CN110470849A - 一种用于凝血检测的异常值质控品及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于凝血检测的异常值质控品及其制备方法。该异常值质控品包括正常血浆、稳定剂溶液和香草酸，正常血浆与稳定剂溶液的体积比为5～8:3～6，香草酸的终质量浓度为0.5～1.5％。该异常值质控品的制备方法为：正常血浆的制备、血浆混合物的制备和用于凝血检测的异常值质控品的制备。本发明的技术方案取得的有益效果为：(1)血浆异常值质控品适应性强，能够用于PT和APTT的检测；(2)制备方法简单，易于操作；(3)稳定性良好，2～8℃下可保存18个月。

Description

一种用于凝血检测的异常值质控品及其制备方法

技术领域

本发明涉及凝血检验技术领域，更具体地说是涉及一种用于凝血检测的异常值质控品及其制备方法。

背景技术

APTT(活化部分凝血活酶时间)和PT(凝血酶原时间)为常用的凝血功能检查项目。其中，APTT主要用于内源性凝血途径异常的评估，测定因子II、V、X等的缺陷，用于诊断凝血性疾病、出血和血栓性疾病的治疗监测；PT通过适量的磷脂化的组织因子和钙离子触发凝血过程，用于分析凝血因子II、V、VII、X的活性。

在临床实践中，这些项目的检验结果常出现与临床表现不相符和不能解释的现象，因此，在凝血检测时严格作好各项室内质控，确保各项检测结果的正确性和可靠性，对于疾病的诊断和治疗具有重要的临床意义。

在凝血功能检验方面，目前市场上的凝血质控品主要为进口，并以西门子质控品为主，但是其价格昂贵，开发国内质控品非常重要。

利用正常血浆制备异常值质控品，是获取异常值质控品的方式之一。王希平等将正常血浆在37℃水浴箱中热浴，每隔一定时间检测血浆的APTT和PT值，直到检测值达到异常值质控品要求。理论上，该方法利用了温度和时间对凝血过程的影响，因为存放温度和时间不同，对凝血因子的影响不同，即存放温度和时间会导致血浆的某些凝血因子失活或消失，从而制备出异常值质控。但是存放温度和时间对凝血因子失活的影响情况不确定，不易量化处理，该制备方法不易控制，不适宜工业化生产。利用正常血浆制备异常值质控的另一种方式，是去除正常血浆中的某些凝血因子，从而制备异常值血浆。在US 2007/0203330 A1中，提出了一种缺乏因子I血浆的制备方式，基本方法是在低pH值(5.4)以下使血浆沉淀，然后再分离沉淀物。Peter Turecek(US5891843)提出在血浆中加入2％的氢氧化铝凝胶，经5000rpm离心去除沉淀后，制备出异常质控血浆。但是，去除或使血浆中某些凝血因子失活以制备异常值质控，所得质控品的适应性不理想，譬如一种血浆在PT检测时表现为异常值，而在APTT检测时则表现为正常值。对正常血浆做稀释，是制备异常血浆的方法之一，但是，在临床上，由于病人血浆的多样性和复杂性，不同类型的异常血浆会有检测值的差异。

制备异常值质控的其它一种方式，是在血浆中添加抑肽酶或抑制剂。M.Brozovic等将病人血浆与含有HEPES、柠檬酸三钠、抑肽酶按一定比例混合，经蒸馏水稀释后制备质控血浆，但Roberts P.S等研究发现，含有HEPES的血浆会导致凝血时间缩短而并非延长。Hunt R.J提出在制备的正常混合血浆(人+兔血浆)中，加入肝素和苯甲脒，以制备不同级别的异常质控血浆。但我们的实验结果表明，肝素作为一种抗凝剂，虽然具有抗凝的效果，但当血浆中分布量较低(譬如0.5％以下)时，对PT的影响有限；而当分布量高于0.1％时，会显著影响APTT值。其次，加入抑肽酶或苯甲脒等抑制剂，由于凝血检测的原理不同(譬如APTT为内源凝血机制；PT为外源凝血机制)，对不同项的检测也有所不同。

另外，在现有技术中，为了提高质控品的贮存时间，常采用冻干处理的方法，但是，质控品在冷冻干燥的过程中极易造成损伤，并且在复溶使用时，容易造成瓶间差异，稳定性能差。

因此，提供一种制备方法简单、适应性强的凝血检测异常值质控品是本领域技术人员亟需解决的问题。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种制备方法简单、适应性强的凝血检测异常值质控品。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种用于凝血检测的异常值质控品，包括如下组分：正常血浆、稳定剂溶液和香草酸；

