CN105424945B - 一种凝血激活检测试剂及其制备方法与用途 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种凝血激活检测试剂及其制备方法与用途,检测试剂包括有Tris(三羟甲基氨基甲烷)、稳定剂、磷脂酰乙醇胺、高岭土,本发明充分考虑了缓冲液的类型和浓度、稳定剂类型和浓度、磷脂酰乙醇胺的浓度、高岭土的浓度对全血检测结果的影响,主要从TEG检测的R值、α角度、MA值三个关键指标进行考察,本发明凝血激活检测试剂用于全血检测时,其检测结果的准确度高,并且本发明试剂的稳定性好,精密度高。
Description
技术领域
本发明涉及凝血检测试剂领域,特别是涉及一种凝血激活检测试剂及其制备方法与用途。
背景技术
目前常规内外源凝血功能实验(如:PT,APTT)只能检测无血小板参与状态下的血浆中凝血因子活性,它不能阐明凝血全过程,只能反映凝血过程中某一阶段或某种凝血产物在生理状态下无血小板参与的凝血反应,但是血小板与凝血因子的相互作用极其复杂,无血小板参与的凝血检测不能反应凝血全貌,并且存在的缺点为检测样本为血浆,检测过程中无血细胞参与,同时对纤维蛋白原测定和血小板计数仅反映数量,未对功能进行测定而且不能预测血栓风险;检测过程为分段式检测,不能对凝血过程进行整体评估。
Simmons等研究发现,复苏效果如何与PT及PTT的相关性不佳,提示这些值异常改变在休克及大量输血治疗后延迟(>24小时)发生(Ann Surg.1969;169:4:455–482);Counts等对接受大量输血病人的凝血功能的进行了一项大规模的前瞻性研究中发现PT、PTT及出血时间只有当显著延长时才有帮助,不能作为指导许多其他病人治疗的标准(AnnSurg.1979;190:91–99);另外Lucas等在一项关于低血容量休克及复苏的一项大型动物实验中报道,PT及PTT很少发生改变,除非当输血量超过相当于15单位全血(Ann Surg.1981;47:125–130)。
因此,强调组织因子通路在止血过程中的决定性地位以及强调激活的因子VII(FVIIa)以及TF/FVIIa复合体是稳定血栓形成的重要步骤的经典的内、外源性凝血反应近来受到了“细胞水平”凝血概念的挑战。所以用全血进行检测的方法如ACT(活化凝血时间)和TEG(血栓弹力图)就突出其显著的优点,其中ACT(activated clotting time,活化凝血时间)是将抽出的血液放入装有白陶土或硅藻土试管中,观察血液凝固时间的长短,其值即为ACT值,活化凝血时间是“凝血时间”的改良试验,是内源性凝血系统较敏感的筛选试验之一,也是监护体外循环肝素用量的较好指标,可以非常准确反映药物预防接触性血栓的能力。TEG是用物理方法模拟人体内环境下凝血、纤溶,迅速判断患者是否存在高凝、低凝、纤溶亢进,并分析形成原因。它实现凝血因子启动、血小板聚集、纤溶的动态监测,提供患者真实凝血全貌。血栓弹力图仪是一种从整个动态过程来监测凝血过程的分析仪。1948年由德国人Harter发明,80年代开始广泛用于指导临床术中输血,现已成为当今监测凝血功能的最重要指标之一,TEG使用全血作为检测标本,在体外加入高岭土(Kaolin)激活,从而启动凝血机制,从内外源凝血系统的启动、纤维蛋白的形成、到血块溶解进行全程监测。TEG具有的优势为:更能准确反映机体凝血功能的变化、敏感性高,相比之下凝血试验只检测了凝血当中的一部分或一个点。TEG是检测除了血管因素之外的从凝血到纤溶的整个凝血过程,包括了凝血因子、血小板、纤维蛋白以及纤维蛋白溶解的整个过程,另外它的稳定性好,凝血试验需处理血样,以血浆或特定血样为主,易受采样、储存、检验、试剂、设备的影响,TEG以全血作为检测对象,不须处理血样。