CN102703575B - 一种气泡上升法检测纤溶酶效价的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及制药技术领域，具体公开了一种气泡上升法检测纤溶酶效价的方法。所述方法选用pH6-9的三羟甲基氨基甲烷缓冲溶液作溶剂，用1-10BP单位/毫升的凝血酶溶液与1-10毫克/毫升的纤维蛋白原溶液制备底物，纤溶酶标准品用pH6-9的三羟甲基氨基甲烷缓冲溶液稀释成每1毫升中10-1000单位的标准品溶液，按所述方法制备制成标准回归曲线。供试品用pH6-9的三羟甲基氨基甲烷缓冲溶液稀释成每1毫升中约含10-1000单位的供试品溶液，同法测定，依据标准曲线计算供试品的效价。本发明消除了不同来源纤维蛋白原对纤溶酶效价测定的干扰，检验操作简便快速，测定结果准确可靠，解决了纤溶酶质量控制的关键技术方法，从而使纤溶酶产业化过程质量控制准确、稳定、可行。

Description

一种气泡上升法检测纤溶酶效价的方法

技术领域

本发明涉及制药技术领域，尤其涉及一种气泡上升法检测纤溶酶效价的方法。

背景技术

纤溶酶蛋白水解酶，是用于脑梗死、高凝血状态及血栓性脉管炎等外周血管疾病。本品作用于纤维蛋白原及纤维蛋白(血栓前体蛋白)，使其降解为小分子可溶片段，容易分解和从血循环中清除，从而产生去纤维蛋白效应；本品促使组织纤溶酶原激活物(t-PA)由内皮细胞释放，并增强其活性，故具抗血栓功能；本品可降低血小板聚集及血液黏度；本品还具有降低心肌耗氧量，改善微循环的功能。本品静脉注入人体内，3小时后血药浓度达到最高，药品本身及其降解产物均可通过血-脑脊液屏障，主要经肾脏、肝脏代谢后随尿液排出。

蛇毒纤溶酶的降纤抗凝、溶解血栓作用，早在二十世纪七十年代就有报道，但其成分复杂，含有多种毒素，极少量杂质成分的残留可能会产生致命反应。因此是否可以分离纯化获得单一活性成分，决定了蛇毒纤溶酶的应用前景。本公司经过十几年的努力，解决了这一技术难题，本公司研制的纤溶酶纯度高、无出血毒、神经毒、异常毒等毒性，具有降纤抗凝、溶解血栓等作用，且具有疗效好、再次梗塞率低的特点，是新一代理想抗血栓药物，并实现了纤溶酶的产业化生产。

为了保证一个药品能够安全有效地应用于临床，在研制过程中必须进行质量研究，制定出一系列的质量控制标准。对于纤溶酶来说，保证临床疗效的唯一并且关键技术方法决定于酶的活性，而评定酶的活性除了临床效果观察(药效学)之外，最主要的是要有一种准确、标准、稳定的酶活力检测方法。因此，研究一个操作简单、准确可靠而又稳定的评定酶活力的测定方法是该品实现产业化必不可少的重要环节。我们经过十多年的努力和反复试验发明了本方法。目前文献中使用的此类酶的效价测定有以下两种测定方法：

一、纤维蛋白平板法：纤维蛋白平板法是最早用于纤溶活性测定的方法之一，是将琼脂糖、血纤维蛋白原溶液和凝血酶溶液按一定比例混合，制成人工血栓平板。在平板上点上系列标准样和待测的样品，于37℃下恒温培养18h，测量酶在平板上产生的溶圈直径，然后以标准品浓度的对数为横坐标，以溶圈面积的对数为纵坐标，进行线性回归并绘出线性回归曲线，根据线性回归曲线求得所述供试品溶液的效价。该法优点是简便直观，但存在以下不足：

