CN110361525B - 一种测定血液中磷脂酰丝氨酸含量的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种测定血液中磷脂酰丝氨酸含量的方法，涉及分析检测技术领域，基于测定磷脂酰丝氨酸的现有方法无法精确定量磷脂酰丝氨酸的问题而提出的。本发明包括以下步骤：(1)配制磷脂酰丝氨酸标准溶液；(2)配制待测液；(3)采用双通道血栓弹力图仪器对步骤(1)中的磷脂酰丝氨酸标准品溶液进行测定，获得标准曲线方程，对步骤(2)待测液中的磷脂酰丝氨酸含量进行测定，根据标准曲线方程确定待测液中磷脂酰丝氨酸的含量。本发明的有益效果在于：可以有效测定磷脂酰丝氨酸的含量，不会因磷脂酰丝氨酸存在变体而受影响。且测定方法简单，准确度高，精密度好，且不涉及有机溶剂的使用，不污染环境。

Description

一种测定血液中磷脂酰丝氨酸含量的方法

技术领域

本发明涉及分析检测技术领域，具体涉及一种测定血液中磷脂酰丝氨酸含量的方法。

背景技术

磷脂酰丝氨酸又称复合神经酸。英文名Phosphatidylserine，简称PS，由天然大豆榨油剩余物提取，或从动物脑冻干粉、细胞膜等组织中提取出来。是细胞膜的物质，尤其存在于大脑细胞中。其功能主要是改善神经细胞功能，调节神经脉冲的传导，增进大脑记忆功能，由于其具有很强的亲脂性，吸收后能够迅速通过血脑屏障进入大脑，起到舒缓血管平滑肌细胞，增加脑部供血的作用。它能影响着细胞膜的流动性、通透性，并且能激活多种酶类的代谢和合成。如人红细胞膜上就有磷脂酰胆碱(PC,占19％)、脑磷脂(PE,占8％)、磷脂酰乙醇胺(PI,占16％)和磷脂酰丝氨酸(PS,占10％)，并且只有后者在细胞膜上具有净负电荷，有助于膜的不对称性，还能活化已损伤表面凝血酶原，并与磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺在体内可互相转化。磷脂酰丝氨酸由于含有两种构像，R1和R2的各不相同，从而使磷脂酰丝氨酸实际成了一类化合物的总称。

磷脂酰丝氨酸呈白色或淡黄色松散粉末，能乳化于水。不溶于乙醇、甲醇；溶于氯仿、乙醚、石油醚。人工合成物仅溶于氯仿。从牛脑提取物在室温内，又暴露于空气中，则每日变性约0.5％。天然物(L-α-磷脂酰-L-丝氨酸)多由牛(羊)脑或大豆等提取。

由于R1和R2差异，实是诸多化合物的混合物。人工合成产品具有很多异构体，纯化过程复杂。加上不溶于乙醇、甲醇；只溶于氯仿、乙醚、石油醚。对此化合物的检测，普通HPLC法难以建立物质检测方法学。APTT凝血酶活时间的检测，由于时间控制的难度，无法精确定量物质。

发明内容

本发明解决的技术问题在于测定磷脂酰丝氨酸的现有方法无法定量血液中磷脂酰丝氨酸。

本发明是采用以下技术方案解决上述技术问题的：

本发明提供一种测定血液中磷脂酰丝氨酸含量的方法，包括以下步骤：

(1)配制磷脂酰丝氨酸标准溶液；

(2)配制待测液；

(3)采用双通道血栓弹力图仪器对步骤(1)中的磷脂酰丝氨酸标准品溶液进行测定，获得标准曲线方程，采用双通道血栓弹力图仪器对对步骤(2)待测液进行测定，根据标准曲线方程确定待测液中磷脂酰丝氨酸的含量。

优选的，所述磷脂酰丝氨酸标准溶液的配制方法包括以下步骤：

(1)配制磷脂酰丝氨酸标准曲线母液工作液M_L：称取磷脂酰丝氨酸，加入纯化水、分散剂和悬浮剂，使其溶解配成标准母液工作液；所述磷脂酰丝氨酸的每毫克质量与纯化水的每微升体积、分散剂的每微升体积、悬浮剂的每毫克质量的比例为10:1000:1:1；