此外TEG更能准确反映机体凝血功能的变化的临床意义:可用于手术或有创治疗前,凝血异常功能的监测(感染、黄疸、SAP等)、抗凝治疗期间凝血功能异常的监测(体外循环、CRRT等)、危重病人出血风险的评估等。更重要的是TEG能够更准确的纠正凝血功能异常。可以通过鉴别不同凝血功能障碍而制定特异性的目标指导治疗,使得输血量的减少(J Trauma.2008;64:564–568);并且可以早期纠正凝血功能异常,以便起到生理性止血作用(J Trauma.2009;66:1253–1257);可以纠正紊乱的凝血功能,使得止血过程正常进行,这可提高急性失血的生存率(Crit Care Med.2008;36:187.),还可减轻包括ARDS及MOF在内免疫炎症并发症的程度,从而改善预后(Curr OpinAnesthesiol.2009;22:289–298.)。另外TEG对低浓度的肝素、类肝素或低分子肝素更敏感,可检测出0.005U/ml的低浓度用量,TEG能够综合反映体外循环时的凝血状况,较ACT全面,可反映凝血机制中除血管内皮细胞和血管壁以外的所有出凝血因素。
采用全血进行检测的方法如ACT(活化凝血时间)和TEG(血栓弹力图)两者都采用体外全血中加入Kaolin(高岭土)的方法激活凝血途径,Kaolin对于血液而言是一种异物,通过激活Ⅻ因子促使血液发生凝固,其途径为接触性激活途径,ACT和TEG为非常准确反映药物预防接触性血栓能力的方法,如果用Kaolin刺激血液后不容易发生凝固,那么换做其他异物(如滤器、导管、导丝和玻璃管)刺激血液也同样不容易发生凝固。因此,Kaolin(高岭土)在目前的全血检测方法如ACT和TEG中具有重要的作用,对Kaolin在TEG中应用的研究同样具有很大的前景,因此,对凝血激活检测试剂(凝固法)的研究具有重要意义,目前却没有相关的成熟技术。
发明内容
鉴于以上所述现有技术的缺点,本发明的目的在于提供一种凝血激活检测试剂,用于解决现有技术中缺乏能够适用于ACT(活化凝血时间)、TEG(血栓弹力图)等方法的凝血激活检测试剂的问题。
为实现上述目的及其他相关目的,本发明第一方面提供一种凝血激活检测试剂,包括如下组分:Tris(三羟甲基氨基甲烷)、稳定剂、磷脂酰乙醇胺、高岭土,稳定剂为PEG3000或PEG6000。
优选地,稳定剂为PEG3000。
进一步地,包括如下重量份的组分:Tris(三羟甲基氨基甲烷)121-24200份、稳定剂1-1000份、磷脂酰乙醇胺600-2000份、高岭土0.1-0.5份。
进一步地,包括如下重量份的组分:Tris(三羟甲基氨基甲烷)121-12100份、稳定剂1-100份、磷脂酰乙醇胺1000-1400份、高岭土0.3-0.5份。
进一步地,包括如下重量份的组分:Tris(三羟甲基氨基甲烷)121份、稳定剂10份、磷脂酰乙醇胺1200份、高岭土0.4份。
进一步地,高岭土的细度≥4000目。
进一步地,Tris(三羟甲基氨基甲烷)、稳定剂、磷脂酰乙醇胺、高岭土均为市售产品。
本发明第二方面提供上述凝血激活检测试的制备方法,包括如下步骤:
1)、配制Tris-HCl缓冲液:按配方量称取Tris固体溶于水,充分混匀,调节pH值为7.35-7.45,制得Tris-HCl缓冲液,备用;
2)、配制稳定剂溶液:按配方量称取稳定剂,溶于步骤1)制得的Tris-HCl缓冲液中,制得稳定剂溶液,备用;
3)、配制磷脂酰乙醇胺溶液:按配方量称取磷脂酰乙醇胺,溶于步骤1)制得的Tris-HCl缓冲液中,制得磷脂酰乙醇胺溶液,备用;