1、测定值易受平板均匀度、恒温孵育时间等因素的影响。

2、制板操作麻烦，平板的厚度和成分不容易均匀。

3、同一平板上检测的样品数量少。

4、反应时间长，不便于生产过程控制。

5、溶圈形状有时不规则，检测溶圈直径的误差大。

二、紫外分光光度法：即紫外分光光度法测定所生成的分解产物的吸光度变化。就是利用凝血酶将纤维蛋白原活化形成交联纤维蛋白，制成人工血栓，再加样品进行人工血栓分解，以紫外分光光度计测定所生成的分解产物的吸光度变化，计算出纤维蛋白溶解酶活性的方法。(在规定条件下，1分钟溶解1μg纤维蛋白(可凝固蛋白)为一个纤溶酶活力单位)。紫外分光光度法(国家药品标准WS-10001-(HD-0805)-2002)存在以下不足：

1、该法水解反应后多次洗涤剩余的纤维蛋白，洗涤过程中因胶块容易碎而丢失，影响检测结果。

2、操作繁琐、耗时长，不便于生产过程控制。

3、纤维蛋白原来源于动物血液，成分复杂、杂质量不确定，杂质不同程度地抑制纤溶酶效价，甚至不同批次的纤维蛋白原都将影响纤溶酶效价测定。

发明内容

为解决现有技术存在的问题，本发明提供了一种测定结果准确可靠、操作简单、快速，并克服了不同来源或不同批次纤维蛋白原对效价测定的干扰的气泡上升法检测纤溶酶效价的方法。

本发明所述气泡上升法检测纤溶酶效价的方法，其测定步骤为：

一、配制供试品溶液：取供试品纤溶酶适量，然后加入pH6-9的三羟甲基氨基甲烷缓冲溶液，根据供试品效价估计值将所述供试品纤溶酶稀释为每1毫升中含10-10000单位的溶液；

二、配制纤溶酶标准溶液：取纤溶酶标准品适量，加入pH6-9的三羟甲基氨基甲烷缓冲溶液稀释成每1毫升中含10-10000单位的至少两种不同浓度的标准品溶液；

三、测定方法：取若干试管，各精密加入1-10毫克/毫升的纤维蛋白原溶液0.1-1.0毫升，将各试管置于37±0.5摄氏度水浴中保温2-4分钟，然后在各试管中加入1-10BP单位/毫升的凝血酶溶液0.1-1.0毫升，同时精密加入步骤(二)所得标准品溶液或步骤(一)所得供试品溶液各0.1-1.0毫升，立即摇匀并计时，各试管中的反应物质在10秒内凝结，当凝块内的小气泡上升到反应系统体积的一半时，立即分别记时，然后以纤溶酶标准品浓度的对数为横坐标，以反应终点时间的对数为纵坐标，进行线性回归并绘出线性回归曲线，根据线性回归曲线求得所述供试品溶液的效价。

本发明所述气泡上升法检测纤溶酶效价的方法，其相比现有技术的有益效果是：

(一)经多次实验证明，本发明所述气泡上升法检测纤溶酶效价的方法，克服了纤维蛋白平板法测定值易受平板均匀度、恒温孵育时间、样品杂质等因素的影响以及制板操作麻烦，平板的厚度和成分不容易均匀等影响及紫外分光光度法不同批次或来源的纤维蛋白原对纤溶酶效价测定有干扰，致使测定结果不准确的缺点，本发明所述方法经多次证明不同批次或来源的纤维蛋白原不干扰纤溶酶效价的测定，从而测定结果不因外界条件而变化，结果更准确。

(二)本发明克服了纤维蛋白平板法及紫外分光光度法反应时间长、操作繁琐、耗时长等缺点，用简便、快捷的方法直接测量纤溶酶效价，且影响因素较少，便于生产过程的控制。

具体实施方式

下面将以具体实施例来详细说明本发明，在此本发明的示意性实施例以及说明用来解释本发明，但并不作为对本发明的限定。

本发明所用试验材料，纤溶酶标准品为自制，其余材料如无特别说明，均为市售购买产品。

本发明所述气泡上升法检测纤溶酶效价的方法，具体为：

一、配制供试品溶液：取供试品纤溶酶适量，然后加入pH6-9的三羟甲基氨基甲烷缓冲溶液，根据供试品效价估计值将所述供试品纤溶酶稀释为每1毫升中含10-10000单位的溶液；

