CN102286095A - 纤维蛋白原的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种生产过程中溶解速度快，生产周期短，临床使用时复溶快，生物学活性好和临床使用安全性高，且收得率高的纤维蛋白原的制备方法。本发明在上清抗凝血浆加入助剂，本发明相对于现有技术具有如下优点：1、本发明所提供的制造方法，提取效率高。2、本发明所采用的助剂，能提高纤维蛋白原制品的质量，在病毒灭活和冷乙醇沉降过程中起到保护纤维蛋白原以及凝血因子XIII的生物学活性的作用；3、在本发明的工艺过程中，纤维蛋白原的工艺复溶时间缩短为10分钟左右。4、本发明冻干制品的复溶时间为30秒以内，为临床上及时抢救病人的生命赢得了宝贵的时间。
Description
技术领域
本发明涉及医药生物工程领域，尤其涉及一种以人类血液或哺乳动物血液为原料制备医用生物胶二元组分中的纤维蛋白原的方法。
背景技术
目前国内外的纤维蛋白原主要从人血浆及动物血浆中提取制备，临床上使用时再经凝血酶催化，血纤维蛋白原中血纤维肽A和B的断裂，转变成血纤维蛋白凝胶，通过凝胶中活化的凝血因子XIII的交联作用，纤维蛋白凝胶进一步共价交联成不溶的血纤维蛋白凝块。
本发明中所称的医用生物胶(fibrin glue)是一种生物止血粘合剂，由纯化了的人或动物血纤维蛋白原和人或动物血凝血酶以及钙离子混合调制而成。以纤维蛋白原和凝血酶为二元组分的医用生物胶在临床上应用广泛，可形成各种形态，或粘结、或喷涂、或填充，因而广泛为临床所接受，现已应用于多种临床病症的止血和伤口愈合等领域，包括心血管和神经修复、粘接，肝肺切除术中的止血以及整形外科，口腔外科和皮肤移植等各个领域，且无毒副作用。
本发明所制备的纤维蛋白原是一种糖蛋白，其制备方法参见公开号为CN1138483A的《纤维蛋白原复合物及其制备方法》以及公开号为CN1408441A的《一种冻干人纤维蛋白胶的生产工艺》，一般包括六个基本步骤，即血浆血球分离、病毒灭活、冷乙醇一次沉降和一次溶解、冷乙醇二次沉降和二次溶解，二次溶解后进行分装和冻干，最后经干热病毒灭活和钴-60辐照(纤维蛋白原医用制剂)。但是上述工艺存在以下缺陷：
1、生产的过程中一次溶解与二次溶解的时间长达数小时，这个过程中容易导致细菌等微生物繁殖，从而增加产品中热原等毒素的含量；溶解时间过长也容易造成其他有害物质的污染，同时延长生产周期，增加成本；
2、上述工艺制得的产品，在使用时复溶时间过长，不便于使用，特别在急救中分秒必争的情况下十分不利；
为克服上述缺点，有人对上述技术进行了改进。例如
申请号为200880017128.1，名称为《用于制备纤维蛋白胶的含有浓缩纤维蛋白原的组合物和相关系统的制备方法》的中国专利申请；
申请号为200810046747.5名称为《人纤维蛋白原制剂的制备方法》的中国专利申请；
申请号为200910237204.6名称为《人纤维蛋白原的生产方法》的中国专利申请。
上述专利对生产工艺的改进主要在以下两点：
1、在制备过程中加入一些助剂成分；
2、在冻干过程中加入一些助剂成分；
虽然在经过上述改进之后溶解度速度有所提高，但是仍然无法达到令人满意的纯度与复溶速度。
发明内容
本发明的目的在于提供一种生产过程中溶解速度快，生产周期短，使用时复溶快，生物学活性好，且收得率高的纤维蛋白原的制备方法。