4)、混合液的配制:将步骤2)制得的稳定剂溶液与步骤3)制得的磷脂酰乙醇胺溶液混合,制得混合液,备用;
5)、配制含有高岭土的稀释液:按配方量称取高岭土,溶于上述步骤4)制得的混合液中,加入步骤1)制得的Tris-HCl缓冲液稀释,制得含有高岭土的稀释液,备用;
6)、真空冻干:将步骤5)制得的稀释液分装至试剂杯中,真空冻干,制得凝血激活检测试剂。
优选地,步骤1)中所述水为蒸馏水或去离子水。
更优选地,步骤1)中所述水为去离子水,所述去离子水的电阻率为18.2MΩ*cm。
优选地,步骤1)的Tris-HCl缓冲液中Tris的浓度为0.01-2mol/L;步骤4)的混合液中稳定剂的终浓度为0.0001-1g/100mL,磷脂酰乙醇胺的终浓度为0.6-2.0g/100mL;步骤5)的稀释液中高岭土的终浓度为0.0001-0.0005g/100mL。
更优选地,步骤1)的Tris-HCl缓冲液中Tris的浓度为0.01mol/L;步骤4)的混合液中稳定剂的终浓度为0.01g/100mL,磷脂酰乙醇胺的终浓度为1.2g/100mL;步骤5)的稀释液中高岭土的终浓度为0.0004g/100mL。
优选地,步骤6)中每个试剂杯分装的稀释液体积为20-500μL,每个试剂杯中高岭土的含量为0.5×10-7-2.5×10-7g(即稀释液中高岭土的终浓度与分装至试剂杯的稀释液的体积的乘积)。
更优选地,步骤6)中每个试剂杯分装的稀释液体积为25μL。
优选地,步骤6)中真空冻干的温度为-50℃至-40℃,真空冻干的时间为2h以上。
本发明第三方面提供上述凝血激活检测试剂在全血检测中的用途。
本发明第四方面提供上述凝血激活检测试剂在TEG检测中的用途。
进一步地,上述凝血激活检测试剂用于TEG检测时,向试剂中加入Tris-HCl缓冲液复溶。
更进一步地,上述凝血激活检测试剂用于TEG检测时,向试剂中加入Tris-HCl缓冲液复溶,复溶时加入Tris-HCl缓冲液的体积是试剂冻干前分装体积的1-3倍。
本发明第五方面提供一种凝血激活检测试剂盒,包括Tris-HCl缓冲液、稳定剂、磷脂酰乙醇胺、高岭土,稳定剂为PEG3000或PEG6000。
优选地,上述试剂盒中,Tris的浓度为0.01-2mol/L;稳定剂为PEG3000或PEG6000,稳定剂的浓度为0.0001-1g/100mL,磷脂酰乙醇胺的浓度为0.6-2.0g/100mL;高岭土的终浓度为0.0001-0.0005g/100mL。
如上所述,本发明的凝血激活检测试剂及其制备方法以及用途,具有以下有益效果:本发明充分考虑了缓冲液的类型和浓度、稳定剂类型和浓度、磷脂酰乙醇胺的浓度、高岭土的浓度对全血检测结果的影响,主要从TEG检测的R值、α角度、MA值三个关键指标进行考察,通过大量的实验探索,总结出本发明凝血激活检测试剂的最佳组分及其配比,本发明凝血激活检测试剂用于全血检测时,其检测结果的准确度高,并且,本发明试剂的稳定性好,精密度高。
附图说明
图1显示为不同浓度的Tris-HCl缓冲液、PBS缓冲液、Hepes缓冲液在200-600nm下的吸光度变化统计图。
图2显示为六偏磷酸钠、三硅酸钠、阿拉伯胶、五元三磷酸、PEG3000、PEG6000六种稳定剂的R值、Angle(dge)、MA值柱形统计图。
图3显示为凝血激活检测试剂中高岭土的浓度为0.0001g/100mL、0.0002g/100mL、0.0003g/100mL、0.0004g/100mL、0.0005g/100mL时,凝血激活检测试剂的R值、Angle(dge)、MA值统计图。
