CN103163307A - 凝血质控品及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及临床凝血检验项目质量控制领域，具体提供了一种用动物血浆制备可同时用于PT、APTT、FIB凝血项目检验的质控品的方法。本发明方法是用动物血浆以适当比例混合，添加或去除纤维蛋白原，添加适量含有稳定剂的血浆缓冲液，使混合血浆PT、APTT、FIB检测结果均在正常人凝血指标内，进行冷冻干燥，即得。本发明方法制备的凝血质控品对检测试剂变化敏感性好，且具有较好的稳定性，满足临床凝血项目检验的质量控制要求。

Description

凝血质控品及其制备方法

技术领域

本发明涉及临床凝血检验项目质量控制领域，特别涉及一种用动物血浆制备可同时用于PT、APTT、FIB凝血项目检验的质控品的方法及制得的凝血质控品。

背景技术

哺乳动物血液凝固是一个复杂的生理生化代谢过程，其实质是通过一系列酶促反应，使血浆中呈液态的纤维蛋白原转变成固态的交联纤维蛋白，简称凝血。参与各链锁反应的多种物质称凝血因子，它们的化学本质，除钙离子外，绝大多数为蛋白质。凝血过程可分为凝血酶原激活物的形成、凝血酶原的激活和纤维蛋白的生成三个基本步骤。根据凝血酶原激活物形成的途径不同，血液凝固可分为内源性凝血和外源性凝血。不同的哺乳动物有相同种类的凝血因子并且有高度的同源性，但不同动物的凝血因子含量不同，导致凝血系统功能的检验项目的值有不同。

临床上对凝血系统功能的检验项目主要有：血浆凝血酶原时间（PT）、活化部分凝血活酶时间（APTT）、纤维蛋白原（FIB）和凝血酶时间（TT）等。其中PT主要是反映外源性凝血系统功能，APTT是内源性凝血因子缺乏最可靠的筛选试验，FIB是血浆中含量最高的凝血因子，参考范围是2.0-4.0g/L，过高或过低都影响凝血系统功能。

随着凝血检验项目不断拓展到疾病诊断和治疗中的各个领域，使用配套的凝血质控物对凝血检验进行室内质量控制也显得尤为重要。目前市场上主要的凝血质控商品多为进口产品，价格昂贵，并且大多数是来源于人血浆。也有国外专利报道利用动物来源的血浆制备凝血质控物，但其只是对PT、APTT两项凝血检测进行临床实验质量评估。因此，提供一种用动物血浆制备可同时用于PT、APTT、FIB凝血项目检验的质控品的方法及制得的凝血质控品具有现实意义。

发明内容

有鉴于此，本发明提供一种使用动物来源血浆制备凝血检测质控品的方法，所制备的凝血质控品PT、APTT、FIB三项凝血检验的值均在正常人凝血指标内，且具有较好的稳定性，可同时满足PT、APTT、FIB三项凝血检验的质量控制需求。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种凝血质控品的制备方法，包括以下步骤：

步骤1：混合动物血浆，获得第一混合血浆，使第一混合血浆中PT、APTT的检测结果在正常人凝血指标内；

步骤2：检测第一混合血浆的FIB值，

第一混合血浆的FIB值低于正常人指标范围，添加纤维蛋白原溶液，获得第二混合血浆；

第一混合血浆的FIB值高于正常人指标范围，通过冷沉淀血浆的方法去除第一混合血浆中纤维蛋白原，获得第三混合血浆；

使第二混合血浆或第三混合血浆的FIB值在正常人指标内；

步骤3：将步骤2获得的第二混合血浆或第三混合血浆添加含有稳定剂的血浆缓冲液，使得检测PT、APTT、FIB值均在正常人凝血指标内，冷冻干燥，即得凝血质控品。

本发明所指检测第一混合血浆的FIB值，如果第一混合血浆的FIB值低于正常人指标范围，添加纤维蛋白原溶液，获得第二混合血浆，使第二混合血浆的FIB值在正常人指标内；如果第一混合血浆的FIB值高于正常人指标范围，通过冷沉淀血浆的方法去除第一混合血浆中部分纤维蛋白原，获得第三混合血浆，使得第三混合血浆的FIB值在正常人指标内。其中，部分不做限定，只要使第三混合血浆的FIB值在正常人指标内即可。

上述制备方法中，步骤1中动物血浆为猪、牛、兔、羊、马、狗的血浆中的一种或两种以上的混合物。

本发明提供的凝血质控品的制备方法中，动物血浆的制备方法为用静脉或动脉穿刺采集动物血液，按血液与抗凝剂体积比为9:1的比例加入2～5%柠檬酸三钠抗凝剂，离心30分钟，相对离心力为2000～2500g，小心分离吸取上层血浆。