二、配制纤溶酶标准溶液：取纤溶酶标准品适量，加入pH6-9的三羟甲基氨基甲烷缓冲溶液稀释成每1毫升中含10-10000单位的至少两种不同浓度的标准品溶液；

三、测定方法：取若干试管，各精密加入1-10毫克/毫升的纤维蛋白原溶液0.1-1.0毫升，将各试管置于37±0.5摄氏度水浴中保温2-4分钟，然后在各试管中加入1-10BP单位/毫升的凝血酶溶液0.1-1.0毫升，同时精密加入步骤(二)所得标准品溶液或步骤(一)所得供试品溶液各0.1-1.0毫升，立即摇匀并计时，各试管中的反应物质在10秒内凝结，当凝块内的小气泡上升到反应系统体积的一半时，立即分别记时，然后以纤溶酶标准品浓度的对数为横坐标，以反应终点时间的对数为纵坐标，进行线性回归并绘出线性回归曲线，根据线性回归曲线求得所述供试品溶液的效价。

实施例1：

本发明所用试验材料，纤溶酶标准品为自制，其余材料如无特别说明，均为市售购买产品。

试剂的配制：

pH7.6的三羟甲基氨基甲烷缓冲溶液：取三羟甲基氨基甲烷6.05克，加水500毫升溶解后，加0.1摩尔/升盐酸溶液360毫升，混匀，调节pH至7.6，加水至1000毫升。

2.5BP单位/毫升的凝血酶溶液：取凝血酶，加上述pH7.6的三羟甲基氨基甲烷缓冲溶液溶解并稀释成每1毫升中含2.5BP单位的溶液。。

2.5毫克/毫升的纤维蛋白原溶液：取纤维蛋白原，加上述pH7.6的三羟甲基氨基甲烷缓冲液溶解并稀释成每1毫升中含可凝固蛋白约2.5毫克的溶液。

标准品溶液的制备：取纤溶酶标准品，加上述pH7.6的三羟甲基氨基甲烷缓冲液分别稀释成每1毫升中50、100、150、200单位的溶液。

供试品溶液的制备：取纤溶酶供试品适量，根据效价的估计值，加上述pH7.6的三羟甲基氨基甲烷缓冲液稀释成每1毫升中含100单位的溶液。

供试品纤溶酶效价的测定方法：取试管若干支，各精密加入2.5mg/ml的纤维蛋白原溶液0.5ml，置37℃±0.5℃水浴中保温约3分钟，加入2.5BP单位/ml的凝血酶溶液0.5ml，同时精密加入上述标准品溶液各0.2ml，立即摇匀并计时。反应系统应在10秒内凝结，当凝块内小气泡上升到反应系统体积一半时作为反应终点，立即记时。每种浓度测3次，3次测定中最大值与最小值的差不得超过平均值的10％，求平均值。以纤溶酶标准品浓度的对数为横坐标，以反应终点时间的对数为纵坐标，进行线性回归。供试品溶液按上法测定，用线性回归方程求得供试品溶液的效价。

实施例2：

本发明所用试验材料，纤溶酶标准品为自制，其余材料如无特别说明，均为市售购买产品。

试剂的配制：

pH7.6的三羟甲基氨基甲烷缓冲溶液：取三羟甲基氨基甲烷6.05克，加水500毫升溶解后，加0.1摩尔/升盐酸溶液360毫升，混匀，调节pH至7.6，加水至1000毫升。