图4显示为凝血激活检测试剂中磷脂酰乙醇胺的浓度为1.0g/100mL、1.2g/100mL、1.4g/100mL时,凝血激活检测试剂的R值、Angle(dge)、MA值统计图。
图5显示为向凝血激活检测试剂中分别加入30μL、40μL、50μL浓度为0.01mol/L的Tris-HCl缓冲液复溶时,凝血激活检测试剂的R值、Angle(dge)、MA值统计图。
具体实施方式
以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式,本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用,本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用,在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。
实施例1
TEG(血栓弹力图)检测参数说明如下:
R值:反映参加凝血启动过程的凝血因子的综合作用,包含了内源性通路、外源性通路和共同通路的内容,直至纤维蛋白凝块开始形成,适用于TEG、ACT或ST检测。在临床上反眏内、外源性通路和共同道路,以及纤维蛋白原被激活开始形成纤维蛋白网的情况,是检测凝血因子的一个指标。凝血酶原时间主要反映外源性凝血通路,部分凝血酶时间主要是反映内源性凝血通路。
α角度:英文名为Angel(单位Degree,即度,英文简称deg),具体是指从血凝块形成点至描记图最大曲线弧度作切线与水平线的夹角度数,反映纤维蛋白和血小板在血凝块开始形成时的共同作用的结果,即血凝块形成的速率,由于此时以纤维蛋白的功能为主,故为检测纤维蛋白原功能的一个指标;α角度参数在极度低凝时也比较直观,主要用于纤维蛋白原定量实验。
MA值:描记图上的最大振幅,即最大切就力系数。MA反映了正在形成的血凝块的最大强度及血凝块形成的稳定性,主要受血小板及纤维蛋白原两个因素的影响,其中血小板的作用要比纤维蛋白原大,约占80%,血小板质量或数量的异常都会影响到MA值。MA值是临床检测血小板质量和数量的一个指标,常用于血小板聚集试验(每使用一种诱导剂)。
缓冲液稳定性对比实验
由于是直接检测人体全血标本,因此,本发明试剂需要保证血液离体之后处于相对稳定的液体环境,因此对本发明试剂所使用的缓冲液稳定性进行了比较。
分别配制浓度为0.01mol/L、0.03mol/L、0.06mol/L、0.1mol/L、0.25mol/L、0.5mol/L、1mol/L、2mol/L的Tris-HCl缓冲液、PBS缓冲液、Hepes缓冲液,检测各个缓冲液在200-600nm波长下的吸光度。
如图1所示:A图代表Tris-HCl缓冲液在200-600nm波长下的吸光度变化曲线图,B图代表PBS缓冲液在200-600nm波长下的吸光度变化曲线图,C图代表Hepes缓冲液在200-600nm波长下的吸光度变化曲线图。
a到h表示缓冲液的浓度依次为0.01mol/L、0.03mol/L、0.06mol/L、0.1mol/L、0.25mol/L、0.5mol/L、1mol/L、2mol/L。
从图1中可以看出,PBS缓冲液和Hepes缓冲液的浓度越高,溶液的稳定性越差,虽然PBS缓冲液低浓度时稳定良好,但其缓冲能力较Tris-HCl弱,且溶液浓度较低时,Tris-HCl缓冲液与PBS缓冲液的吸光度变化不大,溶液相对均一稳定。故本发明凝血激活检测试剂的缓冲液优选为0.01mol/L的Tris-Hcl缓冲液。
因为人体的内环境pH值在7.35-7.45之间,故选择缓冲液的pH值为7.4(通过氢氧化钠溶液和盐酸溶液调节pH值)。