(2)配制梯度稀释工作液：称取纯化水、分散剂和悬浮剂，所述纯化水的每微升体积与分散剂的的每微升体积、悬浮剂的每毫克质量的比例为1000:1：1；

(3)配制磷脂酰丝氨酸标准曲线样本：采用梯度稀释工作液对磷脂酰丝氨酸标准母液进行稀释，并在每个稀释样本中加入定量质控品，所述质控品为猪冻干血浆。

有益效果：本发明可以有效测定血液中磷脂酰丝氨酸的含量，且测定方法简单，准确度高，精密度好，且不涉及有机溶剂的使用，不污染环境。

优选的，所述溶解方法包括将配制后的标准品溶液置于45-50℃水浴加热20-30min后，超声溶解配制成磷脂酰丝氨酸标准品溶液。

优选的，所述待测液的配制方法包括以下步骤：称取含有磷脂酰丝氨酸的待测样品，加入纯化水、分散剂和悬浮剂，所述纯化水的每微升体积、分散剂的每微升体积、悬浮剂的每毫克质量的比例为1000:1:5。

纯化水、分散剂和悬浮剂的作用为模拟血液粘稠度。

优选的，采用所述双通道血栓弹力图仪器的测定方法为：开机预热10min，恒温池温度设定为30℃，室温控制在15～28℃之间，上机检测，获得MA值。

优选的，还包括对标准曲线方程可靠性进行检测的方法，包括以下步骤：

(1)配制质控母液工作液M_Q：称取磷脂酰丝氨酸，加入纯化水、分散剂和悬浮剂，使其溶解配成质控母液工作液；所述磷脂酰丝氨酸的每毫克质量与纯化水的每微升体积、分散剂的每微升体积、悬浮剂的每毫克质量的比例为10:1000:1:1；

(2)配制梯度稀释工作液：称取纯化水、分散剂和悬浮剂，所述纯化水的每微升体积与分散剂的的每微升体积、悬浮剂的每毫克质量的比例为1000:1：1；

(3)配制质控样本：采用梯度稀释工作液对质控母液工作液进行稀释，加入定量质控品；稀释浓度在磷脂酰丝氨酸标准曲线样本的稀释浓度范围内。

优选的，所述悬浮剂为阿拉伯胶、明胶、果胶或琼脂糖中的一种或多种。

优选的，所述分散剂包括吐温。

优选的，所述吐温为吐温80、吐温60或吐温20，当分散剂为吐温20时，还需加入聚乙二醇辛基苯基醚，所述吐温20与聚乙二醇辛基苯基醚的体积比为1:0.5。

优选的，所述磷脂酰丝氨酸标准溶液的配制方法包括以下步骤：

(1)配制磷脂酰丝氨酸标准曲线母液工作液M_L：称取0.1g磷酯酰丝氨酸，加入10mL纯化水和10μL吐温80、0.01g阿拉伯胶，45℃水浴30min，超声溶解配成母液工作液；

(2)配制梯度稀释工作液：100mL纯化水和100μL吐温80、0.1g阿拉伯胶，45℃水浴30min，超声溶解配成梯度稀释工作液；

(3)配制磷脂酰丝氨酸标准曲线样本：

1号样本：0μL质控母液工作液、1000μL梯度稀释工作液、质控品；

2号样本：5μL质控母液工作液、995μL梯度稀释工作液、质控品；

3号样本：10μL质控母液工作液、990μL梯度稀释工作液、质控品；

4号样本：20μL质控母液工作液、980μL梯度稀释工作液、质控品；

5号样本：50μL质控母液工作液、950μL梯度稀释工作液、质控品；

6号样本：100μL质控母液工作液、900μL梯度稀释工作液、质控品；

7号样本：200μL质控母液工作液、800μL梯度稀释工作液、质控品。

优选的，所述待测液的配制方法包括以下步骤：称取0.2g待测混合磷脂或者生物研磨组织，加入10mL纯化水和10μL吐温80、0.05g阿拉伯胶，45℃水浴30min后超声溶解，获得待测液。

优选的，所述对标准曲线方程可靠性进行检测的方法，包括以下步骤：

(1)配制质控母液工作液M_Q：称取0.1g磷酯酰丝氨酸，加入10mL纯化水和10μL吐温80、0.01g阿拉伯胶，45℃水浴30min，超声溶解配成母液工作液；