为解决上述技术问题，本发明提供了一种纤维蛋白原的制备方法，依次包括以下几个步骤：
(1)向血液中加入抗凝剂；
(2)离心分离，取上清抗凝血浆；
(3)对步骤(2)所得的上清抗凝血浆加入助剂，再加入磷酸三丁酯和吐温-80作为病毒灭活剂，进行S/D病毒灭活；
将灭活后的血浆离心分离，弃去沉淀物，取清液；
(4)一次沉降：将步骤(3)所得清液预冷至0～4℃，进行离心分离，弃去沉淀物，取清液加入冷乙醇，沉降血浆中的纤维蛋白原，所述冷乙醇的温度为-20℃；
(5)分离并收集步骤(4)中一次沉降得到的纤维蛋白原一次沉淀物，用0～4℃，质量浓度0.3％～0.6％w/v的NaCl水溶液对步骤(4)中一次沉降得到的纤维蛋白原一次沉淀物进行洗涤，弃去洗涤液；
(6)一次溶解：对步骤(5)中洗涤后的纤维蛋白原一次沉淀物加入一次溶解剂和助剂，36～38℃水浴加热并搅拌条件下，将步骤(5)收集得到的纤维蛋白原一次沉淀物溶解，去除不溶物，收集一次溶解清液；该助剂与病毒灭活剂的助剂相同。
因为一次溶解后还要加乙醇沉降，加入助剂也是为了保护凝血因子。
(7)二次沉降：将步骤(6)得到的一次溶解清液预冷至0～4℃后，向一次上清液中加入冷乙醇沉降一次溶解清液中的纤维蛋白原，所述冷乙醇的温度为-20℃；
(8)分离并收集步骤(7)中二次沉降得到的纤维蛋白原二次沉淀物，用0～4℃，质量浓度0.3％～0.6％w/v的NaCl水溶液对步骤(4)中二次沉降得到的纤维蛋白原二次沉淀物进行洗涤，弃去洗涤液；
(9)二次溶解：对步骤(8)中洗涤后的的纤维蛋白原二次沉淀物加入二次溶解剂，36～38℃水浴加热并搅拌条件下，将纤维蛋白原二次沉淀物溶解，去除不溶物，收集二次溶解清液；
(10)向步骤(9)得到的二次溶解清液中加入冻干保护剂，冻干，得到纤维蛋白原冻干制品。
本发明在病毒灭活后，一次沉淀前，进行离心，去除沉淀物，再进行降温，再离心，去除沉淀物。
发明人在实际生产实践中发现，由于S/D病毒灭活剂在病毒灭活时的同时，对血浆中的各种蛋白也有一定程度的破坏，并导致血浆中部分蛋白质发生变性，产生多种不溶物，这些不溶物经发明人研究发现，对产品质量，尤其是复溶速度与产品纯度具有不利影响，因此在灭活后加入离心分离步骤。
此外发明人还发现经过上述离心分离后的清液，经过冷冻后仍然将产生部分对产品复溶速度与纯度不利的沉淀物，此类沉淀物一般为对温度不稳定的杂蛋白，如不及时去除，对产品也将有不利影响。
此外本发明对一次沉淀、二次沉淀的沉淀物用冷NaCl溶液洗涤。
采用冷NaCl溶液作为洗涤剂的作用是洗掉一次沉淀里的残余的S/D灭活剂、酒精和杂蛋白；采用低温洗涤剂是因为，温度高了，洗涤剂会溶解纤维蛋白原。
类似的原理，采用冷NaCl溶液作为洗涤剂的作用是洗掉二次沉淀里的酒精和杂蛋白。
因为夹杂在沉淀中的S/D灭活剂、酒精、杂蛋白等对产品的复溶速度与品质同样有不利影响。
本发明相对于现有技术具有如下优点：
1、本发明所提供的制造方法，提取效率高。一般每升血浆能提取3.5克以上的纤维蛋白原产品。所得纤维蛋白原产品纯度较高，纯度一般能达到85％以上；
2、本发明所采用的助剂，能提高纤维蛋白原制品的质量，在病毒灭活和冷乙醇沉降过程中起到保护纤维蛋白原以及凝血因子XIII的生物学活性的作用；