稳定剂对比实验
由于高岭土不溶于水,其稳定性差,故向其中加入不同种类的稳定剂,找出最优的稳定剂,用于后续研究,结果如图2所示:每组柱形图中从左到右依次为六偏磷酸钠、三硅酸钠、阿拉伯胶、五元三磷酸、PEG3000、PEG6000,上述六种稳定剂的浓度均为0.01g/100mL。
三硅酸钠生产厂家是Sigma,批号是BCBN5875V,CAS是1344-09-8,货号与规格是13726-1KG;阿拉伯胶生产厂家是Sigma,批号是WXBB1477V,CAS是9000-01-5,货号与规格是V900768-500G;PEG3000、PEG6000生产厂家是Sigma-Aldrich,货号与规格分别是1546525-1000G和1546580-1000G,CAS号都是25322-68-3,PEG(Polyethylene glycol)的中文名称为聚乙二醇。
加入稳定剂后,在pH为7.4、浓度为0.01mol/L的Tris-HCl缓冲溶液中,在高岭土浓度为0.01g/100mL的条件下测定同一份血液的各个参数,检测结果如图2所示,PEG3000的R值在6.0左右,比三硅酸钠的R值略低,PEG3000的Angle(dge)、MA值都比其他的稳定剂更优,故本发明试剂的稳定剂优选为PEG3000。
高岭土、磷脂酰乙醇胺浓度对比实验
为了达到最优的检测结果,对高岭土和磷脂酰乙醇胺的浓度进行了优化,结果如图3和图4。
高岭土生产厂家是Sigma、CAS是1332-58-7,货号与规格是60609-1KG。磷脂酰乙醇胺生产厂家为Sigma,CAS号39382-08-6,规格1535744-100G。
图3中,A表示本发明试剂的R值与Kaolin浓度变化关系图,B表示本发明试剂的Angle(dge)与高岭土浓度变化关系图,C表示本发明试剂的MA值与高岭土浓度变化关系图。从图3中可以看出,随着高岭土浓度的升高,R值逐渐降低,而Angle(dge)和MA值则逐渐升高,并且R值受高岭土浓度变化的影响较大,根据正常范围的参考区间及现有试剂对比可以得出,本发明试剂中高岭土的浓度优选为0.0003g/100mL-0.0005g/100mL,更优选为0.0004g/100mL,在此浓度下,其各项参数达到最优。
图4中,从左向右依次为R值、Angle(dge)、MA值随磷脂酰乙醇胺浓度的变化图(磷脂酰乙醇胺的浓度为1.0g/100mL、1.2g/100mL、1.4g/100mL)。由图4中可以看出,当磷脂酰乙醇胺浓度为1.2g/100mL时,试剂的Angle(dge)和MA值达到了最大,故Angle(dge)和MA值受磷脂酰乙醇胺浓度影响较大,当磷脂酰乙醇胺浓度为1.4g/100mL时,其R值已经偏离正常范围,Angle(dge)和MA值也有所下降,其原因可能是磷脂酰乙醇胺的浓度过高影响了凝血反应中的瀑布效应,阻碍了凝血块的形成,因此,试剂中磷脂酰乙醇胺的最优浓度为1.2g/100mL。
根据上述对比实验,得到优选的凝血激活检测试剂,试剂中各组分及其终浓度如下:0.01mol/L的Tris、0.01g/100mL的PEG3000、1.2g/100mL的磷脂酰乙醇胺、0.0004g/100mL的高岭土。即试剂中各组分的重量份如下:Tris(三羟甲基氨基甲烷)121份、PEG300010份、磷脂酰乙醇胺1200份、高岭土0.4份。
上述凝血激活检测试剂的制备方法如下:
1)、配制0.01mol/L的Tris-HCl缓冲液:称取Tris固体1.21g溶于1000mL的去离子水(电阻率18.2MΩ*cm),充分混匀,调节pH值为7.35-7.45,制得0.01mol/L的Tris-HCl缓冲液;通过氢氧化钠溶液、盐酸溶液调节pH值,优选pH值为7.4,将配置好的Tris-HCl缓冲液存储于4℃冰箱中,备用。
