CN104166004A - 凝血因子ⅷ质控品制备方法 - Google Patents

凝血因子ⅷ质控品制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及临床凝血检验制剂的制备方法，具体凝血因子VIII质控品制备方法，用物理化学方法处理多人份混合血浆，特异性灭活多人份混合血浆中的凝血因子VIII得到缺乏凝血因子VIII血浆；再将多人份混合血浆与缺乏凝血因子VIII血浆按照一定比例混合，制备成凝血因子VIII含量为不同浓度水平的凝血因子VIII质控品，加入冻干保护剂，分装，冷冻干燥，获得凝血因子VIII质控品。本发明制备的凝血因子VIII质控品，其产品均一性、稳定性及冻干品复融后稳定性好，可代替进口产品用于凝血因子VIII检测的质量控制，有利于降低检测成本，提升我国对凝血因子VIII检测的能力。

Description

凝血因子Ⅷ质控品制备方法
技术领域
本发明涉及临床凝血检验制剂的制备方法，具体凝血因子VIII质控品制备方法。 
背景技术
凝血因子VIII促凝活性测定适用于血友病A患者确诊、血友病治疗效果评估、其他出凝血疾病鉴别诊断以及各大采供血机构、血液制品厂凝血因子VIII浓缩制剂质量评价。用于凝血因子VIII促凝活性检测的试剂、仪器较多，不同的试剂和检测仪器、检测原理各不相同，使用凝血因子VIII质控品对凝血因子VIII检验进行室内、室间质量控制非常重要。 
目前临床实验室使用的凝血质控物为多参数凝血质控品，其异常值凝血质控品包括凝血因子VIII在内的多个凝血因子均为异常水平，与病理样本不同可能影响凝血因子VIII测定结果的准确性。 
国内凝血质控品几乎被国外试剂垄断，产品价格昂贵且水平单一，无法满足临床检验多活性水平的需求，因此，研发生产国内自主品牌的多个浓度水平的凝血因子VIII质控品有重大意义。 
发明内容
针对上述技术问题，本发明提供一种制备凝血因子VIII质控品的方法及获得凝血因子VIII质控品。本发明方法制备的凝血因子VIII质控品为凝血因子VIII多个浓度水平，且其它凝血因子含量在正常范围；该产品均一性和稳定性较好，满足临床对凝血因子VIII质控品的质量控制要求，可以更准确地监测病理样本检测结果的准确性。 
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：凝血因子VIII质控品制备方法，包括以下步骤： 
(1)将人静脉采集的血液与抗凝剂以体积比为9∶1加入混合，在2℃～8℃条件下离心15分钟，转速2500rpm，分离吸取上层血浆，将多人份分离后的上层血浆混合，即得多人份混合血浆；抗凝剂为枸橼酸三钠溶液，其浓度为0.109mol/L。 
(2)每1000毫升多人份混合血浆中加入2～10克乙二胺四乙酸二钠；37℃温浴 1～2小时； 
(3)上述处理后血浆于透析液中2℃～8℃透析24小时，透析液为氯化钠5～10g/L、咪唑2～5g/L，pH7.2；透析液与血浆体积比为50～100∶1，12小时换透析液一次； 
(4)透析后的血浆在2℃～8℃条件下离心30分钟，转速2500rpm，得到缺乏凝血因子VIII血浆； 
(5)将缺乏凝血因子VIII血浆与多人份混合血浆按照要求比例混合，即可制备成不同浓度水平的凝血因子VIII质控品。 
(6)将制备的凝血因子VIII质控品加入冻干保护剂，分装，冷冻干燥。加入的冻干保护剂包括质量比例占凝血因子IX质控品的0.5～2％Hepes、1～5％甘氨酸、1～5％蔗糖。 
本发明制备的凝血因子VIII质控品，其产品均一性、稳定性及冻干品复融后稳定性好，可代替进口产品用于凝血因子VIII检测的质量控制，有利于降低检测成本，提高我国对凝血因子VIII检测的能力。 
具体实施方式
结合实施例，进一步阐述本发明： 
实施例以制备活性为30％的凝血因子VIII质控品为例。 
(1)将人静脉采集的血液与抗凝剂以体积比为9∶1加入混合，在2℃～8℃条件下离心15分钟，转速2500rpm，分离吸取上层血浆，将多人份血浆混合，即得多人份混合血浆；抗凝剂为枸橼酸三钠溶液，其浓度为0.109mol/L； 
(2)每1000毫升多人份混合血浆中加入2～10克乙二胺四乙酸二钠；37℃温浴1～2小时； 
(3)上述处理后血浆于透析液中2～8℃透析24小时，透析液为氯化钠5～10g/L、咪唑2～5g/L，pH7.2；透析液与血浆体积比为50～100∶1，12小时换透析液一次； 
(4)透析后的血浆在2℃～8℃条件下离心30分钟，转速2500rpm，得到缺乏凝血因子VIII血浆； 
(5)将缺乏凝血因子VIII血浆与多人份混合血浆按照要求比例混合，即可制备成不同浓度水平的凝血因子VIII质控品。 
(6)将制备的凝血因子VIII质控品加入冻干保护剂，分装，冷冻干燥。加入的 冻干保护剂包括1％Hepes、2％甘氨酸、2％蔗糖。 
产品性能检验测试： 
(1)产品活性检测 
使用Sysmex CA-1500全自动血凝仪及配套凝血因子VIII检测试剂对实施例凝血因子VIII缺乏血浆凝血因子活性进行检测。 
表1凝血因子VIII质控品的凝血因子活性测定表 
检测项目 F II FV FVII FX FVIII FIX FXI FXII
因子活性(％) 102.6 70.2 89.5 96.2 1.5 94.5 100.6 89.7
由上表可知，本制备方法所得产品特异性好，能够特异性的灭活凝血因子VIII而对其它凝血因子含量基本无影响。 
(2)产品均一性测定 
在实施例制备的凝血因子VIII质控品中分别随机抽取10支，进行准确的复溶重建。 
使用Sysmex CA-1500全自动血凝仪及配套凝血因子VIII检测试剂对实施例凝血因子VIII质控品活性进行检测，结果依次如下：百分活性(％)31.5、31.2、30.6、29.8、30.5、30.8、29.5、30.2、30.3、29.6，平均值30.4。 
取实施例制备的凝血因子VIII质控品3瓶，进行准确的复溶重建，混合后连续检测凝血因子VIII活性10次，结果如下：百分活性(％)31.6、30.8、31.3、30.2、31.5、30.3、30.1、31.1、30.0、29.8；平均值30.7。 
经计算得，实施例凝血因子VIII质控品瓶间重复性CV值CV瓶间为2.16％，说明该水平凝血因子VIII质控品达到临床试验对于质控品均一性的通用要求(批内瓶间CV≤5.0％)。 
(3)产品冻干品稳定性检测 
将实施例制备的凝血因子VIII质控品和SIEMENS P质控品置于室温(20℃-25℃)和37℃保存，分别于1天、2天、3天、4天、5天、6天和7天取样，同时进行准确的复溶重建。 
使用Sysmex CA-1500全自动血凝仪及配套凝血因子VIII检测试剂对实施例凝血因子VIII质控品活性进行检测，结果如下： 
表2冻干品室温和37℃稳定性 
实施例凝血因子VIII质控品无论是置于室温还是37℃放置7天，放置前后活性波动范围＜5％，与市售进口SIEMENS异常质控血浆相当，可以认为本发明制备的凝血因子VIII质控品室温、37℃放置7天是稳定的。 
(4)产品复溶稳定性检测 
将实施例制备的凝血因子VIII质控品和SIEMENS P质控品进行准确的复溶重建，分成两份分别置于2℃-8℃和室温(20℃-25℃)保存，每隔一定时间取样进行凝血因子VIII活性检测。 
用Sysmex CA-1500全自动血凝仪及配套凝血因子VIII检测试剂对实施例凝血因子VIII质控品活性进行检测，结果如下： 
表3复溶稳定性 
实施例凝血因子VIII质控品复溶后，置于2℃～8℃和室温条件下，FVIII：C随着放置时间的延长稍有降低，但在6小时内降低波动＜10％，与市售进口SIEMENS异常质控血浆相当。可以认为本产品复溶后2℃～8℃和室温存放6小时内可保持稳定。由此可见，本发明制备的凝血因子VIII具有较好的开瓶稳定性。 
以上所述仅是以一个浓度水平为例，是本发明的优选实施方式，本发明保护的是整个技术过程和产品，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。 

