CN111856043A - 一种凝血酶原时间检测试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及凝血酶原时间检测技术领域,尤其涉及一种凝血酶原时间检测试剂盒,包括液体型PT试剂和冻干型PT试剂,所述液体型PT试剂和冻干型PT试剂均包括兔脑粉提取物、葡萄糖酸钙、防腐剂、抗凝物质和缓冲液A,兔脑粉提取物包括复合磷脂和组织因子脱辅基蛋白,复合磷脂由磷脂酰丝氨酸和磷脂酰胆碱混合组成。本发明不仅能够大幅度提高该试剂对可能存在的外源性的凝血途径的抑制效果,提高检测的准确性,而且还能抑制微生物的繁殖,延长该试剂的保质期限,另外,还能降低静脉血的凝血概率,提高待测血浆的纯度。
Description
技术领域
本发明涉及凝血酶原时间检测技术领域,尤其涉及一种凝血酶原时间检测试剂盒。
背景技术
凝血酶原时间(Prothrombin time,PT)是指在缺乏血小板的血浆中加入过量的组织凝血活酶和钙离子,凝血酶原转化为凝血酶,导致血浆凝固所需的时间。凝血酶原时间是反映血浆中凝血因子Ⅰ、Ⅱ、Ⅴ、Ⅶ、Ⅹ活性的指标。凝血酶原时间测定是检查机体外源性凝血系统功能有无障碍的过筛试验,也是临床抗凝治疗的重要监测指标。
凝血酶原时间检测原理是在向待检血浆中加入过量的含钙组织凝血活酶后,重新钙化的血浆在组织因子存在时激活因子X成为Xa,后者使凝血酶原转变为凝血酶,凝血酶使纤维蛋白原转变为不溶性的纤维蛋白,测定血浆开始凝固所需时间,即为待检血浆的凝血酶原时间(PT)。
在PT试剂的使用过程中,存在有外源性的凝血途径,这些对凝血原时间的检测过程都存在着较大的影响,且现有PT试剂中所加入的防腐剂的抑菌效果不佳,保质期限较短,另外,在对静脉血进行提取上层血浆的过程中,虽然会将其进行离心分离,但是其中仍会存在凝血块,影响待检血浆的提取工作。
发明内容
本发明的目的是为了解决现有技术中存在的缺点,而提出的一种凝血酶原时间检测试剂盒。
为了实现上述目的,本发明采用了如下技术方案:
一种凝血酶原时间检测试剂盒,包括液体型PT试剂和冻干型PT 试剂,所述液体型PT试剂和冻干型PT试剂均包括兔脑粉提取物、葡萄糖酸钙、防腐剂、抗凝物质和缓冲液A,兔脑粉提取物包括复合磷脂和组织因子脱辅基蛋白,复合磷脂由磷脂酰丝氨酸和磷脂酰胆碱混合组成。
优选的,所述抗凝物质为TFPI。
优选的,所述缓冲液A为磷酸盐缓冲溶液,磷酸盐缓冲溶液的成分为磷酸二氢钾。
优选的,所述防腐剂为ε一聚赖氨酸和溶菌酶按1:1混合而成的混合溶剂。
一种凝血酶原时间检测试剂盒的检测方法,包括以下步骤:
S1、制备待测血浆:取新鲜待测静脉血,与枸橼酸钠迅速混匀,并加入缓冲液B混匀后放入低温离心机内,以3000r/min的转速离心 15min,并用塑料移液管取上层血浆作为待检血浆;
S2、PT试剂预备:液体型PT试剂在使用前37℃预热5分钟并将其摇匀;冻干型PT试剂在使用前,按瓶签标示量加蒸馏水溶解,轻轻摇动使其成为均匀的PT工作液,PT工作液在使用前37℃预热5分钟并摇匀;
S3、PT检测:取待检血浆50μl,37℃温育3min,加入37℃预温PT试剂100μl,记录凝固时间,重复2-3次,取其平均值,即PT 值,并计算出凝血酶原时间比值PTR。
优选的,所述S1中缓冲液B的制备方法为:取枸橼酸4.2g,加 1mol/L的20%乙醇制氢氧化钠溶液40mL,使其溶解后再加入20%的乙醇稀释到100mL。
优选的,所述S3中凝血酶原时间比值PTR等于待测血浆的凝血酶原时间/正常参比血浆的凝血酶原复时间。
优选的,所述S1中采血过程所使用的器具为一次性塑料器具或硅化玻璃器具。
优选的,所述S1中枸橼酸钠的浓度为0.109mol/L,且静脉血与枸橼酸钠的混合体积比为9:1。
本发明的有益效果是:
