CN101677836A - 用于制备纤维蛋白胶的含有浓缩纤维蛋白原的组合物和相关系统的制备方法 - Google Patents

用于制备纤维蛋白胶的含有浓缩纤维蛋白原的组合物和相关系统的制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及浓缩的纤维蛋白原组合物和相关方法以及其用途。所述浓缩的纤维蛋白原组合物可以通过以下步骤制备：向含有纤维蛋白原的流体中加入足够量的阳离子剂如鱼精蛋白，使纤维蛋白原形成纤维蛋白原沉淀；通过收集手段例如离心来收集纤维蛋白原沉淀；并将该纤维蛋白原沉淀悬浮或溶解在液态溶媒中以形成浓缩纤维蛋白原组合物。该浓缩纤维蛋白原组合物可以掺入用于制备纤维蛋白胶的系统中并用于治疗伤口。

Description

用于制备纤维蛋白胶的含有浓缩纤维蛋白原的组合物和相关系统的制备方法
本申请要求2007年3月30日提交的美国临时专利申请序号60/920,900的优先权，其内容引入本文作为参考。
背景技术
基于纤维蛋白的封闭剂经常用于减少手术期间/之后的出血。封闭剂通过将纤维蛋白原的浓缩溶液与凝血酶和Ca2+混合以生成纤维蛋白而形成，其应用于出血的伤口和缝合线以帮助止血。浓缩的混合的人纤维蛋白原可以购买，但其带来污染的风险，或者其通过进一步加工来降低该风险，但却增加了商品化的封闭剂的成本。很少关注的从自体血液中制备浓缩纤维蛋白原的方法相对于昂贵的商品化封闭剂将是一种有吸引力的替代方案。
从人类血液中分离纤维蛋白原的最普通方法是通过低温沉淀来获得20-40mg/mL的纤维蛋白原浓度。该方法需要数个小时，并且形成粗的凝血因子浓缩物，其可用于控制有止血缺陷的患者，但是对于从少量体积的血液中收集纤维蛋白原来说不太实际。
纤维蛋白原也可以使用化学试剂来沉淀，例如乙醇、聚乙二醇(PEG)或硫酸铵。这些方法需时较短，并且提供的纤维蛋白原浓度为30到＞50mg/mL。但是，醇沉淀可能造成纤维蛋白原浓缩物中乙醇水平增高，这可能导致纤维蛋白原的过早凝固和降低因子XIII的活性(以及降低封闭剂抗张强度)。用硫酸铵分离纤维蛋白原还使大量的白蛋白沉淀，其可以干扰凝血。使用PEG沉淀纤维蛋白原需要使用BaSO4和MgSO4进行费时的凝血酶原的预吸收，并且也不希望在纤维蛋白原制剂中存在PEG，因为其可导致功能下降。由于这些限制因素，无法广泛采用化学方法来快速收获作为封闭剂用于临床的纤维蛋白原。
一种商品化的纤维蛋白原浓缩物Tisseel VH(Baxter Healthcare公司，Westlake Village，CA)从1998年起已经可以在美国购得。它是通过复杂的过程制备的，包括从混合的人血浆中分离纤维蛋白原并进行热灭活或溶剂/洗涤剂提取，以减少病毒污染物的风险。Tisseel相对较贵，并且贮存期在一度程度上受到限制。
作为商品化封闭剂的替代品，纤维蛋白封闭剂已经通过将血浆或冷沉淀物与牛凝血酶混合而制备。但是，正如所述的，使用类似于血浆中的较低浓度的纤维蛋白原制备的封闭剂可能不具有所希望的物理化学性能，并且其止血能力有限。另外，制备冷沉淀物也是费时的，而且通常对于小体积而言成本并不合算。当从血库中获得血浆或冷沉淀物时，也伴有传递血液传染的病原体的风险。
因此，需要更容易的和能广泛利用的制备纤维蛋白胶的改进的系统、方法和组合物。
附图简述
图1是在含有浓缩纤维蛋白原的组合物中的纤维蛋白原回收率(在原始血浆中的纤维蛋白原的百分率)的图示，其作为在血浆中所用的鱼精蛋白浓度的函数。数据表示为平均值±SD(n＝4)。
图2是作为沉淀温度的函数的浓缩物中纤维蛋白原回收率(在原始血浆中的纤维蛋白原的百分率)的图示。数据表示为平均值±SD(n＝4)。
图3是作为氯化钙浓度函数的纤维蛋白胶或封闭剂的抗张强度(n＝4)和粘合强度(n＝8)的图示。所用的封闭剂纤维蛋白原浓度为15mg/mL。数据表示为平均值±SD。
图4是向纯纤维蛋白原(15mg/mL)中加入因子XIII(10μg/mL)和氯化钙(8.9mM)时抗张强度的图示。数据表示为平均值±SD(n＝4)。