3、在本发明的工艺过程中，纤维蛋白原的工艺复溶时间由一般工艺的2小时(37℃左右水浴)，缩短为10分钟左右(37℃左右水浴)。工艺复溶时间的缩短，降低了工艺制备过程中细菌繁殖的可能性，从而降低了产品中的热原，增强了纤维蛋白原制品临床使用上的安全性；
4、本发明冻干制品的复溶时间为30秒以内(37℃水浴)，冻干制品复溶时间(一般纤维蛋白原同类冻干制品复溶时间在2分钟以上)的缩短，为临床上及时抢救病人的生命赢得了宝贵的时间。
作为本发明的优选技术方案，所述的血液为无菌采集的猪血液或人血液。
作为本发明的优选技术方案，所述抗凝剂为柠檬酸三钠或草酸钾。
作为本发明的更优选技术方案，单独使用柠檬酸三钠为抗凝剂时，柠檬酸三钠溶液的浓度为3.8％w/v，柠檬酸三钠溶液与血液的体积比为1∶7～1∶9；
单独使用草酸钾为抗凝剂时，草酸钾溶液的浓度为2.5％w/v，草酸钾溶液与血液的体积比为1∶7～1∶9。
作为本发明的优选技术方案，步骤(3)中，所述助剂为氨基酸、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、山梨醇、葡萄糖酸钠、柠檬酸三钠、EDTA中的一种或几种，所述氨基酸是谷氨酸、赖氨酸、丙氨酸、组氨酸、蛋氨酸、甘氨酸、精氨酸、L-亮氨酸、L-异亮氨酸中的一种或几种；
作为本发明的优选技术方案，步骤(3)中所述助剂的添加浓度为0.1～5.0％w/v；
作为本发明的优选技术方案，对步骤(2)所得的上清抗凝血浆加入助剂的同时加入S/D病毒灭活剂，并在25℃下进行病毒灭活6小时。
作为本发明的优选技术方案，所述冷乙醇的浓度为50～95％v/v，步骤(4)与步骤(7)中纤维蛋白原沉降时，乙醇的加入浓度为沉降反应体系总量的8％～10％v/v。
作为本发明的优选技术方案，所述一次溶解剂与二次溶解剂为含有氯化钠的缓冲液，所述缓冲液的缓冲对为磷酸氢二钠-磷酸二氢钠、碳酸钠-碳酸氢钠或柠檬酸三钠-柠檬酸。
作为本发明的更优选技术方案，所述一次溶解剂与二次溶解剂的氯化钠浓度为0.2％～3.0％w/v(w/v为重量体积比)，缓冲对的浓度为0.01mol/L～0.5mol/L，pH值为7.0～7.5。
作为本发明的优选技术方案，所述冻干保护剂选自多羟基碳水化合物、柠檬酸三钠、氯化钠、氨基酸中的一种或几种。
作为本发明的更优选技术方案，所述多羟基碳水化合物选自蔗糖、海藻糖、葡萄糖、甘露醇、山梨醇中的一种或几种；
所述的氨基酸选自谷氨酸、赖氨酸、丙氨酸、组氨酸、蛋氨酸、甘氨酸、精氨酸、L-亮氨酸、L-异亮氨酸中的一种或几种。
作为本发明的更优选技术方案，所述的冻干保护剂为多羟基碳水化合物、柠檬酸三钠、氯化钠和氨基酸，其中，多羟基碳水化合物的浓度为0.1％～5％w/v，柠檬酸三钠的浓度为0.1％～2％w/v，氯化钠的浓度为0.1％～0.9％w/v，氨基酸的浓度为0.1％～5％w/v。
作为本发明的更优选技术方案，在步骤(10)后还依次包括：
(11)将步骤(10)中的纤维蛋白原冻干制品进行分装、真空度检测和轧盖后，在98～100℃水浴保温30分钟的条件下对纤维蛋白原制品中的非脂包膜病毒进行干热病毒灭活；
(12)将步骤(11)热灭活后的纤维蛋白原制品进行钴-60辐照，得到医用纤维蛋白原无菌制品。
附图说明
