CN102692516B - 狼疮抗凝物筛选测定试剂盒(凝固法) - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种稀释蝰蛇毒实验法筛选测定血浆中狼疮抗凝物的试剂。本发明LA筛选测定试剂包括蝰蛇毒凝血因子X激活剂、菜籽磷脂、钙离子。本发明以菜籽磷脂替代现有技术的动物脑磷脂，其最适添加量低，对狼疮抗凝物具有更高的专一性和敏感度。本发明所述LA筛选测定试剂具有特异性好、灵敏度高、稳定性强、检测可行度高的优点。

Description

狼疮抗凝物筛选测定试剂盒(凝固法)

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，特别涉及一种稀释蝰蛇毒试验法筛选测定血浆中狼疮抗凝物的试剂。

背景技术

狼疮抗凝物（Lupus anticoagulant，LA）是一种磷脂依赖性的病理性循环抗凝物质，在体外有抗凝血作用，而在体内能与磷脂作用产生促凝效果，促进血栓形成。现已发现它可存在于多种疾病中，该物质的持续存在被认为是不明原因的习惯性流产、死胎、胎儿发育迟滞、动静脉栓塞、各种易栓性疾病以及某些自身免疫性疾病的危险信号。因此，LA的筛选检测对临床各科疾病诊断具有重大意义。

近年来已发展了多种LA筛选方法，其中，应用最广的是凝固法。根据凝血途径的不同，凝固法筛选LA有三种途径：外源途径、内源途径和共用途径。

1.内源途径的LA筛选法：APTT、KCT和CSCT

APTT是常用的LA初筛实验，其灵敏度取决于试剂中磷脂的种类和浓度。不同厂家制备的APTT试剂因磷脂成分和浓度不同而导致实验的敏感性差异较大，如含磷脂酰丝氨酸量多的试剂会减低LA的检出率。

KCT试剂因含磷脂量较低而敏感性高，但白陶土试剂不能用于光学法的检测且易形成沉淀，此实验对凝血试验时间长的标本重复性差。

CSCT是在KCT试剂基础上改变了激活剂，将白陶土激活剂改为了澄清度高沉降度低的胶体。

APTT、KCT和CSCT检测都要求样品中的凝血因子含量正常，不能检测凝血因子缺乏的血浆是否含有LA。

2.外源途径的LA筛选方法：PT

当试剂中的磷脂浓度成为凝固限制速率因子时，PT法能较灵敏的检测LA的存在，磷脂的种类成为该试剂检测LA的关键；但是PT因为试剂中的促凝血酶原激酶的易变性而不是很适合检测LA。

3.共用途径的LA筛选方法：Textarin、Ecarin和dRVVT

基于蛇毒如Ecarin和Textarin的检测试剂，其激活剂来源是各种蛇毒中的促凝血酶。这些试剂中的激活剂不受内外源途径中凝血因子的影响，专一性强，可以用来检测抗磷脂抗体，如LA。但是Ecarin和Textarin检测方法还没有商业化的检测准则，不适合用于临床检测。

稀释蝰蛇毒实验法（dRVVT）以蝰蛇毒FⅩ激活剂与稀释的磷脂一起用于检测，“跳过”了内外源途径直接作用于凝血Ⅹ因子，具有很强的专一性和灵敏度。该检测方法经国际体外质量评估流程实验室证明，是最有力的LA检测方法。

dRVVT筛选试剂的关键在于其特异性和灵敏度，而磷脂的种类及浓度决定了dRVVT筛选试剂的特异性和灵敏度。现有技术选用的磷脂种类多采用动物脑磷脂，如牛脑磷脂、兔脑磷脂，往往会因其灵敏度不高降低狼疮抗凝物的检出率。

发明内容

针对上述现有技术的缺陷，本发明要解决的技术问题为提供一种灵敏度较高、特异性较好的稀释蝰蛇毒实验法筛选测定狼疮抗凝物的试剂。

为解决上述技术问题，本发明提供了一种狼疮抗凝物的筛选测定试剂，该试剂包括蝰蛇毒凝血因子X激活剂、菜籽磷脂、钙离子。

所述蝰蛇毒凝血因子X激活剂来自圆斑蝰蛇蛇毒，可以采用本领域的常规技术手段从圆斑蝰蛇蛇毒中提取获得，也可以从商业途径获得；该激活剂在筛选测定狼疮抗凝物时的工作浓度为2～5U/ml，优选工作浓度为3U/ml。

上述浓度单位中U的定义，1U为1ml所述凝血因子X激活剂溶液在37℃条件下与1ml正常人体质控血浆混合后加入1ml 0.025mol/L的氯化钙溶液能在50-70s内发生凝结的量。

所述菜籽磷脂，是从油菜籽中提取得到的一种混合物，主要成分为脑磷脂、丝氨酸磷脂和肌醇磷脂等，该菜籽磷脂可以由商业途径获得。所述菜籽磷脂在筛选测定狼疮抗凝物时的工作浓度为5～20μg/ml，优选工作浓度为10μg/ml。

