento a temperatura ambiente durante 180 días, la tasa de conservación de actividad enzimática alcanzó 88 %, y los índices de microorganismos cumplieron los requisitos, por lo tanto, se obtuvo una preparación líquida de transglutaminasa estable con una actividad enzimática de 101 u/ml, actividad de agua de 0,85, y un potencial redox de - 38 mv. El envase para la preparación enzimática fue un material opaco, y no tuvo un efecto significativo sobre la estabilidad de enzima.

Ejemplo 17

Después de almacenamiento a temperatura ambiente durante 180 días, se midió la preparación líquida de transglutaminasa preparada en el Ejemplo 7 para tener una actividad enzimática de 98,79 u/ml. Se utilizó en la producción de salchicha. La fórmula y proceso particular se mostraron en la Tabla 24- 1. Se utilizó una preparación de transglutaminasa disponible comercialmente en forma de polvo (de Kinry Biotech (Jinan) Co., Ltd.) como control. Se midió para tener una actividad enzimática de 100 u/g antes de uso.

Tabla 24- 1. Uso de, transglutaminasa en polvo, líquida en la producción de salchichas

Después de que se elaboró la salchicha, el producto final se probó para los índices tales como resistencia del gel, elasticidad y puntuación sensorial. Los resultados experimentales se muestran en la Tabla 24-2.

Tabla 24-2. Efecto de una preparación de transglutaminasa en una forma líquida y una forma de polvo en los índices de salchicha

Los resultados de la prueba experimental mostraron que la preparación líquida de transglutaminasa tuvo un buen efecto en la aplicación de salchichas y tuvo índices de rendimiento significativamente mejorados de productos salchichas tales como la fuerza de gel y elasticidad, en comparación con la preparación de transglutaminasa en polvo a la misma dosis. La pérdida de enfriamiento mejoró algo, pero no significativamente, y la evaluación sensorial mejoró significativamente.

Ejemplo 18

El producto de transglutaminasa líquido preparado en el Ejemplo 5 (99,5 u/ml) se utilizó en la producción de tofu de Chiba. Preparaciones enzimáticas en polvo disponibles comercialmente, Producto A (transglutaminasa, fabricante: Taixing Dongsheng Bio-Tech Co., Ltd., Tipo TG-TI, No de lote: B20150926, actividad enzimática nominal: 116 u/g, actividad enzimática real medida en nuestro laboratorio: 108 u/g) y Producto B (transglutaminasa, fabricante: Taixing Yiming Biological Co. Ltd., Tipo TG-B, No de lote: 20150824, actividad enzimática nominal: 110 u/g, actividad enzimática real medida en nuestro laboratorio: 100 u/g) se utilizaron como controles. El fabricante de aislados de proteína de soja fue Shandong Yuwang Group; el almidón desnaturalizado de yuca era de Rose Brand; el aceite de soja fue proporcionado por COFCO Corporation; I+G y sal de salsa se compraron en el supermercado METRO; y el Control C era una preparación enzimática en polvo Biobond TG-I producida por Kinry Biotech (Jinan) Co., Ltd., actividad enzimática real medida: 110 u/ml. El tofu de Chiba se preparó de acuerdo con la fórmula y el proceso que se muestran en la Tabla 25-1.

Tabla 25-1. Uso de transglutaminasa líquida y en polvo en la producción de tofu de Chiba

Se probó el tofu de Chiba producido al utilizar diferentes preparaciones de transglutaminasa para determinar la resistencia del gel, elasticidad, color y brillo, sensación en la boca, etc. Los resultados se muestran en la Tabla 25-2.

Tabla 25-2. Evaluación de la calidad de tofu de Chiba producido por transglutaminasa líquida y en polvo

Los resultados de la prueba experimental mostraron que la preparación líquida de transglutaminasa era comparable a las preparaciones de transglutaminasa en polvo en la aplicación en tofu de Chiba, y la preparación en polvo podía ser reemplazada por completo por la preparación líquida durante la producción de tofu de Chiba. El tofu de Chiba producido de esta manera mejoró su calidad hasta cierto punto. La preparación líquida de transglutaminasa tenía valor comercial.

Los ejemplos anteriores son solo algunas realizaciones preferidas y ejemplos de aplicación de la invención, y la invención no se limita a estos.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Una preparación enzimática líquida, caracterizada porque la preparación enzimática líquida es una preparación enzimática líquida de transglutaminasa EC2.3.2.13 que tiene una actividad enzimática de 10 -1000 u/ml caracterizada porque la preparación enzimática líquida tiene las siguientes propiedades fisicoquímicas:

1) tener un pH de 5,0 - 9,0;

2) tener una actividad de agua Aw de < 0,89; y

3) tener un potencial redox de - 400 mv a 50 mv.