图1为本发明具体实施方式所述纤维蛋白原的制备方法的流程图。
具体实施方式
本发明实施例中所采用的原血浆均来自于同一天经无菌采集的血浆，加入3.8％w/v的柠檬酸三钠无菌无热原抗凝剂20000ml，无菌血液采集总量约为180000ml，按实施例1、2和3中的使用要求分三次实验进行。
实施例1工艺所有操作均在无菌万级净化区中进行，其中分装和冻干操作均在局部百级净化区进行，所进行的操作均符合洁净区操作要求。生产规格为2.5ml。
(1)取无菌采集的猪血液10000ml；
(2)离心分离，取上清抗凝血浆5500ml；
(3)对步骤(2)所得的上清抗凝血浆加入2.5％w/v的葡萄糖和0.38％w/v的柠檬酸三钠作为助剂，再加入0.3％w/v磷酸三丁酯和1％w/v吐温-80作为病毒灭活剂，25℃下进行病毒灭活6小时；
将灭活后的血浆离心分离，弃去沉淀物，取清液；
(4)一次沉降：将经步骤(3)所得清液预冷至0～4℃，进行离心分离，弃去沉淀物，取清液加入冷乙醇(95％v/v)500ml沉降血浆中的纤维蛋白原；所述冷乙醇的温度为-20℃；
(5)分离并收集步骤(4)中一次沉降得到的纤维蛋白原一次沉淀物，用0～4℃，质量浓度0.3％～0.6％w/v的NaCl水溶液对步骤(4)中一次沉降得到的纤维蛋白原一次沉淀物进行洗涤，弃去洗涤液；
(6)一次溶解：对步骤(5)中洗涤得到的纤维蛋白原一次沉淀物加入一次溶解剂(1.3％w/v氯化钠，助剂：2.5％w/v的葡萄糖和0.01mol/L的柠檬酸三钠，pH7.0)1600ml，于36～38℃水浴加热并搅拌条件下，将步骤(5)收集得到的纤维蛋白原一次沉淀物溶解，去除不溶物，收集一次溶解清液1750ml；
(7)二次沉降：将步骤(6)得到的一次溶解清液预冷至0～4℃后，向一次上清液中加入冷乙醇(95％v/v)160ml沉降一次溶解清液中的纤维蛋白原，所述冷乙醇的温度为-20℃；
(8)分离并收集步骤(7)中二次沉降得到的纤维蛋白原二次沉淀物；用0～4℃，质量浓度0.3％～0.6％w/v的NaCl水溶液对步骤(4)中二次沉降得到的纤维蛋白原二次沉淀物进行洗涤，弃去洗涤液；
(9)二次溶解：对步骤(8)中洗涤得到的纤维蛋白原二次沉淀物加入二次溶解剂(0.75％w/v氯化钠和0.010mol/L柠檬酸三钠-柠檬酸缓冲溶液，pH7.0)120ml，36～38℃水浴加热并搅拌条件下，将纤维蛋白原二次沉淀物溶解，去除不溶物，收集二次溶解清液；
(10)采用双缩脲法检测上清液中的蛋白浓度A1(表1)；
(11)根据(10)中的检测结果，采用二次溶解剂溶解冻干保护剂后的溶液作为稀释剂，调节pH7.0，将上清液稀释至溶液中的蛋白浓度为50mg/ml，制剂中成分组成为：
(12)分装，每支分装5ml，分装完成后进行冻干，冻干出柜后立即进行轧盖，最后对冻干品进行钴-60辐照，即可得到纤维蛋白原制品B1(表2)。
(13)将步骤(10)中的纤维蛋白原冻干制品进行分装、真空度检测和轧盖后，在98～100℃水浴保温30分钟的条件下对纤维蛋白原制品中的非脂包膜病毒进行干热病毒灭活；
(14)将步骤(11)热灭活后的纤维蛋白原制品进行钴-60辐照，得到医用纤维蛋白原无菌制品。
实施例2工艺所有操作均在无菌万级净化区中进行，其中分装和冻干操作均在局部百级净化区进行，所进行的操作均符合洁净区操作要求。生产规格为2.5ml。