1、在PT试剂中加入TFPI,其对外源性的凝血途径有着抑制作用,能够大幅度提高该试剂对可能存在的外源性的凝血途径的抑制效果。
2、在PT试剂中加入由ε一聚赖氨酸和溶菌酶混合而成的防腐剂,不仅具有良好的杀菌能力和稳定性,而且二者配合使用后,能使溶菌酶对ε一聚赖氨酸较弱的乳化能力进行弥补,并且还能抑制微生物的繁殖,延长该试剂的保质期限。
3、在提取待检血浆的过程中,向新鲜的静脉血中加入由枸橼酸制备而成的缓冲液B,使其对静脉血起到抑制凝血的作用,降低静脉血的凝血概率。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例,对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述,显然,所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例,而不是全部的实施例。
实施例一:
一种凝血酶原时间检测试剂盒,包括液体型PT试剂和冻干型PT 试剂,所述液体型PT试剂和冻干型PT试剂均包括兔脑粉提取物、葡萄糖酸钙、防腐剂、抗凝物质和缓冲液A,兔脑粉提取物包括复合磷脂和组织因子脱辅基蛋白,复合磷脂由磷脂酰丝氨酸和磷脂酰胆碱混合组成。
其中,抗凝物质为TFPI,缓冲液A为磷酸盐缓冲溶液,磷酸盐缓冲溶液的成分为磷酸二氢钾,防腐剂为ε一聚赖氨酸和溶菌酶按 1:1混合而成的混合溶剂。
该试剂盒的检测方法包括以下步骤:
S1、制备待测血浆:取新鲜待测静脉血(采血过程所使用的器具为一次性塑料器具),与0.109mol/L的枸橼酸钠按9:1的体积比迅速混匀,并加入缓冲液B混匀后放入低温离心机内,以3000r/min的转速离心15min,并用塑料移液管取上层血浆作为待检血浆;
S2、PT试剂预备:液体型PT试剂在使用前37℃预热5分钟并将其摇匀;冻干型PT试剂在使用前,按瓶签标示量加蒸馏水溶解,轻轻摇动使其成为均匀的PT工作液,PT工作液在使用前37℃预热5分钟并摇匀;
对比例一(PT试剂中不加入抗凝物质):
一种凝血酶原时间检测试剂盒,包括液体型PT试剂和冻干型PT 试剂,所述液体型PT试剂和冻干型PT试剂均包括兔脑粉提取物、葡萄糖酸钙、防腐剂和缓冲液A,兔脑粉提取物包括复合磷脂和组织因子脱辅基蛋白,复合磷脂由磷脂酰丝氨酸和磷脂酰胆碱混合组成。
其中,缓冲液A为磷酸盐缓冲溶液,磷酸盐缓冲溶液的成分为磷酸二氢钾,防腐剂为ε一聚赖氨酸和溶菌酶按1:1混合而成的混合溶剂。
该试剂盒的检测方法包括以下步骤:
S1、制备待测血浆:取新鲜待测静脉血(采血过程所使用的器具为一次性塑料器具),与0.109mol/L的枸橼酸钠按9:1的体积比迅速混匀,并加入缓冲液B混匀后放入低温离心机内,以3000r/min的转速离心15min,并用塑料移液管取上层血浆作为待检血浆;
S2、PT试剂预备:液体型PT试剂在使用前37℃预热5分钟并将其摇匀;冻干型PT试剂在使用前,按瓶签标示量加蒸馏水溶解,轻轻摇动使其成为均匀的PT工作液,PT工作液在使用前37℃预热5分钟并摇匀;
取实施例一和对比例一的PT试剂,其最后的PT值(PT值参考区间10.7s~14.3s)的数据如下表所示:
实施例一 | 对比例一 | |
TFPI | √ | × |
PT值 | 11.8s | 8.7s |
由上表可知,在加入了抗凝物质的实施例一,其PT值刚好位于正常区间内,而并未加入抗凝物质的对比例一,其PT值小于正常区间的最小值,且远小于该正常区间的最小值,可知,抗凝物质对PT 试剂在试验过程中存在有一定的环境因素抑制作用,说明,实施例一的凝血酶原时间(PT)测定试剂的凝血情况优于对比例一的试剂。
对比例二(防腐剂的成分仅有ε一聚赖氨酸):