(2)配制梯度稀释工作液：100mL纯化水和100μL吐温80、0.1g阿拉伯胶，45℃水浴30min，超声溶解配成梯度稀释工作液；

(3)配制质控样本：40μL质控母液工作液、960μL梯度稀释工作液、质控品。

优选的，所述猪冻干血浆的规格为1mL每支。

本发明的有益效果在于：本发明可以有效测定血液中磷脂酰丝氨酸的含量，且测定方法简单，准确度高，精密度好，且不涉及有机溶剂的使用，不污染环境。

附图说明

图1为本发明实施例1中磷脂酰丝氨酸标准曲线图；

图2为本发明实施例1中血栓弹力图检测线性原图谱；

图3为本发明实施例1中质控样本中磷脂酰丝氨酸的图谱；

图4本发明实施例1中模拟浓度的待测液中磷脂酰丝氨酸的图谱。

具体实施方式

以下将结合说明书附图和实施例对本发明做进一步详细说明。

下述实施例中所用的试验材料和试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径获得。

实施例中未注明具体技术或条件者，均可以按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。

实施例1

(1)配置标准曲线母液工作液M_L和质控母液工作液M_Q

M_L：称取0.1g磷酯酰丝氨酸，加入10mL纯化水和10μL吐温80、0.01g阿拉伯胶，45℃水浴30min，超声溶解配成母液工作液；标准曲线母液工作液中磷酯酰丝氨酸的理论浓度为0.01g/mL；

M_Q：称取0.1g磷酯酰丝氨酸，加入10mL纯化水和10μL吐温80、0.01g阿拉伯胶，45℃水浴30min，超声溶解配成母液工作液；质控母液工作液中磷酯酰丝氨酸的理论浓度为0.01g/mL；

(2)配制梯度稀释工作液：100mL纯化水和100μL吐温80、0.1g阿拉伯胶，45℃水浴30min，超声溶解配成梯度稀释工作液；

(3)配制磷脂酰丝氨酸标准曲线样本

1号样本(L1)：0μL标准曲线母液工作液、1000μL梯度稀释工作液溶解1支质控品；

2号样本(L2)：5μL标准曲线母液工作液、995μL梯度稀释工作液溶解1支质控品；

3号样本(L3)：10μL标准曲线母液工作液、990μL梯度稀释工作液溶解1支质控品；

4号样本(L4)：20μL标准曲线母液工作液、980μL梯度稀释工作液溶解1支质控品；

5号样本(L5)：50μL标准曲线母液工作液、950μL梯度稀释工作液溶解1支质控品；

6号样本(L6)：100μL标准曲线母液工作液、900μL梯度稀释工作液溶解1支质控品；

7号样本(L7)：200μL标准曲线母液工作液、800μL梯度稀释工作液溶解1支质控品。

(4)配制质控样本Q_M

质控样本：12.5μL质控母液工作液、987.5μL梯度稀释工作液溶解1支质控品；其中质控品为血栓弹力图用猪冻干血浆(1mL/支)，检测时现配使用；质控样本中磷脂酰丝氨酸的理论浓度为12.5μg/100μL。

质控样本为已知浓度的待测液，用来解释标准值与拟合线性后的测定值之间的差异，从而判断标准曲线方程是否可靠，当质控样本Q_M浓度和理论值偏差在15％以内，检测结果有效。

(5)配制模拟浓度的待测液(模拟真实血浆样品)

称取0.2g待测磷酯酰丝氨酸，加入10mL纯化水和10μL吐温80，0.05g阿拉伯胶，45℃水浴30min，超声溶解均匀配成待测液。

用二倍稀释法，用梯度稀释工作液将上述待测液稀释成0.01g/mL、0.005g g/mL、以及0.0025g/mL，待测用。取0.005g/mL模拟浓度的待测磷酯酰丝氨酸20μL，加入980μL梯度稀释工作液(磷酯酰丝氨酸的模拟浓度为10μg/100μL)，混匀后全部加入质控品，上级检测；