(1)取无菌采集的猪血液150000ml；
(2)离心分离，取上清抗凝血浆82000ml；
(3)对步骤(2)所得的上清抗凝血浆加入2％w/v的甘氨酸作为助剂，再加入0.3％w/v磷酸三丁酯和1％w/v吐温-80作为病毒灭活剂，25℃下进行病毒灭活6小时；
将灭活后的血浆离心分离，弃去沉淀物，取清液；
(4)一次沉降：将经步骤(3)所得清液预冷至0～4℃，进行离心分离，弃去沉淀物，取清液加入冷乙醇(50％v/v)14022ml沉降血浆中的纤维蛋白原；所述冷乙醇的温度为-20℃；
(5)分离并收集步骤(4)中一次沉降得到的纤维蛋白原一次沉淀物，用0～4℃，质量浓度0.3％～0.6％w/v的NaCl水溶液对步骤(4)中一次沉降得到的纤维蛋白原一次沉淀物进行洗涤，弃去洗涤液；
(6)一次溶解：对步骤(5)中洗涤得到的纤维蛋白原一次沉淀物加入一次溶解剂(0.35％w/v氯化钠和0.066mol/L的碳酸钠-碳酸氢钠缓冲溶液，助剂：0.2％w/v甘氨酸，pH7.30)24600ml，于36～38℃水浴加热并搅拌条件下，将步骤(5)收集得到的纤维蛋白原一次沉淀物溶解，去除不溶物，收集一次溶解清液26650ml；
(7)二次沉降：将步骤(6)得到的一次溶解清液预冷至0～4℃后，向一次上清液中加入冷乙醇(95％v/v)2400ml沉降一次溶解清液中的纤维蛋白原，所述冷乙醇的温度为-20℃；
(8)分离并收集步骤(7)中二次沉降得到的纤维蛋白原二次沉淀物；用0～4℃，质量浓度0.3％～0.6％w/v的NaCl水溶液对步骤(4)中二次沉降得到的纤维蛋白原二次沉淀物进行洗涤，弃去洗涤液；
(9)二次溶解：对步骤(8)中洗涤得到的纤维蛋白原二次沉淀物加入二次溶解剂(0.35％w/v氯化钠和0.066mol/L的碳酸钠-碳酸氢钠缓冲溶液，pH7.30)1800ml，36～38℃水浴加热并搅拌条件下，将纤维蛋白原二次沉淀物溶解，去除不溶物，收集二次溶解清液；
(10)采用双缩脲法检测上清液中的蛋白浓度A1(表1)；
(11)根据(10)中的检测结果，采用二次溶解剂溶解冻干保护剂后的溶液作为稀释剂，调节pH7.30，将上清液稀释至溶液中的蛋白浓度为50mg/ml，制剂中成分组成为：
(12)分装，每支分装5ml，分装完成后进行冻干，冻干出柜后立即进行轧盖，最后对冻干品进行钴-60辐照，即可得到纤维蛋白原制品B1(表2)。
(13)将步骤(10)中的纤维蛋白原冻干制品进行分装、真空度检测和轧盖后，在98～100℃水浴保温30分钟的条件下对纤维蛋白原制品中的非脂包膜病毒进行干热病毒灭活；
(14)将步骤(11)热灭活后的纤维蛋白原制品进行钴-60辐照，得到医用纤维蛋白原无菌制品。
实施例3工艺所有操作均在万级净化区中进行，其中分装和冻干操作均在局部百级净化区进行，所进行的操作均符合洁净区操作要求。生产规格为2.5ml。
(1)取无菌采集的猪血液50000ml；
(2)离心分离，取上清抗凝血浆26000ml；
(3)对步骤(2)所得的上清抗凝血浆加入加入0.3％w/v磷酸三丁酯和1％w/v吐温-80作为病毒灭活剂，25℃下进行病毒灭活6小时；
将灭活后的血浆离心分离，弃去沉淀物，取清液；
