CN112034022B - 一种复合酶溶液、酒精检测试纸及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种复合酶溶液、酒精检测试纸及其制备方法和应用。所述复合酶溶液包括：酶溶液A、酶溶液B和电子媒介溶液C；所述酶溶液A包括：乙醇氧化酶、山梨酸钾和甘油；所述酶溶液B包括：过氧化物酶、还原剂和电解质盐；所述电子媒介溶液C包括：电子媒介体、多糖、聚甘油脂肪酸脂、木糖醇、烷基酚聚氧乙烯醚、稳定剂和缓冲溶液。所述复合酶溶液能够有效平衡酶的活性和稳定性，由所述复合酶溶液制备得到的酒精检测试纸用于电化学定量检测血液或唾液中的酒精含量，操作方便、快速，灵敏度好，准确性高，稳定性好，且工艺成本较低。

Description

一种复合酶溶液、酒精检测试纸及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及电化学生化检测领域，具体涉及一种复合酶溶液、酒精检测试纸及其制备方法和应用。
背景技术
近年来，随着交通运输业的迅速发展，机动车数量和拥有驾照的人员数量快速增长，与此同时，各类交通事故数量也在增加。在这些交通事故中，饮酒和醉酒造成的交通事故高达20％以上。因此，快速、准确的检测驾驶员的人体酒精浓度受到人们越来越多的关注。酒精检测在法医学和临床检验中具有重要的作用，检测血液或者唾液酒精浓度，可以用来诊断急性酒精中毒以及与酒精滥用相关的一些综合症。
目前，主要的酒精测试方法包括：呼气酒精检测、分光光度法和气相色谱法。其中，呼吸式设备价格昂贵，特异性差，干扰多，测试的可靠性比较差；分光光度法的灵敏度高，重复性好，线性范围宽，但是样品需要稀释，预处理繁琐；气相色谱法测定时间比较长，检测费用比较高，合适批量检测。而且，目前市场上用的半定量唾液酒精试纸，测试准确度不高，不能进行准确的定量测试；且部分试酒精试纸存在酶活化成分有毒，对人体有害，污染环境，无法有效平衡酶的活性和稳定性的问题。此外，目前技术制作的半定量唾液酒精试纸，存在部分底色不正常，导致测试结果误差大。然而，定量测试血液或者唾液中酒精浓度，对于部分驾驶人员喝了少量酒，测试是否达到酒驾以及诊断急性酒精中毒等具有重要作用。
CN107607730A公开了一种用于检测唾液中酒精含量的试剂条、制备方法和试剂盒。所述试剂条包括牛血清白蛋白和海藻酸钠。所述牛血清白蛋白可与乙醇氧化酶和辣根过氧化物酶溶液均匀混合，防止酶的分解和非特异性吸附，避免了产品检测时产生假阳性的现象，使产品具有更优良的稳定性，然而该试剂条属于半定量试纸条测试，存在检测不够准确，无法进行准确定量检测的问题。
CN103267758A公开了一种用于测试唾液中酒精含量的干化学法快速诊断试剂条及其制备方法。它包括用于支撑反应物体系的支持物；用于吸附所述反应物的滤纸；所述反应物包括为显色剂、乙醇氧化酶和/或过氧化物酶、含氮杂环化合物以及添加剂，所述添加剂为牛血清白蛋白、聚乙烯吡咯烷酮或乙基纤维素中的一种或两种以上。该发明的试剂条虽然能够有效避免产生假阳性现象的问题，但该试剂条同样存在无法进行准确定量检测的问题。
因此，开发一种能够有效平衡酶的活性和稳定性的复合酶溶液，使其应用于试纸条，对于定量测试血液或者唾液中酒精浓度具有及其重要的意义。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种复合酶溶液、酒精检测试纸及其制备方法和应用。所述复合酶溶液能够有效平衡酶的活性和稳定性，由所述复合酶溶液制备得到的酒精检测试纸用于电化学传感器以定量检测血液或唾液中的酒精含量，操作方便、快速，灵敏度好，准确性高，稳定性好，且工艺成本较低。
为达此目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供一种复合酶溶液，所述复合酶溶液包括：酶溶液A、酶溶液B和电子媒介溶液C；
所述酶溶液A包括：乙醇氧化酶、山梨酸钾和甘油；
所述酶溶液B包括：过氧化物酶、还原剂和电解质盐；
所述电子媒介溶液C包括：电子媒介体、多糖、聚甘油脂肪酸脂、木糖醇、烷基酚聚氧乙烯醚、稳定剂和缓冲溶液。
本发明所述复合酶溶液包括：酶溶液A、酶溶液B和电子媒介溶液C，各组分相互配合，具有协同增效的作用，可以提高酶活性和稳定性，防止酶被氧化，加速稳定性以及真实稳定性实验效果测试结果优异。所述酶溶液A、酶溶液B和电子媒介溶液C的溶剂均为水。