(6)对真实血液样品中的磷酯酰丝氨酸含量进行测定

按照步骤(5)中模拟真实血浆样品的方法，配制磷酯酰丝氨酸的模拟浓度为0.0125g/mL、0.0375g/mL及0.1g/mL的工作液，分别取20μL，加入980μL梯度稀释工作液，分别获得磷酯酰丝氨酸的模拟浓度为25μg/100μL、75μg/100μL及200μg/100μL的工作液，然后分别取50μL，加入到1mL空白血浆样品中，加标理论值分别为12.5μg、37.5μg及100μg，对加标的空白血浆样品、空白血浆样品上机检测。

(7)上机检测步骤：双通道血栓弹力图仪器(创孚医疗CFYL-200型或市售同类产品)校准后，开机预热10分钟。恒温池温度设定为30℃，室温控制在15～28℃之间，将磷脂酰丝氨酸标准曲线样本现配后，上机检测，获得MA值。

根据获得的MA值，获得数据方程F(x)，R值在0.995以上有效。

上机检测质控样本Q_M，测质控样本Q_M中MA值落在标准曲线工作样本之间的，进行F(x)带入运算，得到相应的浓度。(这里指的是质控样品计算操作方法，具体浓度可以由实验人依照具体实验进行核定。)

(8)实验结果：

a.标准曲线

表1为磷脂酰丝氨酸梯度与MA值对应表

如图1所示，图1为获得的磷脂酰丝氨酸标准曲线图，纵坐标为MA值，横坐标为活性PS梯度的lnx值，图2为血栓弹力图检测线性原图谱，其中回归方F(x)＝3.52ln(x)+37.764，R²＝0.9964。

b.质控样本QM浓度和理论值比较

质控样本Q_M中磷脂酰丝氨酸的含量为：如图3所示，测得MA＝46.7，带入方程F(x)＝3.52ln(x)+37.764，解得X＝12.65μg/100μL。系统偏差为1.2％，符合小于15％的偏差标准。

c.模拟浓度的待测液的测定结果

如图4所示，模拟血液样本的样品MA值45.9，带入公式计算，得到X_(C)＝10.08μg/100μL，与理论值10μg/100μL的误差小于15％。

d.真实血液样品中的磷酯酰丝氨酸含量测定结果

加标理论值分别为12.5μg、37.5μg及100μg的加标空白血浆样品MA值分别为：54.5、51.8、49.8；及未加标的空白血浆样品MA值为47.9；带入方程F(x)＝3.52ln(x)+37.764,对应得出:

MA＝54.5，X＝115.6；

MA＝51.8，X＝53.9；

MA＝49.8，X＝30.6；

MA＝47.9，X＝17.8；

空白血液样品的测定结果为17.8，测算的加标结果分别为：

115.6-17.8＝97.8；近似回收率为97.8/100*100％＝97.8％

53.9-17.8＝36.1；近似回收率为36.1/37.5*100％＝96.3％

为12.8/12.5*100％＝102.为12.8/12.5*100％＝102.4％

因此可判定空白血液样品中，磷酯酰丝氨酸含量约有17.8μg，其他加标回收率理论值误差均在±5％以内，测试结果可靠。

(9)检测原理：磷脂酰丝氨酸是磷脂类物质的总称，其包括磷脂酰胆碱、磷酯酰丝氨酸、脑磷脂、卵磷脂、磷脂酰肌醇，均为凝血瀑布学说内源性激活物，磷脂酰胆碱、磷酯酰丝氨酸、脑磷脂、卵磷脂、磷脂酰肌醇的含量与纤维蛋白原的激活程度直接相关。当他们的含量变化时，纤维蛋白原的激活程度也变化，并成正相关。而纤维蛋白原的激活，与凝血强度成正相关。因此利用TEG血栓弹力图仪器，检测活性磷酯酰丝氨酸物质与凝血强度MA值的关系，可以作为精确定量活性磷酯酰丝氨酸物质的检验方法。

实施例2

(1)配置标准曲线母液工作液M_L和质控母液工作液M_Q

M_L：称取0.1g磷酯酰丝氨酸，加入10mL纯化水和10μL吐温20、5μL聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X-100)、0.01g果胶，50℃水浴20min，超声溶解配成母液工作液；