PT主要反映外源性凝血系统，APTT主要反映内源性凝血系统，香草酸通过内、外凝血系统和共同凝血途径以实现凝血作用。

所述正常血浆与所述稳定剂溶液的体积比为(5～8):(3～6)，并且所述香草酸的终质量浓度为0.5～1.5％。

通过控制香草酸的加入量，使其具有良好的适应性。

优选的，所述正常血浆与所述稳定剂溶液的体积比为7:3；所述香草酸的终质量浓度为0.5％。

优选的，所述正常血浆为人源血浆。

人源血浆和动物源血浆在胆固醇及其脂蛋白组成方面有很大的差别，本发明选用人源血浆做正常血浆，避免了质控品与检测样品之间由于血浆组成不同而造成的差异，使检测结果更加准确，更具实际意义。

所述稳定剂溶液为质量浓度为35mM的羟乙基哌嗪乙磺酸溶液或咪唑溶液的任意一种。

羟乙基哌嗪乙磺酸溶液和咪唑溶液，其缓冲范围符合本发明质控品的pH值范围，且其不易与血浆中的金属离子形成沉淀，不对血浆中的活性物质造成影响，不影响后续生物化学反应过程。

优选的，所述异常值质控品的pH值为6.6～7.4。

pH值维持在6.6～7.4，符合人血浆的酸碱波动。

通过稳定剂的加入以及将其pH值维持在特定范围，使异常值质控品有良好的稳定性，2～8℃可保存18个月。

一种用于凝血检测的异常值质控品的制备方法，包括如下步骤：

(1)正常血浆的制备：将新鲜人源血液与浓度为0.11mol/L的枸橼酸钠混合，且新鲜人源血浆与枸橼酸溶液的体积比为9:1，混合均匀后离心取上清液得正常人源血浆；

(2)血浆混合物的制备：向所述正常人源血浆中加入适量的稳定剂溶液，并用NaOH溶液调节pH值至6.6～7.4，即得血浆混合物；

(3)异常值质控品的制备：向所述血浆混合物中加入适量的香草酸，即制得异常值质控品。

向血浆中先加入稳定剂溶液有利于营造稳定的pH值范围，为质控品的制备提供稳定的环境。

一种用于凝血检测的异常值质控品在PT和APTT检测中的应用。

经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明取得的有益效果为：(1)血浆异常值质控品适应性强，能够用于PT和APTT的检测；(2)制备方法简单，易于操作；(3)稳定性良好，2～8℃下可保存18个月。

具体实施方式

下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1不同香草酸加入量对APTT检测结果的影响

(1)将900g新鲜血液和100g 0.11mol/L的枸橼酸钠混合。在室温下，按1500Xg离心15分钟，得到正常血浆；

(2)在所得正常血浆中，加入35mM的HEPES溶液，血浆与HEPES溶液的体积比为7:3，并用0.5M的NaOH调节血浆的pH值至7.3，得到血浆混合物；

(3)以步骤(1)制备的正常血浆作为对照组，实验组加入不同质量的香草酸使其终质量浓度分别为0.05％、0.1％、0.5％、1.0％和1.5％；

(4)使用西门子凝血试剂以及与试剂配套的CA7000血凝仪，测定实验组和对照组血浆的APTT值。

实验结果如表1所示。

表1香草酸不同加入量对APTT检测结果的影响

如表1所示，在正常血浆中添加香草酸后，血浆的APTT值随香草酸加入量的增加而增加。在CA7000机型上，正常血浆APTT范围为22-31s之间，而加入香草酸后，APTT值增加，当加入量达到0.1％或以上时，APTT明显增加，这说明在正常血浆中加入香草酸后，可导致血浆的APTT值异常。

实施例2不同香草酸加入量对PT检测结果的影响

(1)将900g新鲜血液和100g 0.11mol/L的枸橼酸钠混合。在室温下，按1500Xg离心15分钟，得到正常血浆；

(2)在所得正常血浆中，加入35mM的HEPES溶液，血浆与HEPES溶液的体积比为7:3，并用0.5M的NaOH调节血浆的pH值至7.3，得到血浆混合物；

(3)以步骤(1)制备的正常血浆作为对照组，实验组加入不同质量的香草酸使其终质量浓度分别为0.05％、0.1％、0.5％、1.0％和1.5％；

(4)使用西门子凝血试剂以及与试剂配套的CA7000血凝仪，测定实验组和对照组血浆的PT值。

实验结果如表2所示。

表2香草酸不同加入量对PT检测结果的影响

如表2所示，在正常血浆中添加香草酸后，血浆的PT值随香草酸加入量的增加而增加。在CA7000机型上，正常血浆PT范围为10-12.2s之间，而加入香草酸后，PT值增加，当加入量达到0.05％或以上时，PT明显增加，这说明在正常血浆中加入香草酸后，可导致血浆的PT值异常。