其中，所述山梨酸钾和甘油具有协同抗菌作用，当山梨酸钾和甘油联合作用时，不仅能够显著提高乙醇氧化酶在水溶液中的活性，又具有协同抗菌的作用。还原剂和电解质盐的协同作用，可以提高过氧化物的酶活性，防止酶被氧化，加速稳定性以及真实稳定性实验效果测试结果比较好。电子媒介体的加入使得本发明所述复合酶溶液可用于电化学传感器用试纸的制备，使其可应用于定量检测血液或唾液中的酒精含量。所述多糖起到保护酶活性和防沉降的作用。聚甘油脂肪酸脂和木糖醇相互配合，可提高乙醇氧化酶在高温制作以及长期保存下的稳定性。烷基酚聚氧乙烯醚提高复合酶溶液的润湿性和渗透性，从而增加其制备得到的试纸的灵敏度和准确性。
优选地，所述酶溶液A、酶溶液B和电子媒介溶液C的体积比为(1-2):(1-2):(5-10)，优选为1:1:5。
其中，第一个“1-2”例如可以是1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2等；其中，第二个“1-2”例如可以是1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2等；其中，“5-10”例如可以是5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5、10等。
优选地，所述酶溶液A包括：乙醇氧化酶300-400U/mL、山梨酸钾1-10mg/mL和甘油1-10mg/mL，所述酶溶液A的溶剂为水。
所述酶溶液A中，乙醇氧化酶活力为300-400U/mL，例如可以是300U/mL、320U/mL、340U/mL、350U/mL、360U/mL、380U/mL、400U/mL等。
所述酶溶液A中，山梨酸钾的浓度为1-10mg/mL，例如可以是1mg/mL、2mg/mL、3mg/mL、4mg/mL、5mg/mL、6mg/mL、7mg/mL、8mg/mL、9mg/mL、10mg/mL等。
所述酶溶液A中，甘油的浓度为1-10mg/mL，例如可以是1mg/mL、2mg/mL、3mg/mL、4mg/mL、5mg/mL、6mg/mL、7mg/mL、8mg/mL、9mg/mL、10mg/mL等。
优选地，所述酶溶液B包括：过氧化物酶300-400U/mL、还原剂1-10mg/mL和电解质盐10-100mg/mL。
所述酶溶液B中，过氧化物酶活力为300-400U/mL，例如可以是300U/mL、320U/mL、340U/mL、350U/mL、360U/mL、380U/mL、400U/mL等。
所述酶溶液B中，还原剂的浓度为1-10mg/mL，例如可以是1mg/mL、2mg/mL、3mg/mL、4mg/mL、5mg/mL、6mg/mL、7mg/mL、8mg/mL、9mg/mL、10mg/mL等。
所述酶溶液B中，电解质盐的浓度为10-100mg/mL，例如可以是10mg/mL、20mg/mL、30mg/mL、40mg/mL、50mg/mL、60mg/mL、70mg/mL、80mg/mL、90mg/mL、100mg/mL等。
优选地，所述还原剂包括维生素C、硫酸亚铁铵、硫酸亚铁、葡萄糖酸亚铁、硫酸亚铁铵，硫代硫酸钠、亚硫酸钠或连二亚硫酸钠中的任意一种或至少两种的组合，优选为维生素C。
优选地，所述电解质盐包括氯盐、碳酸盐、硝酸盐或谷氨酸盐中的任意一种或至少两种的组合，优选为谷氨酸盐。
优选地，所述电子媒介溶液C包括：电子媒介体5-20mg/mL、多糖5-20mg/mL、聚甘油脂肪酸脂5-20mg/mL、木糖醇5-20mg/mL、烷基酚聚氧乙烯醚0.1-1mg/mL、稳定剂0.5-2mg/mL和缓冲溶液5-20mg/mL。
所述电子媒介溶液C中，电子媒介体的浓度为5-20mg/mL，例如可以是5mg/mL、6mg/mL、7mg/mL、8mg/mL、9mg/mL、10mg/mL、11mg/mL、12mg/mL、13mg/mL、14mg/mL、15mg/mL、16mg/mL、17mg/mL、18mg/mL、19mg/mL、20mg/mL等。
所述电子媒介溶液C中，多糖的浓度为5-20mg/mL，例如可以是5mg/mL、6mg/mL、7mg/mL、8mg/mL、9mg/mL、10mg/mL、11mg/mL、12mg/mL、13mg/mL、14mg/mL、15mg/mL、16mg/mL、17mg/mL、18mg/mL、19mg/mL、20mg/mL等。