Claims (4)

1.凝血因子VIII质控品制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
(1)将人静脉采集的血液与浓度为0.109mol/L的枸橼酸三钠抗凝剂以体积比为9∶1混合，在2℃～8℃条件下离心，转速2500rpm，分离吸取上层血浆，将多人份分离后的上层血浆混合，即得多人份混合血浆；
(2)多人份混合血浆中加入乙二胺四乙酸二钠；37℃温浴1～2小时；
(3)上述处理后血浆于透析液中2℃～8℃透析24小时，12小时换透析液一次；
(4)透析后的血浆在2℃～8℃条件下离心，转速2500rpm，离心30分钟得到缺乏凝血因子VIII血浆；
(5)将缺乏凝血因子VIII血浆与多人份混合血浆按照要求比例混合，即制备成不同浓度水平的凝血因子VIII质控品；
(6)将制备的凝血因子VIII质控品加入冻干保护剂，分装，冷冻干燥。
2.根据权利要求1所述的凝血因子VIII质控品制备方法，其特征在于：每1000毫升多人份混合血浆中加入2～10克乙二胺四乙酸二钠。
3.根据权利要求1所述的凝血因子VIII质控品制备方法，其特征在于：所述的透析液为氯化钠5～10g/L、咪唑2～5g/L，pH7.2；透析液与血浆体积比为50～100∶1。
4.根据权利要求1所述的凝血因子VIII质控品制备方法，其特征在于：所述的冻干保护剂包括质量比例占凝血因子IX质控品的0.5～2％Hepes、1～5％甘氨酸、1～5％蔗糖。
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