2. La preparación enzimática líquida de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizada porque sus componentes y cantidades de la misma son como sigue: la preparación líquida de transglutaminasa tiene una actividad enzimática de 10 - 1000 u/ml, un regulador de actividad de agua está presente en una cantidad de 30 - 80 % p/v, un regulador de potencial redox está presente en una cantidad de 0,0075 - 1 % p/v, un conservante de alimentos está presente en una cantidad de 0 - 0,1 % p/v, y un regulador de pH se agrega hasta un volumen final de 100 %.

3. La preparación enzimática líquida de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizada porque la preparación enzimática líquida preferentemente tiene las siguientes propiedades fisicoquímicas:

1) tener un pH de 5,0 - 7,5;

2) tener una actividad de agua Aw de 0,6 - 0,85; y

3) tener un potencial redox de - 400 mv a 0 mv.

4. La preparación enzimática líquida de acuerdo con la reivindicación 2, caracterizada porque el regulador de actividad de agua se selecciona del grupo que comprende sorbitol, maltitol, propilenglicol, glicerol, xilitol, polietilenglicol, trehalosa, sacarosa, maltosa, isomaltosa, maltodextrina, xilitol, y manitol.

5. La preparación enzimática líquida de acuerdo con la reivindicación 2, caracterizada porque el regulador de potencial redox comprende uno o más de ácido L-ascórbico y una sal del mismo, L-serina y una sal de la misma, L-cisteína y una sal de la misma, glutatión reducido, polifenol del té, hidrolizado de proteína de soja, hidrolizado de proteína de trigo, hidrolizado de caseína, hidrolizado de quitosano, antioxidante de hoja de bambú, extracto de romero, extracto antioxidante de regaliz, superóxido dismutasa, glucosa oxidasa, bisulfito de sodio, metabisulfito de sodio, metabisulfito de potasio, sulfito de sodio, hiposulfito de sodio, ácido fítico.

6. La preparación enzimática líquida de acuerdo con la reivindicación 2, caracterizada porque el aditivo para alimentos se selecciona del grupo que comprende e-polilisina, natamicina, lisozima, Nisina, sorbato de potasio, deshidroacetato de sodio, diacetato de sodio, p-hidroxibenzoato de metilo, arginato de etil lauroi1HCl, metabisulfito de potasio, y metabisulfito de sodio.

7. La preparación enzimática líquida de acuerdo con la reivindicación 2, caracterizada porque el regulador de pH es uno de ácido clorhídrico, ácido sulfúrico, ácido acético, ácido láctico, ácido cítrico, ácido málico, ácido fítico, ácido fosfórico, ácido nítrico, ácido oxálico, , hidróxido de potasio, carbonato de sodio, bicarbonato de sodio, carbonato de potasio, bicarbonato de potasio, citrato de trisodio, citrato de trispotasio, acetato de sodio, acetato de potasio, lactato de sodio, lactato de potasio, hidrógeno fosfato de disodio, hidrógeno fosfato de dipotasio, fosfato de sodio, fosfato de potasio, agua potable, agua purificada, y agua mineral, o un sistema tampón que consiste en varios reguladores de pH.

8. La preparación enzimática líquida de acuerdo con la reivindicación 2, caracterizada porque el regulador de actividad de agua comprende uno o más de sorbitol, maltitol, y glicerol; y el regulador de pH es un tampón que comprende ácido fosfórico, ácido acético, ácido láctico o ácido cítrico, o una sal del mismo.

9. Un procedimiento para preparar la preparación enzimática líquida de acuerdo con una cualquiera de reivindicaciones 1 - 8, caracterizado por las siguientes etapas:

2) mezcla: pesar la solución enzimática concentrada purificada, un regulador de actividad de agua, y un regulador de potencial redox cuantitativamente, agregar un conservante de alimentos si está presente, y mezclar; agregar un regulador de pH hasta un volumen final de 100 %; después de mezclar de forma homogénea, probar y ajustar la preparación enzimática líquida para los siguientes parámetros: un pH de 5,0 - 9,0, una actividad de agua Aw de < 0,89, y un potencial redox de - 400 mv a 50 mv;

3) eliminación de bacterias: filtrar la mezcla resultante a través de una membrana de 0,1 - 0,22 |jm para esterilización, seguido de llenado estéril;

4) envasado: envasar la preparación enzimática líquida mediante llenado estéril u otro proceso de envasado de líquidos apropiado.