所述电子媒介溶液C中，聚甘油脂肪酸脂的浓度为5-20mg/mL，例如可以是5mg/mL、6mg/mL、7mg/mL、8mg/mL、9mg/mL、10mg/mL、11mg/mL、12mg/mL、13mg/mL、14mg/mL、15mg/mL、16mg/mL、17mg/mL、18mg/mL、19mg/mL、20mg/mL等。
所述电子媒介溶液C中，木糖醇的浓度为5-20mg/mL，例如可以是5mg/mL、6mg/mL、7mg/mL、8mg/mL、9mg/mL、10mg/mL、11mg/mL、12mg/mL、13mg/mL、14mg/mL、15mg/mL、16mg/mL、17mg/mL、18mg/mL、19mg/mL、20mg/mL等。
所述电子媒介溶液C中，烷基酚聚氧乙烯醚的浓度为0.1-1mg/mL，例如可以是0.1mg/mL、0.2mg/mL、0.3mg/mL、0.4mg/mL、0.5mg/mL、0.6mg/mL、0.7mg/mL、0.8mg/mL、0.9mg/mL、1mg/mL等。必须要用低浓度的烷基酚聚氧乙烯醚，是由于发现过高浓度的烷基酚聚氧乙烯醚对乙醇氧化酶的破坏性比较大。
所述电子媒介溶液C中，稳定剂的浓度为0.5-2mg/mL，例如可以是0.5mg/mL、0.6mg/mL、0.8mg/mL、1mg/mL、1.2mg/mL、1.4mg/mL、1.6mg/mL、1.8mg/mL、2mg/mL等。
所述电子媒介溶液C中，缓冲溶液的浓度为5-20mg/mL，例如可以是5mg/mL、6mg/mL、7mg/mL、8mg/mL、9mg/mL、10mg/mL、11mg/mL、12mg/mL、13mg/mL、14mg/mL、15mg/mL、16mg/mL、17mg/mL、18mg/mL、19mg/mL、20mg/mL等。
优选地，所述电子媒介体包括氧化态电子媒介体和/或还原态电子媒介体，优选为还原态电子媒介体。
优选地，所述氧化态电子媒介体包括氧化态尼罗兰、铁氰化钾或钌盐中的任意一种或至少两种的组合。
优选地，所述还原态电子媒介体包括还原态尼罗兰、亚铁氰化钾或亚钌盐中的任意一种或至少两种的组合。
优选地，所述电子媒介体为钌盐，优选为还原态钌盐(即低价态的钌盐，可以被氧化的钌盐氯化六氨合亚钌)。在筛选不同的电子媒介体发现，用不同的氧化态(例如高价态的钌盐，可以被还原的钌盐氯化六氨合钌)作为电子媒介体进行测试时，氧化性电流测试受对还原剂等组分的干扰会比较大，用钌盐的还原态作为电子媒介体测试，测试还原性电流，可以完全避免如还原剂等组分等多种干扰的影响。
优选地，所述多糖包括葡聚糖、海藻糖、甘露醇、山梨醇、蔗糖或纤维素中的任意一种或至少两种的组合，优选为葡聚糖。葡聚糖的稳定性能和抗沉淀性能最为优异。
优选地，所述烷基酚聚氧乙烯醚包括壬基酚聚氧乙烯醚、辛基酚聚氧乙烯醚、十二烷基聚氧乙烯醚或二壬基酚聚氧乙烯醚中的任意一种或至少两种的组合，优选为壬基酚聚氧乙烯醚。
优选地，所述壬基酚聚氧乙烯醚的EO数为8-12，例如可以是8、9、10、11、12等。
实验结果发现，烷基酚聚氧乙烯醚中添加到所述复合酶溶液效果较好；烷基酚聚氧乙烯醚是以烷基酚为亲油基，与环氧乙烷缩合而成；其中的亲油基可以是苯酚，甲苯酚，萘酚等，最有实用价值的是壬基酚。接环氧乙烷的平均数也不同。以壬基酚为例，接4个EO时还不溶于水，加到6-7个EO时，产品在室温下，完全溶于水，而8-12个EO缩合的产品则具有非常优良的润湿性、渗透性、和洗涤能力。
优选地，所述稳定剂包括辛酸盐、辛酸、乙酸或乙酸盐中的任意一种或至少两种的组合，优选为辛酸盐。
优选地，所述缓冲溶液为PBS缓冲液，所述PBS缓冲液的pH为7-9，例如可以是7、7.5、8、8.5、9等。
第二方面，本发明提供一种如第一方面所述的复合酶溶液在制备酒精检测试纸中的应用。
由本发明所述的复合酶溶液制备得到的酒精检测试纸，可以用于定量检测血液或者唾液酒精含量，相比较普通的唾液测试，可以由仪器的测试直接读出检测结果，其具有结构简单，检测简便，且快速，准确，高效，使用成本低，灵敏度高，稳定性好和可靠性高的优点，具有很高的推广应用价值。
第三方面，本发明提供一种酒精检测试纸，所述酒精检测试纸包括依次层叠的PET基板、导电银层、导电碳层、绝缘涂层、酶涂层、双面胶层和亲水膜层，所述酶涂层为如第一方面所述的复合酶溶液干燥形成的酶涂层。