一种凝血酶原时间检测试剂盒,包括液体型PT试剂和冻干型PT 试剂,所述液体型PT试剂和冻干型PT试剂均包括有兔脑粉提取物、葡萄糖酸钙、防腐剂、抗凝物质和缓冲液A,兔脑粉提取物包括复合磷脂和组织因子脱辅基蛋白,复合磷脂由磷脂酰丝氨酸和磷脂酰胆碱混合组成。
其中,抗凝物质为TFPI,缓冲液A为磷酸盐缓冲溶液,磷酸盐缓冲溶液的成分为磷酸二氢钾,防腐剂的成分为ε一聚赖氨酸。
该试剂盒的检测方法包括以下步骤:
S1、制备待测血浆:取新鲜待测静脉血(采血过程所使用的器具为一次性塑料器具),与0.109mol/L的枸橼酸钠按9:1的体积比迅速混匀,并加入缓冲液B混匀后放入低温离心机内,以3000r/min的转速离心15min,并用塑料移液管取上层血浆作为待检血浆;
S2、PT试剂预备:液体型PT试剂在使用前37℃预热5分钟并将其摇匀;冻干型PT试剂在使用前,按瓶签标示量加蒸馏水溶解,轻轻摇动使其成为均匀的PT工作液,PT工作液在使用前37℃预热5分钟并摇匀;
对比例三(防腐剂的成分仅有溶菌酶):
一种凝血酶原时间检测试剂盒,包括液体型PT试剂和冻干型PT 试剂,所述液体型PT试剂和冻干型PT试剂均包括有兔脑粉提取物、葡萄糖酸钙、防腐剂、抗凝物质和缓冲液A,兔脑粉提取物包括复合磷脂和组织因子脱辅基蛋白,复合磷脂由磷脂酰丝氨酸和磷脂酰胆碱混合组成。
其中,抗凝物质为TFPI,缓冲液A为磷酸盐缓冲溶液,磷酸盐缓冲溶液的成分为磷酸二氢钾,防腐剂的成分为溶菌酶。
该试剂盒的检测方法包括以下步骤:
S1、制备待测血浆:取新鲜待测静脉血(采血过程所使用的器具为一次性塑料器具),与0.109mol/L的枸橼酸钠按9:1的体积比迅速混匀,并加入缓冲液B混匀后放入低温离心机内,以3000r/min的转速离心15min,并用塑料移液管取上层血浆作为待检血浆;
S2、PT试剂预备:液体型PT试剂在使用前37℃预热5分钟并将其摇匀;冻干型PT试剂在使用前,按瓶签标示量加蒸馏水溶解,轻轻摇动使其成为均匀的PT工作液,再使PT工作液在使用前37℃预热5分钟并摇匀;
对比例四(防腐剂为现有的山梨酸钾和对羟基苯甲酸甲酯混合剂):
一种凝血酶原时间检测试剂盒,包括液体型PT试剂和冻干型PT 试剂,所述液体型PT试剂和冻干型PT试剂均包括有兔脑粉提取物、葡萄糖酸钙、防腐剂、抗凝物质和缓冲液A,兔脑粉提取物包括复合磷脂和组织因子脱辅基蛋白,复合磷脂由磷脂酰丝氨酸和磷脂酰胆碱混合组成。
其中,抗凝物质为TFPI,缓冲液A为磷酸盐缓冲溶液,磷酸盐缓冲溶液的成分为磷酸二氢钾,防腐剂的成分为山梨酸钾和对羟基苯甲酸甲酯。
该试剂盒的检测方法包括以下步骤:
S1、制备待测血浆:取新鲜待测静脉血(采血过程所使用的器具为一次性塑料器具),与0.109mol/L的枸橼酸钠按9:1的体积比迅速混匀,并加入缓冲液B混匀后放入低温离心机内,以3000r/min的转速离心15min,并用塑料移液管取上层血浆作为待检血浆;
S2、PT试剂预备:液体型PT试剂在使用前37℃预热5分钟并将其摇匀;冻干型PT试剂在使用前,按瓶签标示量加蒸馏水溶解,轻轻摇动使其成为均匀的PT工作液,PT工作液在使用前37℃预热5分钟并摇匀;
取实施例一、对比例二~对比例四的PT试剂,分别开瓶后于2~ 8℃冷藏储存,第0、3、7、10、13、15天,取同一批正常凝血质控品,用开瓶后的试剂进行PT测试,凝血酶原时间(PT)的稳定性测试结果如下表所示(单位:s):
从上表可以看出,实施例的试剂开瓶30天后的偏差均在10%左右,而对比例二~对比例四中的试剂于同样条件下开瓶30天后的偏差已超过12%,说明实施例一的凝血酶原时间(PT)测定试剂开瓶稳定性显著优于对比例的试剂。
对比例五(制备待检血浆时不向血浆中加入缓冲液B):
在制备待测血浆的过程中:取新鲜待测静脉血,与0.109mol/L 的枸橼酸钠按9:1的体积比迅速混匀,并放入低温离心机内,以 3000r/min的转速离心15min,并用塑料移液管取上层血浆作为待检血浆。