2)、配制0.1g/100mL的PEG3000稳定剂溶液:称取0.1g的PEG3000,溶于100mL的Tris-HCl缓冲液中,制得PEG3000稳定剂溶液,存储于4℃冰箱中备用。
3)、配制1.33g/100mL的磷脂酰乙醇胺溶液:称取1.33g的磷脂酰乙醇胺,溶于100mL的Tris-HCl缓冲液中,制得1.33g/100mL的磷脂酰乙醇胺溶液,存储于4℃冰箱中备用。
4)、混合液的配制:将1.33g/100mL的磷脂酰乙醇胺溶液和0.1g/100mL的PEG3000稳定剂溶液按照9:1的体积比进行混合,制得混合液,混合液中磷脂酰乙醇胺的终浓度为1.2g/100mL,PEG3000的终浓度为0.01g/100mL,将配置好的混合液存储于4℃冰箱中备用。
5)、配制0.1g/100mL的高岭土母液及其稀释液:称取0.1g高岭土溶于100mL的上述步骤4)制得的混合液中,配制成高岭土浓度为0.1g/100mL的母液,再加入上述步骤4)制得的混合液进行稀释,具体按照高岭土浓度为0.1g/100mL→0.01g/100mL→0.001g/100mL→0.0004g/100mL的顺序稀释,制得高岭土浓度为0.0004g/100mL的稀释液。
6)、真空冻干:取25μL稀释液加入1.5mL容量的试剂杯中,用封口胶将其密封、扎洞后于冻干机中真空冻干,冻干温度-50℃至-40℃,冻干时间2-5h,制得凝血激活检测试剂,冻干后弃去密封胶,加盖拧紧后储存于-20℃冰箱中备用。真空冻干有利于保证试剂中各组分的稳定性。
复溶体积的优化实验
此外,对冻干后的复溶体积(复溶体积是指向试剂杯中加入0.01mol/L的Tris-HCl缓冲液的体积)也进行了实验筛选。如图5所示,从左到右依次为R值、Angle(dge)、MA值随复溶体积(依次为30μL、40μL、50μL)的变化图。从图5可知,当复溶体积为40μL时,血液TEG各项参数达到了最优。
上述方法制得的凝血激活检测试剂用于全血检测的方法如下:
实验前的准备
开启血栓弹力图仪及其系统
操作流程
a)、向凝血激活检测试剂中加入40μL的Tris-HCl缓冲溶液,在蜗旋震荡仪上震荡5min使其完全溶解。
b)、取1ml新鲜血液,加入步骤a)中完全溶解的凝血激活检测试剂中,上下颠倒混匀。
c)、将空白的测试杯安装在TEG上。
d)、向测试杯中加入20μL浓度为0.2mol/L的CaCl2溶液以及340μL步骤b)制得的与新鲜血液混匀的凝血激活检测试剂,混匀。
e)、推上步骤d)制得的装有混合液的测试杯,将测试杆移到测试位进行检测,检测时间35min。
检测结果如下:
本发明试剂与现有TEG试剂(美国西芬斯公司TEG试剂)的全血检测结果如下表(本实验中的试剂用于TEG检测,因此也称为TEG试剂):
表1
从上表可知,本发明TEG试剂的全血检测结果与现有的TEG试剂的全血检测结果非常接近,能够客观真实地反映全血检测结果,准确度高。
本发明试剂全血检测的批内差统计如下表:
表2
检测次数 | R(min) | Angle(deg) | MA(mm) |
1 | 6.3 | 66.5 | 61.1 |
2 | 6.4 | 61.9 | 60.9 |
3 | 6.4 | 65.0 | 62.9 |
4 | 6.6 | 64.7 | 62.1 |
5 | 6.2 | 65.7 | 63.4 |
6 | 6.9 | 66.9 | 62.6 |