在本发明中，所述绝缘涂层和所述双面胶层均设置有对应所述酶涂层的相应的开口槽，从而使所述复合酶溶液直接涂敷于导电碳层上干燥形成的酶涂层，并使得酶涂层直接与亲水膜层接触，如此构成一个电路回路，反应时根据血液或唾液中酒精浓度的高低，产生相应大小的电流信号，并被测试仪检测读出，由本发明所述的复合酶溶液制备得到的酒精检测试纸，容易保存，稳定性好，受环境的影响比较小，该试纸条检测快速，准确，灵敏度高，稳定性好，定量检测，真实可靠。
所述酒精检测试纸上的导电碳层作为工作电极和参比电极，该工作电极上设置有本发明所述复合酶溶液形成的酶涂层，即测量工作区范围内部的工作电极和参比电极上有能够与酒精反应并产生电子的酶试剂反应膜，酶试剂反应膜分别与工作电极和参比电极相连。工作电极和参比电极分别通过电极线将信号传到绝缘覆盖膜外，如此构成一个电路回路，反应时根据血液或唾液中葡萄糖浓度的高低，产生相应大小的电流信号，并被测试仪检测读出。
在本发明中，所述亲水膜层主要作用是让血液或者唾液快速的渗透进入酶反应层反应。其中，所述亲水膜层保留的是羧基甲基纤维素、羧基乙基纤维素、聚乙烯醇、明胶、乳糖、聚甘油脂肪酸脂或吐温80中任意的一种或至少两种的组合。
第四方面，本发明提供一种如第三方面所述的酒精检测试纸的制备方法，所述酒精检测试纸的制备方法为：利用丝网印刷的方法在PET基板上依次印刷银油墨、碳油墨和绝缘油墨，形成导电银层、导电碳层和绝缘涂层后，涂覆如第一方面所述的复合酶溶液烘干形成酶涂层，再依次贴敷双面胶和亲水膜，最后滚压成形、冲切，得到所述酒精检测试纸。
本发明所述的复合酶溶液制备得到的酒精检测试纸的制备方法简单便捷，可以更加便捷的配置，同时不存在显示剂被氧化等特点，不存在灯光等不同颜色比对的特点，可以使得酒精试纸在筒装或者单人份包装的条件下，长期保存2年以上。本发明所述酒精试纸的制作方法工艺简单，价格便宜，实用，加工和封装等技术比较成熟方便；加工成本低，有利于规模化生产；并且测试条的重复性，精密度，批间差异等质量有显著提高。存放时只需将试纸装入带有干燥剂的铝箔袋，真空封装；或者放入带有干燥剂的黑桶中即可。该制作方法工艺简单，价格便宜；实用，加工和封装等技术比较成熟方便；加工成本低，有利于规模化生产；并且测试条的重复性，精密度，批间差异等质量有显著提高。
优选地，所述烘干的温度为60-70℃，例如可以是60℃、61℃、62℃、63℃、64℃、65℃、66℃、67℃、68℃、69℃、70℃等，所述烘干的时间为10-20min，例如可以是10min、11min、12min、13min、14min、15min、16min、17min、18min、19min、20min等。
第五方面，本发明提供一种如第三方面所述的酒精检测试纸在定量检测血液或唾液酒精含量中的应用。
本发明采用电化学传感器的方法测试血液或者唾液中的酒精含量，可以定量检测人体的酒精含量，精密度高，线性范围比较广，测试方便简单，生产制作比较便宜。
相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：
(1)本发明所述复合酶溶液能够有效平衡酶的活性和稳定性，防止酶被氧化，加速稳定性以及真实稳定性测试结果优异；
(2)由所述复合酶溶液制备得到的酒精检测试纸可用于血液或者唾液酒精含量的定量检测，可以定量检测测试结果，其具有结构简单，检测简便，快速，准确，高效，使用成本低，灵敏度高，稳定性好，和可靠性高的优点，具有很高的推广应用价值；
(3)本发明所述酒精检测试纸的制备方法简单，同时显示剂不易被氧化，酒精试纸在筒装或者单人份包装的条件下，长期保存2年以上；
(4)本发明所述酒精检测试纸的制备工艺简单，加工成本低，实用，加工和封装等技术成熟方便，有利于规模化生产，并且检测试纸的重复性，精密度，批间差异等质量有显著提高。
具体实施方式
下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。
下述实施例中各组分来源主要通过商业采购的方式获取，其中过氧化物酶购于众化(杭州)科技有限公司；氯化六氨合钌购于湖北广澳生物科技有限公司；氯化六氨合亚钌购于南京艾康化工有限公司；壬基酚聚氧乙烯醚购于生工生物工程(上海)股份有限公司；辛酸钠购于生工生物工程(上海)股份有限公司。