(4)一次沉降：将经步骤(3)所得清液预冷至0～4℃，进行离心分离，弃去沉淀物，取清液加入冷乙醇(95％v/v)2340ml沉降血浆中的纤维蛋白原；所述冷乙醇的温度为-20℃；
(5)分离并收集步骤(4)中一次沉降得到的纤维蛋白原一次沉淀物，用0～4℃，质量浓度0.3％～0.6％w/v的NaCl水溶液对步骤(4)中一次沉降得到的纤维蛋白原一次沉淀物进行洗涤，弃去洗涤液；
(6)一次溶解：对步骤(5)洗涤中得到的纤维蛋白原一次沉淀物加入一次溶解剂(0.53％w/v氯化钠和0.02mol/L的柠檬酸三钠-柠檬酸缓冲溶液，pH7.12)7800ml，36～38℃水浴加热并搅拌条件下，将步骤(5)收集得到的纤维蛋白原一次沉淀物溶解，去除不溶物，收集一次溶解清液8450ml；
(7)二次沉降：将步骤(6)得到的一次溶解清液预冷至0～4℃后，向一次上清液中加入冷乙醇(95％v/v)760ml沉降一次溶解清液中的纤维蛋白原，所述冷乙醇的温度为-20℃；
(8)分离并收集步骤(7)中二次沉降得到的纤维蛋白原二次沉淀物；用0～4℃，质量浓度0.3％～0.6％w/v的NaCl水溶液对步骤(4)中二次沉降得到的纤维蛋白原二次沉淀物进行洗涤，弃去洗涤液；
(9)二次溶解：对步骤(8)中洗涤得到的纤维蛋白原二次沉淀物加入二次溶解剂(0.53％w/v氯化钠和0.02mol/L的柠檬酸三钠-柠檬酸缓冲溶液，pH7.12)570ml，36～38℃水浴加热并搅拌条件下，将纤维蛋白原二次沉淀物溶解，去除不溶物，收集二次溶解清液；
(10)采用双缩脲法检测上清液中的蛋白浓度A1(表1)；
(11)根据(10)中的检测结果，采用二次溶解剂溶解冻干保护剂后的溶液作为稀释剂，调节pH7.30，将上清液稀释至溶液中的蛋白浓度为50mg/ml，制剂中成分组成为：
(12)分装，每支分装5ml，分装完成后进行冻干，冻干出柜后立即进行轧盖，最后对冻干品进行钴-60辐照，即可得到纤维蛋白原制品B1(表2)。
(13)将步骤(10)中的纤维蛋白原冻干制品进行分装、真空度检测和轧盖后，在98～100℃水浴保温30分钟的条件下对纤维蛋白原制品中的非脂包膜病毒进行干热病毒灭活；
(14)将步骤(11)热灭活后的纤维蛋白原制品进行钴-60辐照，得到医用纤维蛋白原无菌制品。
实施例4纤维蛋白原制品中XIII因子(FXIII)测定法采用纤维蛋白凝块溶解法。测定方法：取按一系列稀释度稀释好的标准血浆和待测样品80μl，顺序加入200μl 0.1％w/v牛纤维蛋白原、40μl 0.2mol/LCaCl2、40μl凝血酶，37℃保温30min后，加入400μl 1％的一氯醋酸，保温20min，观察纤维蛋白丝的残存、溶解情况，调整稀释度，以能确定的有纤维蛋白残丝存在的最大稀释度作为FXIII的活性的滴度，将待测样品的结果与标准血浆(FXIII活性按1U/ml计)的结果相比，即可得到待测样品的FXIII活性值，其结果如表2所示。
实施例5按照《中华人民共和国药典》2010版三部附录VI B“蛋白质测定法”中第三法“双缩脲法”检测纤维蛋白原的浓度，其结果如表1所示。
按照《中华人民共和国药典》2010版三部第238～239页的有关“人纤维蛋白原”标准，对制品中的“纤维蛋白原纯度”、“复溶时间”、“热原”、“磷酸三丁酯”以及“吐温-80”等检测项进行检测，其结果如表3所示。