取实施例一中S1和对比例五中离心后的血浆液,对其进行紫外- 可见分光光度法检测,采用紫外-可见分光光度计进行操作5次,其检测结果中透光率T(单位:%)的数据如下表所示:
第1次 | 第2次 | 第3次 | 第4次 | 第5次 | |
实施例一 | 10.1% | 10.3% | 10.4% | 10.3% | 10.2% |
对比例五 | 9.7% | 9.5% | 9.9% | 10.0% | 9.8% |
从上表可以看出,实施例一的血浆的透光率的百分比都较大于对比例五的透光率的百分比,说明对比例五中存在着使血浆产生浑浊现象的凝块,而实施例一中加入缓冲液B对血浆的离心操作存在着好处,能够降低血浆中凝块的现象,提高其透光性。
综上所述,本发明中的凝血酶原时间(PT)检测试剂中不仅能够大幅度提高该试剂对可能存在的外源性的凝血途径的抑制效果,提高检测的准确性,而且还能抑制微生物的繁殖,延长该试剂的保质期限,另外,还能降低静脉血的凝血概率,提高待测血浆的纯度。
以上所述,仅为本发明较佳的具体实施方式,但本发明的保护范围并不局限于此,任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内,根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变,都应涵盖在本发明的保护范围之内。
Claims (9)
1.一种凝血酶原时间检测试剂盒,包括液体型PT试剂和冻干型PT试剂,其特征在于,所述液体型PT试剂和冻干型PT试剂均包括兔脑粉提取物、葡萄糖酸钙、防腐剂、抗凝物质和缓冲液A,兔脑粉提取物包括复合磷脂和组织因子脱辅基蛋白,复合磷脂由磷脂酰丝氨酸和磷脂酰胆碱混合组成。
2.根据权利要求1所述的一种凝血酶原时间检测试剂盒,其特征在于,所述抗凝物质为TFPI。
3.根据权利要求1所述的一种凝血酶原时间检测试剂盒,其特征在于,所述缓冲液A为磷酸盐缓冲溶液,磷酸盐缓冲溶液的成分为磷酸二氢钾。
4.根据权利要求1所述的一种凝血酶原时间检测试剂盒,其特征在于,所述防腐剂为ε一聚赖氨酸和溶菌酶按1:1混合而成的混合溶剂。
5.一种凝血酶原时间检测试剂盒的检测方法,其特征在于,包括以下步骤:
S1、制备待测血浆:取新鲜待测静脉血,与枸橼酸钠迅速混匀,并加入缓冲液B混匀后放入低温离心机内,以3000r/min的转速离心15min,并用塑料移液管取上层血浆作为待检血浆;
S2、PT试剂预备:液体型PT试剂在使用前37℃预热5分钟并将其摇匀;冻干型PT试剂在使用前,按瓶签标示量加蒸馏水溶解,轻轻摇动使其成为均匀的PT工作液,PT工作液在使用前37℃预热5分钟并摇匀;
S3、PT检测:取待检血浆50μl,37℃温育3min,加入37℃预温PT试剂100μl,记录凝固时间,重复2-3次,取其平均值,即PT值,并计算出凝血酶原时间比值PTR。
6.根据权利要求5所述的一种凝血酶原时间检测试剂盒的检测方法,其特征在于,所述S1中缓冲液B的制备方法为:取枸橼酸4.2g,加1mol/L的20%乙醇制氢氧化钠溶液40mL,使其溶解后再加入20%的乙醇稀释到100mL。
7.根据权利要求5所述的一种凝血酶原时间检测试剂盒的检测方法,其特征在于,所述S3中凝血酶原时间比值PTR等于待测血浆的凝血酶原时间/正常参比血浆的凝血酶原复时间。
8.根据权利要求5所述的一种凝血酶原时间检测试剂盒的检测方法,其特征在于,所述S1中采血过程所使用的器具为一次性塑料器具或硅化玻璃器具。
9.根据权利要求5所述的一种凝血酶原时间检测试剂盒的检测方法,其特征在于,所述S1中枸橼酸钠的浓度为0.109mol/L,且静脉血与枸橼酸钠的混合体积比为9:1。
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