7 | 6.9 | 69.7 | 64.9 |
8 | 6.9 | 68.3 | 64.7 |
9 | 6.1 | 68.3 | 66.9 |
10 | 6.9 | 61.5 | 66.9 |
平均值 | 6.56 | 65.85 | 63.64 |
SD(标准偏差) | 0.320 | 2.686 | 2.160 |
CV(相对标准偏差) | 0.049 | 0.041 | 0.034 |
从上表2可知,批内检测结果的分散度小,批内的全血检测结果的相对标准偏差均低于0.05,批内精密度高。
本发明试剂全血检测的批间差统计如下表:
表3
从上表3可知,批间的全血检测结果的相对标准偏差均低于0.05,批间精密度高。
上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效,而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下,对上述实施例进行修饰或改变。因此,举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变,仍应由本发明的权利要求所涵盖。
Claims (6)
1.一种凝血激活检测试剂在制备用于全血检测试剂中的用途,所述凝血激活检测试剂包括如下重量份的组分:Tris(三羟甲基氨基甲烷)121-726份、稳定剂10份、磷脂酰乙醇胺1000-1200份、高岭土0.3-0.5份;稳定剂为PEG3000或PEG6000。
2.根据权利要求1所述的用途,其特征在于,所述凝血激活检测试剂包括如下重量份的组分:Tris(三羟甲基氨基甲烷)121份、稳定剂10份、磷脂酰乙醇胺1200份、高岭土0.4份。
3.如权利要求1-2任一项所述的用途,所述凝血激活检测试剂的制备方法包括如下步骤:
1)、配制Tris-HCl缓冲液:按配方量称取Tris固体溶于水,充分混匀,调节pH值为7.35-7.45,制得Tris-HCl缓冲液,备用;
2)、配制稳定剂溶液:按配方量称取稳定剂,溶于步骤1)制得的Tris-HCl缓冲液中,制得稳定剂溶液,备用;
3)、配制磷脂酰乙醇胺溶液:按配方量称取磷脂酰乙醇胺,溶于步骤1)制得的Tris-HCl缓冲液中,制得磷脂酰乙醇胺溶液,备用;
4)、混合液的配制:将步骤2)制得的稳定剂溶液与步骤3)制得的磷脂酰乙醇胺溶液混合,制得混合液,备用;
5)、配制含有高岭土的稀释液:按配方量称取高岭土,溶于上述步骤4)制得的混合液中,加入步骤1)制得的Tris-HCl缓冲液稀释,制得含有高岭土的稀释液,备用;
6)、真空冻干:将步骤5)制得的稀释液分装至试剂杯中,真空冻干,制得凝血激活检测试剂。
4.根据权利要求3所述的用途,其特征在于:步骤1)的Tris-HCl缓冲液中Tris的浓度为0.01mol/L;步骤4)的混合液中稳定剂的终浓度为0.01g/100mL,磷脂酰乙醇胺的终浓度为1.2g/100mL;步骤5)的稀释液中高岭土的终浓度为0.0004g/100mL。
5.根据权利要求3中所述的用途,其特征在于:步骤6)中每个试剂杯分装的稀释液体积为20-500μL。
6.一种凝血激活检测试剂盒在制备用于全血检测试剂盒中的用途,所述凝血激活检测试剂盒包括Tris-HCl缓冲液、稳定剂、磷脂酰乙醇胺、高岭土;具体包括如下重量份的组分:Tris(三羟甲基氨基甲烷)121-726份、稳定剂10份、磷脂酰乙醇胺1000-1200份、高岭土0.3-0.5份,稳定剂为PEG3000或PEG6000。
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