表1纤维蛋白原蛋白浓度双缩脲法检测及分析结果
表2纤维蛋白原制品中XIII因子检测及分析结果
| 类别 | XIII因子活性值(U/mg蛋白) |
| 纤维蛋白原制品B1(批次201103261，加助剂) | 12.6 |
| 纤维蛋白原制品B2(批次201103262，加助剂) | 14.1 |
| 纤维蛋白原制品B3(批次201103263，不加助剂) | 5.8 |
表3纤维蛋白原制品质量检测及分析结果
备注：医用纤维蛋白原冻干制品采用0.9％w/v氯化钠无菌无热源溶液作为复溶剂，2.5ml规格冻干制品采用2.5ml 0.9％w/v氯化钠无菌无热原溶液溶解。
本发明采用了S/D脂包膜病毒灭活方法和干热非脂包膜病毒灭活方法两种病毒灭活方法。在工艺前期处理中采用S/D病毒灭活方法对纤维蛋白原制品中可能存在的脂包膜病毒进行了病毒灭活。在纤维蛋白原制品完成冻干轧盖之后，再对制品采用98～100℃水浴保温30分钟的干热病毒灭活方法对纤维蛋白原制品中可能存在的非脂包膜病毒进行了病毒灭活。通过这两种病毒灭活方法，进一步降低了产品传播HIV、肝炎等人类血源性疾病以及交叉感染动物病毒的危险，产品与人体之间的生物相容性及免疫安全性得到了很大的改善，产品常规局部使用，安全性强。
本发明通过优化产品冻干配方，提高了纤维蛋白原制品的复溶速度，为及时抢救病人的生命赢得了宝贵的时间。
Claims (15)
1.一种纤维蛋白原的制备方法，依次包括以下几个步骤：
(1)向血液中加入抗凝剂；
(2)离心分离，取上清抗凝血浆；
(3)对步骤(2)所得的上清抗凝血浆加入助剂，再加入磷酸三丁酯和吐温-80作为病毒灭活剂，进行S/D病毒灭活；
将灭活后的血浆离心分离，弃去沉淀物，取清液；
(4)一次沉降：将步骤(3)所得清液预冷至0～4℃，进行离心分离，弃去沉淀物，取清液加入冷乙醇，沉降血浆中的纤维蛋白原，所述冷乙醇的温度为-20℃；
(5)分离并收集步骤(4)中一次沉降得到的纤维蛋白原一次沉淀物，用0～4℃，质量浓度0.3％～0.6％w/v的NaCl水溶液对步骤(4)中一次沉降得到的纤维蛋白原一次沉淀物进行洗涤，弃去洗涤液；
(6)一次溶解：对步骤(5)中洗涤后的纤维蛋白原一次沉淀物加入一次溶解剂和助剂，36～38℃水浴加热并搅拌条件下，将步骤(5)收集得到的纤维蛋白原一次沉淀物溶解，去除不溶物，收集一次溶解清液；
(7)二次沉降：将步骤(6)得到的一次溶解清液预冷至0～4℃后，向一次上清液中加入冷乙醇沉降一次溶解清液中的纤维蛋白原，所述冷乙醇的温度为-20℃；
(8)分离并收集步骤(7)中二次沉降得到的纤维蛋白原二次沉淀物，用0～4℃，质量浓度0.3％～0.6％w/v的NaCl水溶液对步骤(4)中二次沉降得到的纤维蛋白原二次沉淀物进行洗涤，弃去洗涤液；
(9)二次溶解：对步骤(8)中洗涤后的的纤维蛋白原二次沉淀物加入二次溶解剂，36～38℃水浴加热并搅拌条件下，将纤维蛋白原二次沉淀物溶解，去除不溶物，收集二次溶解清液；
(10)向步骤(9)得到的二次溶解清液中加入冻干保护剂，冻干，得到纤维蛋白原冻干制品。
2.根据权利要求1所述的纤维蛋白原的制备方法，其特征在于，所述的血液为无菌采集的猪血液或人血液。
3.根据权利要求1所述的纤维蛋白原的制备方法，其特征在于，所述抗凝剂为柠檬酸三钠或草酸钾。