3BP单位/毫升的凝血酶溶液：取凝血酶，加上述pH7.6的三羟甲基氨基甲烷缓冲溶液溶解并稀释成每1毫升中含3BP单位的溶液。。

3毫克/毫升的纤维蛋白原溶液：取纤维蛋白原，加上述pH7.6的三羟甲基氨基甲烷缓冲液溶解并稀释成每1毫升中含可凝固蛋白约3毫克的溶液。

标准品溶液的制备：取纤溶酶标准品，加上述pH7.6的三羟甲基氨基甲烷缓冲液分别稀释成每1毫升中50、100、150、200单位的溶液。

供试品溶液的制备：取纤溶酶供试品适量，根据效价的估计值，加上述pH7.6的三羟甲基氨基甲烷缓冲液稀释成每1毫升中含100单位的溶液。

供试品纤溶酶效价的测定方法：取试管若干支，各精密加入3.0mg/ml的纤维蛋白原溶液0.5ml，置37℃±0.5℃水浴中保温约3分钟，加入3.0BP单位/ml的凝血酶溶液0.5ml，同时精密加入上述标准品溶液各0.2ml，立即摇匀并计时。反应系统应在10秒内凝结，当凝块内小气泡上升到反应系统体积一半时作为反应终点，立即记时。每种浓度测3次，3次测定中最大值与最小值的差不得超过平均值的10％，求平均值。以纤溶酶标准品浓度的对数为横坐标，以反应终点时间的对数为纵坐标，进行线性回归。供试品溶液按上法测定，用线性回归方程求得供试品溶液的效价。

实施例3：

本发明所用试验材料，纤溶酶标准品为自制，其余材料如无特别说明，均为市售购买产品。

试剂的配制：

pH7.8的三羟甲基氨基甲烷缓冲溶液：取三羟甲基氨基甲烷适量，加水500毫升溶解后，加0.1摩尔/升盐酸液适量，混匀，调节pH至7.8，加水至1000毫升。

8BP单位/毫升的凝血酶溶液：取凝血酶，加上述pH7.8的三羟甲基氨基甲烷缓冲溶液溶解并稀释成每1毫升中含8BP单位的溶液。。

8毫克/毫升的纤维蛋白原溶液：取纤维蛋白原，加上述pH7.8的三羟甲基氨基甲烷缓冲液溶解并稀释成每1毫升中含可凝固蛋白约8毫克的溶液。

标准品溶液的制备：取纤溶酶标准品，加上述pH7.8的三羟甲基氨基甲烷缓冲液分别稀释成每1毫升中50、100、150、200单位的溶液。

供试品溶液的制备：取纤溶酶供试品适量，根据效价的估计值，加上述pH7.8的三羟甲基氨基甲烷缓冲液稀释成每1毫升中含100单位的溶液。

供试品纤溶酶效价的测定方法：取试管若干支，各精密加入8.0mg/ml的纤维蛋白原溶液0.5ml，置37℃±0.5℃水浴中保温约3分钟，加入8.0BP单位/ml的凝血酶溶液0.5ml，同时精密加入上述标准品溶液各0.2ml，立即摇匀并计时。反应系统应在10秒内凝结，当凝块内小气泡上升到反应系统体积一半时作为反应终点，立即记时。每种浓度测3次，3次测定中最大值与最小值的差不得超过平均值的10％，求平均值。以纤溶酶标准品浓度的对数为横坐标，以反应终点时间的对数为纵坐标，进行线性回归。供试品溶液按上法测定，用线性回归方程求得供试品溶液的效价。

下面我们采用优选的实施例1或实施例2或实施例3来测定纤溶酶效价，比较不同批次或来源的纤维蛋白原对本发明所述方法及紫外分光光度法测定的结果的影响。

采用本发明所述效价测定法，用若干种不同批次或来源的纤维蛋白原测定同一批次纤溶酶。结果见表一。

表一使用本发明所述气泡上升法用不同批次或来源的纤维蛋白原测定同一批次纤溶酶效价的结果

以表一结果看出，不同批次的纤维蛋白原检测纤溶酶效价，结果相差最大的只有0.38，表明不同批次或来源的纤维蛋白原不干扰纤溶酶效价测定，测定结果因不受外界因素影响，因此结果比较准确。