所述钙离子的供体为氯化钙，所述氯化钙的工作浓度为12.5mM。

上述筛选测定试剂还包括缓冲液、肝素中和剂，选择性地包括稳定剂和防腐剂。

所述缓冲液为Tris-HCl缓冲液、咪唑缓冲液、磷酸或磷酸盐缓冲液、HEPES缓冲液、巴比妥缓冲液、硼酸缓冲液、甘氨酸-氢氧化钠缓冲液或MOPS缓冲液中的任意一种，优选浓度为50mM、pH值为7.3的咪唑缓冲液。

所述肝素中和剂为鱼精蛋白、多聚L-赖氨酸、凝聚胺或多聚L-精氨酸中的任意一种。

作为优选，所述肝素中和剂为凝聚胺，所述凝聚胺在筛选测定狼疮抗凝物时的工作浓度为1～10μg/ml，优选工作浓度为3μg/ml。

本发明所述LA筛选测定试剂中的稳定剂，选自本领域技术人员已知的适当稳定剂，如PEG-8000、牛血清白蛋白或氨基酸。

本发明所述LA筛选测定试剂中的防腐剂，选自本领域技术人员已知的适当防腐剂，如叠氮钠。

本发明的另一个目的在于提供一种狼疮抗凝物的筛选测定试剂盒，该试剂盒包括上述筛选测定试剂。

与现有LA筛选测定试剂相比，本发明LA筛选测定试剂具有以下优点：

（1）以植物磷脂——菜籽磷脂替代了现有技术的动物脑磷脂，其最适添加量低，对狼疮抗凝物具有更高的专一性和灵敏度，提高了临床检测的特异性和灵敏度。

（2）所用圆斑蝰蛇蛇毒凝血因子X激活剂，活性较高、专一性好、稳定性强，使得本发明LA筛选测定试剂具有较高的特异性和稳定性。

（3）包含肝素中和剂凝聚胺，对含肝素量在0-1.0U/ml的血浆仍然能够检测，抗干扰能力强。

（4）组成简单，操作方便，能够适应大多数半自动及全自动凝血分析仪。

具体实施方式

本发明公开了一种狼疮抗凝物的筛选测定试剂，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的LA筛选测定试剂已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的试剂和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明。

注：本实施例中蝰蛇毒凝血因子X激活剂来源于美国诊断公司（AmericanDiagnostica Icn.，Product No.545，Lot No.20/121C）；菜籽磷脂来源于郑州四维磷脂技术有限公司。

实施例1本发明LA筛选测定试剂的制备

试剂组成：

按以上组成常规配制而成。

实施例2本发明LA筛选测定试剂的制备

试剂组成：

按以上组成常规配制而成。

实施例3本发明LA筛选测定试剂的制备

试剂组成：

按以上组成常规配制而成。

实施例4本发明LA筛选测定试剂的制备

试剂组成：

按以上组成常规配制而成。

实施例5本发明LA筛选测定试剂筛选测定血浆中狼疮抗凝物的方法

1、检测原理：

凝血因子X激活剂直接激活凝血因子X成为凝血因子Xa，在磷脂和钙离子的参与下，纤维蛋白原转变成不溶性纤维蛋白，测定凝固所需要的时间，如果待测血浆有狼疮抗凝物存在，则凝固时间会延长并超出正常参考范围。

2、检测方法：

以日本东亚CA530血凝仪为例，其操作步骤如下：

本发明LA筛选测定试剂置37℃预温；100μl待测血浆37℃预温1min后加入100μl上述预温的筛选测定试剂，测定凝固时间。由于筛选测定试剂与待测血浆以1:1比例混合后进行反应，因此，实施例1-4所述LA筛选测定试剂中各组分的工作浓度为原试剂中浓度的1/2。

本发明LA筛选测定试剂不仅适用于日本东亚CA530血凝仪，而且还适用于其它品牌、型号的凝血分析仪，如美国贝克曼库尔特ACL Advance全自动血凝仪、法国思达高STA Compact全自动血凝仪、北京普利生C2000-4半自动血凝仪等，具体参数可根据仪器不同进行适当调整。

3、检测正常血浆凝固时间的参考范围

检测方法同上。收集30例年龄18-55岁的健康个体血浆，根据上述检测方法，用本发明LA筛选测定试剂测定各样品的血浆凝固时间，作为所述试剂相应的正常血浆凝固时间参考范围，结果如下：

实施例1所述试剂测定的正常血浆凝固时间参考范围为31-39s;