下述实施例提供的PBS缓冲液由以下制备方法制备得到：
(1)称量8g NaCl、0.2g KCl、1.42g Na2HPO4和0.27g KH2PO4置于1L烧杯中，加入约800mL的去离子水，充分搅拌溶解；
(2)滴加浓盐酸将pH值调节至7.4，然后去离子水将溶液定容至1L；
(3)高温高压灭菌后，室温保存。
实施例1
本实施例提供一种复合酶溶液，所述复合酶溶液包括：酶溶液A、酶溶液B和电子媒介溶液C，所述酶溶液A、酶溶液B和电子媒介溶液C的体积比为1:1:5，所述复合酶溶液包括如下组分：
Figure BDA0002685561920000111
本实施例提供一种酒精检测试纸，所述酒精检测试纸的制备方法包括以下步骤：
(1)准备：检查银油墨、碳油墨和绝缘油墨无结痂、无成块，同时流动性好；将PET基板定位于印刷台面的合适位置；将网版装于丝印机网架上，使网版上定位孔与基板定位孔对准后，锁紧固定网版；将网版与PET基板的间距调好，并且要求网版和PET基板平行；
(2)丝印：在PET基板预设位置利用丝网印刷的方法在PET基板上依次印刷银油墨、碳油墨和绝缘油墨，形成导电银层、导电碳层和绝缘涂层；
(3)烘烤：将印刷好导电银层、导电碳层和绝缘涂层的基板放于晾干架上，再把晾干架推入烘箱在100℃下烘烤，从推入后开始计时，烘烤20min；
(4)组装：将本实施例提供的复合酶溶液在65℃下烘干15min，干燥后，用双面胶间隔层将PET基板与亲水膜(羧基甲基纤维素膜)粘贴，冲切后制作成试纸，将试纸插到测试的仪器上面，得到所述酒精检测试纸。
实施例2
本实施例提供一种复合酶溶液和酒精检测试纸，所述复合酶溶液与实施例1的区别仅在于，将所述电子媒介体替换为氧化态钌盐，其他组分及含量与实施例1相同，酒精检测试纸的制备方法同实施例1。
实施例3
本实施例提供一种复合酶溶液和酒精检测试纸，所述复合酶溶液与实施例1的区别仅在于，将所述电子媒介体替换为铁氰化钾，其他组分及含量与实施例1相同，酒精检测试纸的制备方法同实施例1。
实施例4
本实施例提供一种复合酶溶液和酒精检测试纸，所述复合酶溶液与实施例1的区别仅在于，将所述维生素C替换为硫酸亚铁铵，其他组分及含量与实施例1相同，酒精检测试纸的制备方法同实施例1。
实施例5
本实施例提供一种复合酶溶液和酒精检测试纸，所述复合酶溶液与实施例1的区别仅在于，将所述谷氨酸钠替换为氯化钠，其他组分及含量与实施例1相同，酒精检测试纸的制备方法同实施例1。
实施例6
本实施例提供一种复合酶溶液和酒精检测试纸，所述复合酶溶液与实施例1的区别仅在于，将所述葡聚糖替换为海藻糖，其他组分及含量与实施例1相同，酒精检测试纸的制备方法同实施例1。
实施例7
本实施例提供一种复合酶溶液和酒精检测试纸，所述复合酶溶液与实施例1的区别仅在于，将所述壬基酚聚氧乙烯醚替换为辛基酚聚氧乙烯醚，其他组分及含量与实施例1相同，酒精检测试纸的制备方法同实施例1。
实施例8
本实施例提供一种复合酶溶液和酒精检测试纸，所述复合酶溶液与实施例1的区别仅在于，将所述辛酸钠替换为辛酸，其他组分及含量与实施例1相同，酒精检测试纸的制备方法同实施例1。
实施例9
本实施例提供一种复合酶溶液和酒精检测试纸，所述复合酶溶液与实施例1的区别仅在于，所述壬基酚聚氧乙烯醚的添加量为0.02g，其他组分及含量与实施例1相同，酒精检测试纸的制备方法同实施例1。
实施例10
本实施例提供一种复合酶溶液和酒精检测试纸，所述复合酶溶液为实施例1提供的复合酶溶液，所述酒精检测试纸与实施例1的区别仅在于，所述亲水膜为PEG-4000膜，酒精检测试纸的制备方法同实施例1。
对比例1
本对比例提供一种复合酶溶液和酒精检测试纸，所述复合酶溶液与实施例1的区别仅在于，所述酶溶液A中不添加山梨酸钾，所述甘油的添加量为0.02g，其他组分及含量与实施例1相同，酒精检测试纸的制备方法同实施例1。
对比例2
本对比例提供一种复合酶溶液和酒精检测试纸，所述复合酶溶液与实施例1的区别仅在于，所述酶溶液A中不添加甘油，所述山梨酸钾的添加量为0.02g，其他组分及含量与实施例1相同，酒精检测试纸的制备方法同实施例1。
对比例3
本对比例提供一种复合酶溶液和酒精检测试纸，所述复合酶溶液与实施例1的区别仅在于，所述酶溶液B中不添加维生素C，所述谷氨酸钠的添加量为0.11g，其他组分及含量与实施例1相同，酒精检测试纸的制备方法同实施例1。