我们就上述若干种不同批次或来源的纤维蛋白原再用现有国家标准的紫外分光光度法(国家药品标准WS-10001-(HD-0805)-2002)测定同一批次纤溶酶，步骤为：

(1)试剂的配制

pH7.8的三羟甲基氨基甲烷缓冲液：取三羟甲基氨基甲烷2.42克，氯化钠4.06克，加水400毫升溶解，用4摩尔/升盐酸溶液调pH至7.8，加水至500毫升。

实验缓冲液：取pH7.8的三羟甲基氨基甲烷缓冲液、0.7％氯化钙溶液和0.9％氯化钠溶液以1∶2∶4体积混匀，即得。

凝血酶溶液：取凝血酶，加pH7.8的三羟甲基氨基甲烷缓冲液溶解并稀释成每1毫升中含5BP单位的溶液。

纤维蛋白原溶液：取纤维蛋白原，加pH7.8的三羟甲基氨基甲烷缓冲溶液溶解并定量稀释成每1毫升中含可凝固蛋白约5.0毫克的溶液。

(2)供试品溶液的制备：取本品适量，加pH7.8的三羟甲基氨基甲烷缓冲液稀释至每1毫升l中含15BP单位的溶液。

(3)测定法：取离心管，各精密加入实验缓冲液0.2毫升，供试品溶液0.1毫升，置37摄氏度水浴中预热2分钟，加凝血酶溶液0.1毫升，纤维蛋白原溶液0.1毫升，立即振摇数秒，混匀，置37摄氏度水浴中准确反应30分钟，置冰水浴中终止反应，离心(14000转/分钟)4分钟，纤维蛋白成片状贴于离心管底部，小心吸出液体，用水1～2毫升洗涤并离心(14000转/分钟)4分钟，同法操作3次，小心将液体吸干，在残留物中精密加入.2摩尔/升氢氧化钠溶液3毫升，水浴加热8分钟，待纤维蛋白完全溶解，冷却后，以0.2摩尔/升氢氧化钠为空白，照分光光度法(中国药典2010年版二部附录IV A)，在280纳米波长处测定吸收度A。同时以pH7.8的三羟甲基氨基甲烷缓冲液0.1毫升代替供试品溶液同法操作测得As，作为空白对照。按下式计算供试品的活力单位。

式中As——空白对照的吸收度；

A——供试品溶液的吸收度；

Ws——纤维蛋白原溶液0.1毫升中含可凝蛋白的微克数；

W——供试品取样量，毫升

n——供试品稀释倍数；

30——反应时间，分钟；

0.1——供试品溶液容积，毫升。

纤溶酶活力单位定义：在上述条件下，1分钟溶液1微克纤维蛋白(可凝固蛋白)为一个纤溶酶活力单位。

测定结果如表二：

表二使用紫外分光光度法用不同批次或来源的纤维蛋白原测定同一批次纤溶酶效价的结果

由表二结果看出，不同批次的纤维蛋白原测定纤溶酶效价结果最小的相差都有33.2，结果不精确，表明用紫外分光光度法测定溶酶效价，不同批次或来源的纤维蛋白原干扰纤溶酶效价的测定，测定结果不准确。

综上所述，本发明所述气泡上升法检测纤溶酶效价的方法，其相比现有技术的有益效果是：

(一)经多次实验证明，本发明所述气泡上升法检测纤溶酶效价的方法，克服了纤维蛋白平板法测定值易受平板均匀度、恒温孵育时间、样品杂质等因素的影响以及制板操作麻烦，平板的厚度和成分不容易均匀等影响，以及紫外分光光度法不同批次或来源的纤维蛋白原对纤溶酶效价测定有干扰，致使测定结果不准确的缺点，本发明所述方法经多次证明不同批次或来源的纤维蛋白原不干扰纤溶酶效价的测定，从而测定结果不因外界条件而变化，结果更准确。