4.根据权利要求3所述的纤维蛋白原的制备方法，其特征在于，单独使用柠檬酸三钠为抗凝剂时，柠檬酸三钠溶液的浓度为3.8％w/v，柠檬酸三钠溶液与血液的体积比为1∶7～1∶9；
单独使用草酸钾为抗凝剂时，草酸钾溶液的浓度为2.5％w/v，草酸钾溶液与血液的体积比为1∶7～1∶9。
5.根据权利要求1所述的纤维蛋白原的制备方法，其特征在于，步骤(3)与步骤(6)中，所述助剂为氨基酸、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、山梨醇、葡萄糖酸钠、柠檬酸三钠、EDTA中的一种或几种，所述氨基酸是谷氨酸、赖氨酸、丙氨酸、组氨酸、蛋氨酸、甘氨酸、精氨酸、L-亮氨酸、L-异亮氨酸中的一种或几种。
6.根据权利要求1所述的纤维蛋白原的制备方法，其特征在于，步骤(3)中所述助剂的添加浓度为0.1～5.0％w/v。
7.根据权利要求1所述的纤维蛋白原的制备方法，其特征在于，对步骤(2)所得的上清抗凝血浆加入助剂的同时加入S/D病毒灭活剂，并在25℃下进行病毒灭活6小时。
8.根据权利要求1所述的纤维蛋白原的制备方法，其特征在于，所述冷乙醇的浓度为50％～95％v/v，步骤(4)与步骤(7)中纤维蛋白原沉降时，乙醇的加入浓度为沉降反应体系总量的8％～10％v/v。
9.根据权利要求1所述的纤维蛋白原的制备方法，其特征在于，所述一次溶解剂与二次溶解剂为含有氯化钠的缓冲液，所述缓冲液的缓冲对为磷酸氢二钠-磷酸二氢钠、碳酸钠-碳酸氢钠或柠檬酸三钠-柠檬酸。
10.根据权利要求9所述的纤维蛋白原的制备方法，其特征在于，所述一次溶解剂与二次溶解剂的氯化钠浓度为0.2％～3.0％w/v，缓冲对的浓度为0.01mol/L～0.5mol/L，pH值为7.0～7.5。
11.根据权利要求1所述的纤维蛋白原的制备方法，其特征在于，步骤(6)中所述助剂的添加浓度为0.1～5.0％w/v。
12.根据权利要求1所述的纤维蛋白原的制备方法，其特征在于，所述冻干保护剂选自多羟基碳水化合物、柠檬酸三钠、氯化钠、氨基酸中的一种或几种。
13.根据权利要求12所述的纤维蛋白原的制备方法，其特征在于，所述多羟基碳水化合物选自蔗糖、海藻糖、葡萄糖、甘露醇、山梨醇中的一种或几种；
所述的氨基酸选自谷氨酸、赖氨酸、丙氨酸、组氨酸、蛋氨酸、甘氨酸、精氨酸、L-亮氨酸、L-异亮氨酸中的一种或几种。
14.根据权利要求12所述的纤维蛋白原的制备方法，其特征在于，所述的冻干保护剂为多羟基碳水化合物、柠檬酸三钠、氯化钠和氨基酸，其中，多羟基碳水化合物的浓度为0.1％～5％w/v，柠檬酸三钠的浓度为0.1％～2％w/v，氯化钠的浓度为0.1％～0.9％w/v，氨基酸的浓度为0.1％～5％w/v。
15.根据权利要求1至14任意一项所述的纤维蛋白原的制备方法，其特征在于，在步骤(10)后还依次包括：
(11)将步骤(10)中的纤维蛋白原冻干制品进行分装、真空度检测和轧盖后，在98～100℃水浴保温30分钟的条件下对纤维蛋白原制品中的非脂包膜病毒进行干热病毒灭活；
(12)将步骤(11)热灭活后的纤维蛋白原制品进行钴-60辐照，得到医用纤维蛋白原无菌制品。
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