M_Q：称取0.1g磷酯酰丝氨酸，加入10mL纯化水和10μL吐温20、5μL聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X-100)、0.01g果胶，45℃水浴30min，超声溶解配成母液工作液；

(2)配制梯度稀释工作液：100mL纯化水和100μL吐温20、5μL聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X-100)、0.1g果胶，45℃水浴30min，超声溶解配成梯度稀释工作液；

(3)配制磷脂酰丝氨酸标准曲线样本和质控样本：

磷脂酰丝氨酸标准曲线样本：

1号样本(L1)：0μL质控母液工作液、1000μL梯度稀释工作液、1mL质控品；

2号样本(L2)：5μL质控母液工作液、995μL梯度稀释工作液、1mL质控品；

3号样本(L3)：10μL质控母液工作液、990μL梯度稀释工作液、1mL质控品；

4号样本(L4)：20μL质控母液工作液、980μL梯度稀释工作液、1mL质控品；

5号样本(L5)：50μL质控母液工作液、950μL梯度稀释工作液、1mL质控品；

6号样本(L6)：100μL质控母液工作液、900μL梯度稀释工作液、1mL质控品；

7号样本(L7)：200μL质控母液工作液、800μL梯度稀释工作液、1mL质控品。

质控样本：40μL质控母液工作液、960μL梯度稀释工作液、质控品；其中质控品为血栓弹力图用猪冻干血浆(1mL/支)，检测时现配使用。

(4)配制待测液梯度工作液：

称取0.2g待测混合磷脂，加入10mL纯化水和10μL吐温20、5μL聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X-100)、0.05g果胶，45℃水浴30min，超声溶解均匀配成待测母液工作液。

用二倍稀释法，用梯度工作液将上述待测母液工作液稀释成0.01g/mL、0.005g g/mL、以及0.0025g/mL，待测用。

(5)上机检测：双通道血栓弹力图仪器(创孚医疗CFYL-200型或市售同类产品)校准后，开机预热10分钟。恒温池温度设定为30℃，室温控制在15～28℃之间，将磷脂酰丝氨酸标准曲线样本现配后，上机检测，获得MA值。

根据获得的MA值，获得数据方程F(x)，R值在0.995以上有效。

上机检测待测液梯度工作液和质控样本Q_M，测待测液梯度工作液中MA值落在1～7号标准曲线工作样本之间的，进行F(x)带入运算，得到相应的浓度。当质控样本Q_M浓度和理论值偏差在15％以内，检测结果有效。

实施例3

精密度和准确度实验：称取0.1g磷酯酰丝氨酸，加入10mL纯化水和10μL吐温20、5μL聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X-100)、0.01g果胶，50℃水浴20min，超声溶解配成母液工作液；

精密度和准确度测定：按照6号样本(L6)配置方法，配置上机检测，连续10次双通道检测结果获得MA值：

测定结果：从血栓弹力图检测精密度和准确度结果看出，该方案检测精度高，重复性好。均值53.68，RSD小于2.0％。

对比例

采用HPLC对磷脂酰丝氨酸含量进行检测

HPLC检测条件：流动相A-乙腈；流动相B-氯仿；甲醇：氨水＝80:19.5：0.5；流动相C-氯仿：甲醇：氨水：水＝60:39.5-x：0.5：x。其余条件为现有技术。

表1为测定条件

采用本方法，流动相对PEEK管路产生微弱溶解增加杂质影响，且PS出峰峰型较差。传统实验无法测得活性磷脂的含量，误差较大。样品处理回收率差，基质效应明显，更无法检测相似活性物质的凝聚活性。

以上仅是本发明的优选实施方式，本发明的保护范围并不仅局限于上述实施例，与本发明构思无实质性差异的各种工艺方案均在本发明的保护范围内。

Claims (4)

1.一种测定血液中磷脂酰丝氨酸含量的方法，其特征在于：包括以下步骤：

(1)配制磷脂酰丝氨酸标准溶液；

(2)配制待测液；所述待测液的配制方法包括以下步骤：称取含有磷脂酰丝氨酸的待测样品，加入纯化水、分散剂和悬浮剂，所述纯化水的每微升体积、分散剂的每微升体积、悬浮剂的每毫克质量的比例为1000:1:5；