(二)本发明克服了纤维蛋白平板法及紫外分光光度法反应时间长、操作繁琐、耗时长等缺点，用简便、快捷的方法直接测量纤溶酶效价，且影响因素较少，便于生产过程的控制。

以上对本发明实施例所提供的技术方案进行了详细介绍，本文中应用了具体个例对本发明实施例的原理以及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明只适用于帮助理解本发明实施例的原理；同时，对于本领域的一般技术人员，依据本发明实施例，在具体实施方式以及应用范围上均会有改变之处，综上所述，本说明书内容不应理解为对本发明的限制。

Claims (5)

1.一种气泡上升法检测纤溶酶效价的方法，其特征在于，所述方法为：

一、配制供试品溶液：取供试品纤溶酶适量，然后加入pH6-9 的三羟甲

基氨基甲烷缓冲溶液，根据供试品效价估计值将所述供试品纤溶酶稀释为每1

毫升中含50-200 单位的溶液；

二、配制纤溶酶标准品溶液：取纤溶酶标准品适量，加入pH6-9 的三羟

甲基氨基甲烷缓冲溶液稀释成每1 毫升中含50-200 单位的至少两种不同浓

度的标准品溶液；

三、测定方法：取若干试管，各精密加入1-10 毫克/毫升的纤维蛋白原溶

液0.1-1.0 毫升，将各试管置于37±0.5 摄氏度水浴中保温2-4 分钟，然后在

各试管中加入1-10BP 单位/毫升的凝血酶溶液0.1-1.0 毫升，同时精密加入步

骤（二）所得标准品溶液或步骤（一）所得供试品溶液0.1-1.0 毫升，立即摇

匀并计时，各试管中的反应物质在10 秒内凝结，当凝块内的小气泡上升到反

应系统体积的一半时，立即分别记时，然后以纤溶酶标准品浓度的对数为横

坐标，以反应终点时间的对数为纵坐标，进行线性回归并绘出线性回归曲线，

根据线性回归曲线求得所述供试品溶液的效价。

2.根据权利要求1 所述的气泡上升法检测纤溶酶效价的方法，其特征在

于：

所述步骤（三）为： 取试管若干支，各精密加入2.5mg/ml 的纤维蛋白

原溶液0.5ml，置37℃±0.5℃水浴中保温约3 分钟，加入2.5BP 单位/ml 的凝

血酶溶液0.5ml，同时精密加入步骤（二）所述标准品溶液或步骤（一）所述

供试品溶液各0.2ml，立即摇匀并计时，反应系统应在10 秒内凝结，当凝块

内小气泡上升到反应系统体积一半时作为反应终点，立即记时，每种浓度测3

次，3 次测定中最大值与最小值的差不得超过平均值的10%，求平均值，以纤

溶酶标准品浓度的对数为横坐标，以反应终点时间的对数为纵坐标，进行线

性回归，用线性回归方程求得供试品溶液的效价。

3.根据权利要求1 所述的气泡上升法检测纤溶酶效价的方法，其特征

在于：所述pH6-9 的三羟甲基氨基甲烷缓冲溶液配制方法为：取三羟甲基氨

基甲烷适量，加水500 毫升溶解后，加0.1 摩尔/升盐酸溶液适量，混匀，调

节pH 至6-9，再加水稀释至1000 毫升。

4.根据权利要求1 所述的气泡上升法检测纤溶酶效价的方法，其特征

在于：所述1-10BP 单位/毫升的凝血酶溶液的配制方法为：取凝血酶，加入

pH 6-9 三羟甲基氨基甲烷缓冲溶液溶解并稀释成每1 毫升中含1-10BP 单位的

溶液。

5.根据权利要求1 所述的气泡上升法检测纤溶酶效价的方法，其特征

在于：所述1-10 毫克/毫升的纤维蛋白原溶液的配制方法为：取纤维蛋白原，

加pH 6-9 的三羟甲基氨基甲烷缓冲液溶解并稀释成每1 毫升中含可凝固蛋白

1-10 毫克的溶液。