实施例2所述试剂测定的正常血浆凝固时间参考范围为30-42s；

实施例3所述试剂测定的正常血浆凝固时间参考范围为30-41s；

实施例4所述试剂测定的正常血浆凝固时间参考范围为29-37s。

实施例6本发明LA筛选测定试剂的分析灵敏度试验

将LA血浆和正常血浆以不同比例进行混合，分别用实施例1、2、3、4所得LA筛选测定试剂与市售采用兔脑磷脂的DRVVT筛选试剂：LA（DRVVT）（美国BIOPOOL公司，货号：40154/40153）和LA-test（法国Biomerieux公司，货号：B259845）测定血浆凝固时间，其结果如表1所示。

表1本发明LA筛选测定试剂与市售DRVVT筛选试剂的检测结果

由表1可知，当LA血浆和正常血浆以1:7混合时：

使用本发明LA筛选测定试剂测定的血浆凝固时间，均在相应的正常参考范围之外，检测结果判定为狼疮抗凝物阳性；

使用LA(DRVVT)试剂测定的血浆凝固时间为40.8s，在相应的正常参考范围（29-41s）之内，检测结果判定为狼疮抗凝物阴性；

使用LA-test试剂测定的血浆凝固时间为40.4s，在相应的正常参考范围（33-42s）之内，检测结果判定为狼疮抗凝物阴性；

结论：本发明LA筛选测定试剂的分析灵敏度要比其它两种市售的DRVVT试剂更高。

实施例7肝素中和剂对试剂测定的影响

LA是磷脂依赖性的物质，如果患者经过肝素治疗，血浆中含有肝素，在筛选LA过程中会出现血浆凝固时间延长的假阳性现象，为了避免此类的误诊，LA筛选试剂中需添加适当的肝素中和剂。本实施例分别以凝聚胺和鱼精蛋白作为肝素中和剂进行比较（除所用肝素中和剂不同外，其余成分均相同，为实施例1所述LA筛选测定试剂的成分组成），考察血浆中肝素对检测结果的影响，其结果如表2所示。

表2凝聚胺和鱼精蛋白中和肝素结果

表2结果表明：血浆中肝素小于1.0U/ml时，以凝聚胺为肝素中和剂的LA筛选测定试剂所测定的血浆凝固时间均未发生延长，而以鱼精蛋白为肝素中和剂的LA筛选测定试剂所测定的血浆凝固时间均出现了延长。

结论：血浆中肝素小于1.0U/ml时，凝聚胺能够更好的校正血浆中肝素引起的凝固时间延长问题。

实施例8本发明LA筛选测定试剂的临床特异性和临床灵敏度分析

实施例1所得LA筛选测定试剂与市售两种DRVVT法LA筛选试剂共同对临床200例血浆样本进行LA的筛选测定，统计血浆凝固时间延长的发生率，以考察试剂的临床特异性和灵敏度，结果如表3所示。

表3临床特异性和灵敏度考察

由表3结果可得，本发明LA筛选测定试剂的临床特异性和临床灵敏度均优于其它两种市售试剂，更适合于LA的筛选测定。

实施例9本发明LA筛选测定的稳定性分析

实施例1所得LA筛选测定试剂置于37℃保存，使用时取出，于不同时间连续测定同一LA正常血浆、LA异常血浆的血浆凝固时间，结果如表4所示。

表4试剂稳定性考察

表4结果表明：本发明LA筛选测定试剂连续测定15天，结果仍较稳定，说明本发明试剂具有较好的稳定性；这对临床检验科来说非常重要，可以减少浪费，从而降低检测成本。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (11)

1.一种狼疮抗凝物的筛选测定试剂，包括蝰蛇毒凝血因子X激活剂、菜籽磷脂、钙离子；

所述筛选测定试剂还包括肝素中和剂，所述肝素中和剂为凝聚胺。

2.如权利要求1所述的筛选测定试剂，其特征在于，所述蝰蛇毒凝血因子X激活剂来自圆斑蝰蛇蛇毒，其工作浓度为2～5U/ml。

3.如权利要求2所述的筛选测定试剂，其特征在于，所述蝰蛇毒凝血因子X激活剂的工作浓度为3U/ml。

4.如权利要求1所述的筛选测定试剂，其特征在于，所述菜籽磷脂的工作浓度为5～20μg/ml。

5.如权利要求1所述的筛选测定试剂，其特征在于，所述菜籽磷脂的工作浓度为10μg/ml。

6.如权利要求1所述的筛选测定试剂，其特征在于，所述钙离子的供体为氯化钙。

7.如权利要求6所述的筛选测定试剂，其特征在于，所述氯化钙的工作浓度为12.5mM。

8.如权利要求1-7中任一项所述的筛选测定试剂，其特征在于，还包括缓冲液，选择性地包括稳定剂和防腐剂。

9.如权利要求1所述的筛选测定试剂，其特征在于，所述肝素中和剂的工作浓度为1～10μg/ml。

10.如权利要求1所述的筛选测定试剂，其特征在于，所述凝聚胺的工作浓度为3μg/ml。

11.一种狼疮抗凝物的筛选测定试剂盒，其特征在于，包括权利要求1-10任一项所述的筛选测定试剂。