对比例4
本对比例提供一种复合酶溶液和酒精检测试纸，所述复合酶溶液与实施例1的区别仅在于，所述酶溶液B中不添加谷氨酸钠，所述维生素C的添加量为0.11g，其他组分及含量与实施例1相同，酒精检测试纸的制备方法同实施例1。
对比例5
本对比例提供一种复合酶溶液和酒精检测试纸，所述复合酶溶液与实施例1的区别仅在于，所述电子媒介溶液C中不添加葡聚糖，所述木糖醇的添加量为0.2g，其他组分及含量与实施例1相同，酒精检测试纸的制备方法同实施例1。
对比例6
本对比例提供一种复合酶溶液和酒精检测试纸，所述复合酶溶液与实施例1的区别仅在于，所述电子媒介溶液C中不添加聚甘油脂肪酸脂，所述木糖醇的添加量为0.2g，其他组分及含量与实施例1相同，酒精检测试纸的制备方法同实施例1。
对比例7
本对比例提供一种复合酶溶液和酒精检测试纸，所述复合酶溶液与实施例1的区别仅在于，所述电子媒介溶液C中不添加木糖醇，所述聚甘油脂肪酸脂的添加量为0.2g，其他组分及含量与实施例1相同，酒精检测试纸的制备方法同实施例1。
对比例8
本对比例提供一种复合酶溶液和酒精检测试纸，所述复合酶溶液与实施例1的区别仅在于，将所述壬基酚聚氧乙烯醚替换为离子型表面活性剂(十二烷基苯磺酸钠)，其他组分及含量与实施例1相同，酒精检测试纸的制备方法同实施例1。
对比例9
本对比例提供一种复合酶溶液和酒精检测试纸，所述复合酶溶液与实施例1的区别仅在于，所述电子媒介溶液C中不添加辛酸钠，所述PBS缓冲液的添加量为0.11g，其他组分及含量与实施例1相同，酒精检测试纸的制备方法同实施例1。
对比例10
本对比例提供一种复合酶溶液和酒精检测试纸，所述复合酶溶液与实施例1的区别仅在于，所述电子媒介溶液C中不添加PBS缓冲液，所述辛酸钠的添加量为0.11g，其他组分及含量与实施例1相同，酒精检测试纸的制备方法同实施例1。
试验例1
稳定性测试
分别使用刚制作的实施例1-10和对比例1-10提供的酒精检测试纸，在300mV的测试电压下测试，待测样本为酒精含量为0-20mg/mL、20-60mg/mL、80-150mg/mL，红细胞压积调整到40-42％的全血标本，全血标本的真实值参考竞品仪器(大型生化分析仪，BJ-SAD300壁挂酒精测试仪)检测结果，每个浓度的全血标本分别进行10次重复实验，结果取平均(average)，并分别计算标准偏差(SD)、变异系数(CV，是标准差与平均值之比表示)和乖离率(BIAS，％)；具体测试结果如表1所示：
表1
Figure BDA0002685561920000161
Figure BDA0002685561920000171
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Figure BDA0002685561920000181
由表1测试数据可知，由本发明所述复合酶溶液制备得到的酒精检测试纸，在血液酒精含量检测中显示，对于酒精含量为0-20mg/mL的检测，其SD在0.35以下，CV值在0.035以下，BIAS值为-9～1％；对于酒精含量为20-60mg/mL的检测，SD在2.0以下，CV值在0.04以下，BIAS值为-5～2％；对于酒精含量为80-150mg/mL的检测，SD在5.0以下，CV值在0.07以下，BIAS值为-7～3％。说明本发明所述复合酶溶液中各组分相互配合，具有协同增效的作用，可以显著提高复合酶溶液中乙醇氧化酶和过氧化物酶的活性和稳定性，因此，制备得到的酒精试纸可以直接读出仪器的测试结果以定量检测酒精含量，检测简便，快速，准确，高效，实用成本低，灵敏度高，稳定性好，可靠性高。
试验例2
加速稳定性测试
分别使用模拟存放两年的实施例1-10和对比例1-10提供的酒精检测试纸(模拟条件：进行加速处理，于65℃环境中放置2周)，在300mV的测试电压下测试，待测样本为酒精含量为0-20mg/mL、20-60mg/mL、80-150mg/mL，红细胞压积调整到40-42％的全血标本，全血标本的真实值参考竞品仪器(大型生化分析仪，BJ-SAD300壁挂酒精测试仪)检测结果，每个浓度的全血标本分别进行10次重复实验，结果取平均(average)，并分别计算标准偏差(SD)、变异系数(CV，是标准差与平均值之比表示)和乖离率(BIAS，％)；
具体测试结果如表2所示：
表2