本发明选用动物血浆制备凝血质控品，动物来源血浆尤其是非灵长类动物，与人来源血浆相比，凝血因子更加稳定，且可消除感染AIDS或肝炎病毒的风险。不同动物血浆具有不同的水平凝血因子，PT、APTT具有不同的凝集时间，如：兔血浆PT值缩短，猪血浆APTT值缩短，但PT值不缩短，牛血浆PT和APTT值均延长，马血浆APTT值延长，但PT值不缩短。根据不同动物血浆的凝血特性，选择适当类型的动物血浆，并通过调节血浆混合比例，可将混合血浆PT、APTT检测结果控制在正常人凝血指标内，且具有良好的稳定性。

作为优选，上述混合血浆选择猪、牛、兔三种血浆混合，其中，正常人凝血指标为：PT检测值10～14秒，APTT检测值22～38秒。

上述制备方法中，步骤2中纤维蛋白原溶液的制备方法为：用醋酸调节动物血浆pH值至7.0～7.5，加入-15～-25℃的冷乙醇，使乙醇的终浓度为8%。将血浆以4500转/分离心15分钟，弃上清，向沉淀物中加入+2～+8℃生理盐水并颠倒容器洗涤沉淀，加入量为所述动物血浆体积两倍，再次以4500转/分离心15分钟，弃上清，向沉淀中加入所述动物血浆八分之一体积的生理盐水，37℃水浴5分钟，沉淀溶解，即得。

本发明提供的制备方法中，步骤2中纤维蛋白原溶液浓度为20～30g/L，添加体积小于所述第一混合血浆体积的10%。

本发明提供的制备方法中，步骤2中去除混合血浆中纤维蛋白原的方法为：取1/4～1/3的FIB值高于正常人指标范围的所述第一混合血浆以50mL/管分装，-20℃冷冻12～24小时，+2～+8℃条件下融化16小时，融化后以2000转/分离心15分钟，吸取上清液与余量的FIB高值血浆按体积比不超过40%进行混合，即得。

通过该冷沉淀方法可以除去血浆中40-70%的纤维蛋白原，纤维蛋白原大量减少，血浆凝血功能也发生变化。为保证获得的混合血浆PT、APTT、FIB值均在正常范围内，上清液与FIB高值血浆的混合体积比例不超过40%。

混合血浆FIB值在正常人指标内为2.0～4.0g/L。

本发明提供的制备方法中，步骤3中含稳定剂的血浆缓冲液为：三羟甲基氨基甲烷（Tris）10～30mM/L、叠氮钠0.5～2g/L、蔗糖10～30g/L、抑肽酶10000～100000KIU/L，盐酸调节pH值7.0～7.9。

本发明提供的制备方法中，步骤3中第二混合血浆或第三混合血浆与添加缓冲液的体积比为9:1。

本发明还提供了上述方法制备获得的凝血质控品。

本发明采取以上技术方案，与现有技术相比，具有以下优点：

1、本发明选用动物血浆为原料制备凝血质控品，原料成本低、来源充足、易于获得，且本发明制备工艺简单、添加剂和调制物数量少。

2、本发明方法制备的质控物可同时用于APTT、PT、FIB检测，使用成本低，提高质控物的利用率。

3、本发明方法制备的质控品对检测试剂变化更敏感，且冻干品复溶后稳定性更好，可替代进口产品用于凝血项目检测的质量控制，方便临床使用，节约使用试剂，降低检测成本。

具体实施方式

本发明公开了一种使用动物来源血浆制备凝血检测质控品的方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

本发明提供的使用动物来源血浆制备凝血检测质控品的方法中所用原料及试剂均可有市场购得。

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1 添加纤维蛋白原溶液制备凝血质控品

一、凝血质控品的制备

1、颈动脉采集兔、牛血液，前腔静脉采集猪血液。将采集的血液按与抗凝剂9:1的比例加入3.8%柠檬酸三钠抗凝剂。将加入抗凝剂的血液离心30分钟，相对离心力为2500g，小心分离吸取上层血浆。

2、含有稳定剂血浆缓冲液配制：Tris20mM/L，叠氮钠1g/L、蔗糖20g/L、抑肽酶80000KIU/L，盐酸调节pH值至7.5。

3、检测猪、牛、兔血浆的PT、APTT值，如表1所示。

表1 动物血浆PT、APTT值（单位：秒）

4、将74ml猪血浆、10ml牛血浆、16ml兔血浆混合，检测混合血浆PT、APTT值，结果均在正常人凝血指标内，如表2所示。

表2 混合动物血浆PT、APTT值（单位：秒）

5、检测步骤4动物混合血浆FIB值为1.92g/L。取96ml动物混合血浆，添加4ml FIB浓度为23.72g/L的牛纤维蛋白原溶液，再检测混合血浆FIB浓度为2.86g/L。