(3)采用双通道血栓弹力图仪器对步骤(1)中的磷脂酰丝氨酸标准品溶液进行测定，获得标准曲线方程，采用双通道血栓弹力图仪器对步骤(2)待测液进行测定，根据标准曲线方程确定待测液中磷脂酰丝氨酸的含量；采用所述双通道血栓弹力图仪器的测定方法为：开机预热10min，恒温池温度设定为30℃，室温控制在15～28℃之间，上机检测，获得MA值；

所述磷脂酰丝氨酸标准溶液的配制方法包括以下步骤：(1)配制磷脂酰丝氨酸标准曲线母液工作液M_L：称取磷脂酰丝氨酸，加入纯化水、分散剂和悬浮剂，使其溶解配成标准母液工作液；所述磷脂酰丝氨酸的每毫克质量与纯化水的每微升体积、分散剂的每微升体积、悬浮剂的每毫克质量的比例为10:1000:1:1；

(2)配制梯度稀释工作液：称取纯化水、分散剂和悬浮剂，所述纯化水的每微升体积与分散剂的每微升体积、悬浮剂的每毫克质量的比例为1000:1:1；

(3)配制磷脂酰丝氨酸标准曲线样本：采用梯度稀释工作液对磷脂酰丝氨酸标准母液进行稀释，并在每个稀释样本中加入定量质控品，所述质控品为猪冻干血浆；所述悬浮剂为阿拉伯胶、明胶、果胶或琼脂糖中的一种或多种；所述分散剂为吐温80、吐温60或吐温20，当分散剂为吐温20时，还需加入聚乙二醇辛基苯基醚，所述吐温20与聚乙二醇辛基苯基醚的体积比为1:0.5。

2.根据权利要求1所述的测定血液中磷脂酰丝氨酸含量的方法，其特征在于：所述磷脂酰丝氨酸标准曲线母液工作液M_L配制过程中的溶解方法包括将配制后的标准品溶液置于45-50℃水浴加热20-30min后，超声溶解配制成磷脂酰丝氨酸标准品溶液。

3.根据权利要求1所述的测定血液中磷脂酰丝氨酸含量的方法，其特征在于：还包括对标准曲线方程可靠性进行检测的方法，包括以下步骤：

(1)配制质控母液工作液M_Q：称取磷脂酰丝氨酸，加入纯化水、分散剂和悬浮剂，使其溶解配成质控母液工作液；所述磷脂酰丝氨酸的每毫克质量与纯化水的每微升体积、分散剂的每微升体积、悬浮剂的每毫克质量的比例为10:1000:1:1；

(2)配制梯度稀释工作液：称取纯化水、分散剂和悬浮剂，所述纯化水的每微升体积与分散剂的每微升体积、悬浮剂的每毫克质量的比例为1000:1：1；

(3)配制质控样本：采用梯度稀释工作液对质控母液工作液进行稀释，加入定量质控品；稀释浓度在磷脂酰丝氨酸标准曲线样本的稀释浓度范围内。

4.根据权利要求1所述的测定血液中磷脂酰丝氨酸含量的方法，其特征在于：所述磷脂酰丝氨酸标准溶液的配制方法包括以下步骤：

(1)配制磷脂酰丝氨酸标准曲线母液工作液M_L：称取0.1g磷酯酰丝氨酸，加入10mL纯化水和10μL吐温80、0.01g阿拉伯胶，45℃水浴30min，超声溶解配成母液工作液；

(2)配制梯度稀释工作液：100mL纯化水和100μL吐温80、0.1g阿拉伯胶，45℃水浴30min，超声溶解配成梯度稀释工作液；

(3)配制磷脂酰丝氨酸标准曲线样本：

1号样本：0μL质控母液工作液、1000μL梯度稀释工作液、质控品；

2号样本：5μL质控母液工作液、995μL梯度稀释工作液、质控品；

3号样本：10μL质控母液工作液、990μL梯度稀释工作液、质控品；

4号样本：20μL质控母液工作液、980μL梯度稀释工作液、质控品；

5号样本：50μL质控母液工作液、950μL梯度稀释工作液、质控品；

6号样本：100μL质控母液工作液、900μL梯度稀释工作液、质控品；

7号样本：200μL质控母液工作液、800μL梯度稀释工作液、质控品。

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