Figure BDA0002685561920000191
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Figure BDA0002685561920000201
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Figure BDA0002685561920000211
由表2测试数据可知，由本发明所述复合酶溶液制备得到的酒精检测试纸，在加速稳定性血液酒精含量检测中显示，对于酒精含量为0-20mg/mL的检测，其SD在0.35以下，CV值在0.035以下，BIAS值为-10～3％；对于酒精含量为20-60mg/mL的检测，SD在2.0以下，CV值在0.04以下，BIAS值为-6～2％；对于酒精含量为80-150mg/mL的检测，SD在5.0以下，CV值在0.07以下，BIAS值为-8～3％。说明本发明所述复合酶溶液中各组分相互配合，具有协同增效的作用，可以显著提高复合酶溶液中乙醇氧化酶和过氧化物酶的活性和稳定性，因此，本发明所述检测试纸不易被氧化，酒精试纸在筒装或者单人份包装的条件下，长期保存2年以上。
试验例3
抗干扰检测试验
分别使用刚制作的实施例1、2提供的酒精检测试纸进行抗干扰检测试验，在300mV的测试电压下测试，其中待测样品包括：1、正常血样组：待测样本为酒精含量为0-20mg/mL、20-60mg/mL、80-150mg/mL；2、干扰血样1组：在待测样本为酒精含量为0-20mg/mL、20-60mg/mL、80-150mg/mL分别加入3mg/dl的维生素C；3、干扰血样2组：在待测样本为酒精含量为0-20mg/mL、20-60mg/mL、80-150mg/mL分别加入3mg/dl的对乙酰氨基酚；
红细胞压积调整到40-42％的全血标本，全血标本的真实值参考竞品仪器(大型生化分析仪，BJ-SAD300壁挂酒精测试仪)检测结果，每个浓度的全血标本分别进行10次重复实验，结果取平均(average)，并分别计算标准偏差(SD)、变异系数(CV，是标准差与平均值之比表示)和乖离率(BIAS，％)；
具体测试结果如表3所示：
表3
Figure BDA0002685561920000221
Figure BDA0002685561920000231
由表3测试数据可知，通过还原态钌盐作为电子媒介体和氧化态钌盐作为电子媒介体的测试，都可以测试出不同的血液或者唾液中的酒精浓度，重复性好，准确度高，线性范围比较大；而在抗干扰实验中显示：对于血液或唾液中含干扰因子(维生素C或对乙酰氨基酚时)，以还原态的钌盐作为电子媒介体的测试效果远远比氧化态的测试效果好很多，抗干扰能力极强。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明所述复合酶溶液、酒精检测试纸及其制备方法和应用，但本发明并不局限于上述实施例，即不意味着本发明必须依赖上述实施例才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范和公开范围之内。

Claims (20)

1.一种复合酶溶液，其特征在于，所述复合酶溶液包括：酶溶液A、酶溶液B和电子媒介溶液C；
所述酶溶液A包括：乙醇氧化酶、山梨酸钾和甘油；
所述酶溶液B包括：过氧化物酶、还原剂和电解质盐；
所述电子媒介溶液C包括：电子媒介体、多糖、聚甘油脂肪酸脂、木糖醇、烷基酚聚氧乙烯醚、稳定剂和缓冲溶液；
所述电子媒介体为还原态电子媒介体，所述还原态电子媒介体包括还原态尼罗兰、亚铁氰化钾或亚钌盐中的任意一种或至少两种的组合；
所述还原剂包括维生素C、硫酸亚铁铵、硫酸亚铁、葡萄糖酸亚铁、硫代硫酸钠、亚硫酸钠或连二亚硫酸钠中的任意一种或至少两种的组合；
所述电解质盐包括氯盐、碳酸盐、硝酸盐或谷氨酸盐中的任意一种或至少两种的组合。
2.根据权利要求1所述的复合酶溶液，其特征在于，所述酶溶液A、酶溶液B和电子媒介溶液C的体积比为(1-2):(1-2):(5-10)。
3.根据权利要求1所述的复合酶溶液，其特征在于，所述酶溶液A包括：乙醇氧化酶300-500U/mL、山梨酸钾1-10mg/mL和甘油1-10mg/mL。
4.根据权利要求1所述的复合酶溶液，其特征在于，所述酶溶液B包括：过氧化物酶300-500U/mL、还原剂1-10mg/mL和电解质盐10-100mg/mL。