实验1稳定性实验

(1)将900g新鲜血液和100g 0.11mol/L的枸橼酸钠混合。在室温下，按1500Xg离心15分钟，得到正常血浆；

(2)在所得正常血浆中，加入35mM的HEPES溶液，血浆与HEPES溶液的体积比为7:3，并用0.5M的NaOH调节血浆的pH值至7.3，得到血浆混合物；

(3)向血浆混合物中加入香草酸使其终质量浓度为0.5％，即制得异常值质控品。

(4)将异常值质控品分别置于2℃和8℃下保存，分别于3个月、6个月、9个月、12个月、15个月和18个月检测其PT和APTT，检测结果如表3、表4所示所示。

表3 2℃下稳定性实验

储存时间(月)	PT(s)	APTT(s)
			0	39.1	50.2
3	39.4	50.0
			6	38.8	50.4
9	39.2	49.8
			12	39.5	50.2
15	39.4	49.7
			18	38.8	50.3

表4 8℃下稳定性实验

储存时间(月)	PT(s)	APTT(s)
			0	39.1	50.2
3	39.2	50.1
			6	39.0	50.3
9	38.9	50.0
			12	39.4	49.6
15	39.5	50.2
			18	39.4	49.5

由表3、表4结果可知，本发明制备的用于凝血检测的异常值质控品无需冷冻干燥处理，在18个月内其PT和APTT的检测结果稳定，长期稳定性较好。

实验2与西门子质控品检测结果对比

(1)将900g新鲜血液和100g 0.11mol/L的枸橼酸钠混合。在室温下，按1500Xg离心15分钟，得到正常血浆；

(2)在所得正常血浆中，加入35mM的HEPES溶液，血浆与HEPES溶液的体积比为7:3，并用0.5M的NaOH调节血浆的pH值至7.3，得到血浆混合物中；

(3)向血浆混合物中加入香草酸使其终质量浓度为0.5％，即制得异常值质控品。

(4)将步骤(3)制得的异常值质控品与西门子异常值质控品，分别测定其PT和APTT，测定结果如表5所示。

表5与西门子质控品

	PT(s)	APTT(s)
			本发明	38.8	50.0
西门子	39.3	49.5

由表5结果可知，本发明异常值质控品达到的效果和西门子相当。

本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。

本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

Claims (7)

1.一种用于凝血检测的异常值质控品，其特征在于，包括如下组分：正常血浆、稳定剂溶液和香草酸；

所述正常血浆与所述稳定剂溶液的体积比为(5～8):(3～6)，并且所述香草酸的终质量浓度为0.5～1.5％。

2.如权利要求1所述的一种用于凝血检测的异常值质控品，其特征在于，包括如下组分：正常血浆、稳定剂溶液和香草酸；

所述正常血浆与所述稳定剂溶液的体积比为7:3；

所述香草酸的终质量浓度为0.5％。

3.如权利要求1～2任一所述的一种用于凝血检测的异常值质控品，其特征在于，所述正常血浆为人源血浆。

4.如权利要求3所述的一种用于凝血检测的异常值质控品，其特征在于，所述稳定剂溶液为质量浓度为35mM的羟乙基哌嗪乙磺酸溶液或咪唑溶液的任意一种。

5.如权利要求4所述的一种用于凝血检测的异常值质控品，其特征在于，所述异常值质控品的pH值为6.6～7.4。

6.如权利要求1所述的一种用于凝血检测的异常值质控品的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)正常血浆的制备：将新鲜人源血液与浓度为0.11mol/L的枸橼酸钠混合，且新鲜人源血浆与枸橼酸溶液的体积比为9:1，混合均匀后离心取上清液得正常人源血浆；

(2)血浆混合物的制备：向所述正常人源血浆中加入适量的稳定剂溶液，并用NaOH溶液调节pH值至6.6～7.4，即得血浆混合物；

(3)异常值质控品的制备：向所述血浆混合物中加入适量的香草酸，即制得异常值质控品。

7.如权利要求1～5任一所述的一种用于凝血检测的异常值质控品在PT和APTT检测中的应用。