6、步骤5中的纤维蛋白原溶液，其制备方法为：用醋酸调节牛血浆pH值至7.4，加入-15～-25℃的冷乙醇，使乙醇的终浓度为8%。将血浆4500转/分，离心15分钟弃上清，向沉淀物中加入原血浆体积两倍量的+2～+8℃生理盐水并颠倒容器洗涤沉淀，再次4500转/分，离心15分钟弃上清取沉淀。向沉淀中加入原牛血浆八分之一体积的生理盐水，37℃水浴5分钟，沉淀溶解。溶液中含有大量的纤维蛋白原，经检测，FIB浓度为23.72g/L。

7、将添加纤维蛋白原溶液后的混合血浆按9：1的比例添加含有稳定剂的血浆缓冲液，经检测，该工作液PT为12.2s、APTT为24.5s、FIB浓度为2.55g/L，均在正常人凝血指标内。以1.0ml/瓶分装，冷冻干燥，获得凝血质控品。

二、凝血质控品试剂变化灵敏度比较

1、将上海太阳公司的PT试剂、APTT试剂、FIB试剂分别用蒸馏水进行系列稀释，得到浓度为：100%、80%、60%、40%、20%、10%的检测试剂。

2、取实施例1中制备的凝血质控品、市售凝血质控品（德国Siemens公司）和正常人新鲜血浆，在日本东亚CA1500全自动血凝仪上分别使用上述系列稀释PT、APTT试剂检测，检测结果见表3和表4所示。结果显示，PT、APTT检测试剂浓度从100%到10%，本发明凝血质控品检测结果变化范围更大，对试剂变化灵敏度更高，表明本发明质控品在对有缺陷试剂的监测具有更高的敏感度。

表3 PT试剂变异灵敏度检测（单位：秒）

表4 APTT试剂变异灵敏度检测（单位：秒）

3、取实施例1中制备的凝血质控品、正常人新鲜血浆，在日本东亚CA1500全自动血凝仪分别使用上述系列稀释FIB试剂检测，检测结果见表5所示。结果显示，本发明制备的凝血质控品与正常人新鲜血浆具有相同的试剂变化灵敏度。

表5 FIB试剂变异灵敏度检测（单位：g/L）

三、凝血质控品稳定性检测

1、开瓶稳定性检测：将实施例1中制备的凝血质控品准确复溶在室温（15～25℃）条件下保存，每天定时取样一次，检测PT、APTT、FIB。采用直线回归法分析质控物的稳定性，检验线性方程的斜率b与0有无显著性差异，如P＜0.05，说明分析物浓度随时间发生变化，如P＞0.05，说明分析物浓度在测定时间内基本稳定。检测结果如表6所示。

表6 开瓶稳定性检测结果

对检测数据进行线性回归，并对斜率b与0的显著性差异进行双侧t检验，查表可知α=0.05，ν=4，t_α(ν)=2.776，P值均大于0.05，表明本发明制备的凝血质控品复溶后在室温下储存5天，PT、APTT、FIB检测值基本不变。

一般市售来源于人的质控血浆开瓶复溶后室温下通常只能保存8小时，这充分证明动物血浆凝血因子比人血浆更加稳定。因此，本发明方法采用动物血浆制备的凝血质控品，具有更优越的稳定性，方便医院临床检验科对凝血项目检测的质控工作，且减少试剂浪费，节约检测成本。

2、长期稳定性检测：将实施例1中制备的凝血质控品冻干品在+2～+8℃条件下保存，每3个月取出一瓶准确复溶，检测PT、APTT、FIB，检测结果如表7所示。统计结果表明：本发明制备的凝血质控品冻干品在+2～+8℃保存36个月内较稳定，长期稳定性较好。

表7 长期稳定性检测结果

实施例2 去除部分纤维蛋白原制备凝血质控品

一、凝血质控品的制备

1、颈动脉采集兔、牛血液，前腔静脉采集猪血液。将采集的血液按与抗凝剂9:1的比例加入3.8%柠檬酸三钠抗凝剂，离心30分钟，相对离心力为2500g，小心分离吸取上层血浆。