5.根据权利要求1所述的复合酶溶液，其特征在于，所述还原剂为维生素C。
6.根据权利要求1所述的复合酶溶液，其特征在于，所述电解质盐为谷氨酸盐。
7.根据权利要求1所述的复合酶溶液，其特征在于，所述电子媒介溶液C包括：电子媒介体5-20mg/mL、多糖5-20mg/mL、聚甘油脂肪酸脂5-20mg/mL、木糖醇5-20mg/mL、烷基酚聚氧乙烯醚0.1-1mg/mL、稳定剂0.5-2mg/mL和缓冲溶液5-20mg/mL。
8.根据权利要求1所述的复合酶溶液，其特征在于，所述多糖包括葡聚糖、海藻糖、甘露醇、山梨醇、蔗糖或纤维素中的任意一种或至少两种的组合。
9.根据权利要求8所述的复合酶溶液，其特征在于，所述多糖为葡聚糖。
10.根据权利要求1所述的复合酶溶液，其特征在于，所述烷基酚聚氧乙烯醚包括壬基酚聚氧乙烯醚、辛基酚聚氧乙烯醚、十二烷基聚氧乙烯醚或二壬基酚聚氧乙烯醚中的任意一种或至少两种的组合。
11.根据权利要求10所述的复合酶溶液，其特征在于，所述烷基酚聚氧乙烯醚为壬基酚聚氧乙烯醚。
12.根据权利要求11所述的复合酶溶液，其特征在于，所述壬基酚聚氧乙烯醚的EO数为8-12。
13.根据权利要求1所述的复合酶溶液，其特征在于，所述稳定剂包括辛酸盐、辛酸、乙酸或乙酸盐中的任意一种或至少两种的组合。
14.根据权利要求13所述的复合酶溶液，其特征在于，所述稳定剂为辛酸盐。
15.根据权利要求1所述的复合酶溶液，其特征在于，所述缓冲溶液为PBS缓冲液，所述PBS缓冲液的pH为7-9。
16.根据权利要求1-15中任一项所述的复合酶溶液在制备酒精检测试纸中的应用。
17.一种酒精检测试纸，其特征在于，所述酒精检测试纸包括依次层叠的PET基板、导电银层、导电碳层、绝缘涂层、酶涂层、双面胶层和亲水膜层，所述酶涂层为权利要求1-15中任一项所述的复合酶溶液干燥形成的酶涂层。
18.根据权利要求17所述的酒精检测试纸的制备方法，其特征在于，所述酒精检测试纸的制备方法为：利用丝网印刷的方法在PET基板上依次印刷银油墨、碳油墨和绝缘油墨，形成导电银层、导电碳层和绝缘涂层后，涂覆如权利要求1-15中任一项所述的复合酶溶液烘干形成酶涂层，再依次贴敷双面胶和亲水膜，最后滚压成形、冲切，得到所述酒精检测试纸。
19.根据权利要求18所述的酒精检测试纸的制备方法，其特征在于，所述烘干的温度为60-70℃，所述烘干的时间为10-20min。
20.根据权利要求17所述的酒精检测试纸在定量检测血液或唾液酒精含量中的应用。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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DE3934299C1 (zh) * 1989-10-13 1990-10-25 Gesellschaft Fuer Biotechnologische Forschung Mbh (Gbf), 3300 Braunschweig, De
US6656702B1 (en) * 1998-07-03 2003-12-02 Matsushita Electric Industrial Co., Ltd. Biosensor containing glucose dehydrogenase
CN1710418A (zh) * 2004-06-17 2005-12-21 中国科学院电子学研究所 一种快速检测血红蛋白的生物传感器及其测试方法
CN107177582B (zh) * 2016-02-16 2018-05-22 上海青瑞食品科技有限公司 一种液体酶制剂及制备方法
CN107727708B (zh) * 2017-11-13 2019-11-29 民康医疗科技（天津）有限公司 一种生物传感器及其制造方法
CN109576255B (zh) * 2018-12-19 2022-07-26 广州医科大学 一种酶的防腐剂及其使用方法
CN111024959A (zh) * 2019-12-20 2020-04-17 深圳市蔚景生物科技有限公司 一种稳定的蛋白质溶液、其制备方法及检测试剂盒

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