2、含有稳定剂血浆缓冲液配制：Tris20mM/L，叠氮钠1g/L、蔗糖20g/L、抑肽酶80000KIU/L，盐酸调节pH值至7.5。

3、检测猪、牛、兔血浆的PT、APTT值，如表8所示。

表8 动物血浆PT、APTT值（单位：秒）

4、将146ml猪血浆、34ml牛血浆、20ml兔血浆混合，检测混合血浆PT、APTT值，结果均在正常人凝血指标内，如表9所示。

表9 混合动物血浆PT、APTT值（单位：秒）

5、检测步骤4动物混合血浆FIB值为4.20g/L，取50mL动物混合血浆，装入50mL离心管中，-20℃冷冻24小时，取出离心管放置于+2～+8℃冰箱内融化16小时。血浆融化后2000转/分，离心15分钟，吸取上清液，检测上清液FIB值为1.72g/L，取45mL上清液与135mL动物混合血浆进行混合，检测PT、APTT、FIB，结果如表10所示。

表10 混合动物血浆PT、APTT、FIB值

6、将混合血浆按9：1的比例添加含有稳定剂的血浆缓冲液，经检测，该工作液PT为12.5s、APTT为24.3s、FIB浓度为3.24g/L，均在正常人凝血指标内。以1.0ml/瓶分装，冷冻干燥，获得凝血质控品。

二、凝血质控品对试剂变化的灵敏度检测

1、将上海太阳公司的PT试剂、APTT试剂、FIB试剂分别用蒸馏水进行系列稀释，得到浓度为：100%、80%、60%、40%、20%、10%的检测试剂。

2、取实施例2中制备的凝血质控品，在日本东亚CA1500全自动血凝仪上分别使用上述系列稀释PT、APTT、FIB试剂检测，检测结果见表11所示。结果显示，本实施例制备的凝血质控品对试剂变化同样具有良好的灵敏度。

表11 质控品试剂变异灵敏度检测

三、开瓶稳定性检测

将实施例2中制备的凝血质控品准确复溶在室温（15～25℃）条件下保存，每天定时取样一次，检测PT、APTT、FIB，检测结果如表12所示。

表12 开瓶稳定性检测结果

采用直线回归法分析质控物的稳定性，P值也均大于0.05，表明本实施例制备的凝血质控品复溶后在室温下储存5天，PT、APTT、FIB检测值基本不变，也同样具有良好的开瓶稳定性。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (9)

1.一种凝血质控品的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤1：混合动物血浆，获得第一混合血浆，使所述第一混合血浆中PT、APTT的检测结果在正常人凝血指标内；

步骤2：检测所述第一混合血浆的FIB值，

所述第一混合血浆的FIB值低于正常人指标范围，添加纤维蛋白原溶液，获得第二混合血浆；

所述第一混合血浆的FIB值高于正常人指标范围，去除所述第一混合血浆中纤维蛋白原，获得第三混合血浆；

使所述第二混合血浆或所述第三混合血浆的FIB值在正常人指标内；

步骤3：将步骤2获得的所述第二混合血浆或所述第三混合血浆添加含有稳定剂的血浆缓冲液，使得检测PT、APTT、FIB值均在正常人凝血指标内，冷冻干燥，即得凝血质控品。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1中所述动物血浆为猪、牛、兔、羊、马、狗的血浆中的一种或两种以上的混合物。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述动物血浆的制备方法为用静脉或动脉穿刺采集动物血液，按血液与抗凝剂体积比为9:1的比例加入2～5%柠檬酸三钠抗凝剂，离心30分钟，相对离心力为2000～2500g，小心分离吸取上层血浆。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2中所述纤维蛋白原溶液的制备方法为：用醋酸调节动物血浆pH值至7.0～7.5，加入-15～-25℃的冷乙醇，使乙醇的终浓度为8%；将血浆以4500转/分离心15分钟，弃上清，向沉淀物中加入+2～+8℃生理盐水并颠倒容器洗涤沉淀，加入量为所述动物血浆体积两倍，再次以4500转/分离心15分钟，弃上清，向沉淀中加入所述动物血浆八分之一体积的生理盐水，37℃水浴5分钟，沉淀溶解，即得。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2中所述纤维蛋白原溶液浓度为20～30g/L，添加体积小于所述第一混合血浆体积的10%。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2中所述去除混合血浆中纤维蛋白原的方法为：取1/4～1/3的FIB值高于正常人指标范围的所述第一混合血浆以50mL/管分装，-20℃冷冻12～24小时，+2～+8℃条件下融化16小时，融化后以2000转/分离心15分钟，吸取上清液与余量的FIB高值血浆按体积比不超过40%进行混合，即得。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3中所述含稳定剂的血浆缓冲液为：三羟甲基氨基甲烷10～30mM/L、叠氮钠0.5～2g/L、蔗糖10～30g/L、抑肽酶10000～100000KIU/L，盐酸调节pH值7.0～7.9。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3中第二混合血浆或所述第三混合血浆与添加缓冲液的体积比为9:1。

9.根据权利要求1至8任一项所述的方法制备获得的凝血质控品。