图5是作为在含有或不含氯化钙(8.9mM)条件下愈合时间的函数的封闭剂抗张强度(n＝4)和粘合强度(n＝8)的图示。封闭剂在37℃从沉淀的血浆纤维蛋白原(15mg/mL)形成，并保持于22℃下30分钟。数据表示为平均值±SD。
图6是封闭剂的抗张强度(n-4)和粘合强度(n＝8)的图示，其表现为纤维蛋白原浓度的近似于线性的函数，并且随着CaCl2(8.9mM)的加入而增大。还显示了来自于凝固的Tisseel、血浆和纯纤维蛋白原(15mg/mL)的结果。数据表示为平均值±SD。
图7是15mg/mL纤维蛋白原浓缩物的抗张强度的图示，其制备自：1)纯纤维蛋白原；2)用鱼精蛋白沉淀、离心、随后重新溶解的纯纤维蛋白原；和3)用鱼精蛋白沉淀、离心、随后重新溶解的血浆纤维蛋白原。数据表示为平均值±SD(n＝4)。
图8是在抗纤维蛋白溶解药存在下、在含有和不含氯化钙(8.9mM)条件下从封闭剂制备的凝块的抗张强度和粘合强度的图示。所用封闭剂纤维蛋白原浓度为15mg/mL。所用抗纤维蛋白溶解药为抑肽酶(3000KIU/mL)和ε-氨基己酸(ε-ACA，10mg/mL)。数据表示为平均值±SD(n＝4)。
图9是从全血中浓缩纤维蛋白原的滤器设计的图示。过滤室可以为一定范围的血液体积(例如10-20ml、25-50ml、50-75ml、75-100ml)而设计。从将血液加入混合室到回收浓缩物的时间通常少于15分钟。从全血制备的纤维蛋白原浓缩物具有类似于市售的纤维蛋白胶Tisseel V(BaxterHealthcare，CA)的物理化学特性。
发明详述
现在借助示例性的实施方案和本文所用的具体陈述来描述本发明。然而，应当理解它不意味着限制本发明的范围。相关领域的技术人员了解本文内容后，可以对本文所述的发明特点进行改变和进一步修饰，并可对本文所说明的本发明的原理进行其他应用，这些都被视为涵盖于本发明的范围内。还应当理解，本发明不限于本文所公开的具体构造、方法步骤和材料，因为它们可以在一定程度上变化。而且，应当理解本文所用的术语仅用于描述具体方案的目的，并不意味着限制本发明的范围。
应当注意的是，除非文中另有清楚的说明，否则本说明书和权利要求中所用的单数形式“一种”和“该”包括复数指示物。
本文所用的术语“活动性出血”是指任何从循环系统中失血，无论其原因是什么。
本文所用的术语“伤口”是指个体的任何组织的任何损伤。伤口可以经历活动性出血，但不是必须经历。损伤可以是受伤或手术产生，并且可以是个体的肌体内或肌体外的。受伤的非限制性的例子包括溃疡、骨折、刺伤、割伤、擦伤、撕裂伤、手术切口等。
本文所用的“流体”是指可流动的成分，其可以包括液体、悬浮固体或其他可流动物质。流体可以是混悬液、乳浊液、溶液、混合物、胶体等。
本文所用的术语“含有纤维蛋白原的流体”是指含有纤维蛋白原的任何生物学或人造的流体。这类流体的非限制性的例子包括各种形式的血液血浆。
“浓缩纤维蛋白原组合物”是指来自于含有纤维蛋白原的流体的纤维蛋白原组合物，所述纤维蛋白原存在于介质或液体中，所述的介质或液体与产生浓缩纤维蛋白原的所述含有纤维蛋白原的流体不同。浓缩纤维蛋白原组合物可以(但不是必需)具有高于含有纤维蛋白原的流体的浓度。例如，浓缩纤维蛋白原组合物可以具有低于或等于原始的含有纤维蛋白原的流体中的纤维蛋白原浓度，或者可以具有高于原始的含有纤维蛋白原的流体中的纤维蛋白原浓度。换言之，术语“浓缩”不意味着与产生浓缩纤维蛋白原组合物的原始的含有纤维蛋白原的流体相比是浓缩物，而仅仅是指其浓度足以在适宜条件下形成凝块。
本文所用的术语“收集”在用于纤维蛋白原沉淀物时，是指从大量的含有纤维蛋白原的流体中分离纤维蛋白原沉淀物。该步骤不是必需的，但是可使沉淀物实际上富集。可以通过任何一种本领域内的手段来实现收集，包括但不限于重力分离、滗出、离心、过滤等。
本文所用的纤维蛋白原和凝血因子I是同义的。
本文所用的术语“凝固试剂”是指帮助或造成含有纤维蛋白原的组合物凝固形成纤维蛋白胶或封闭剂的任何流体或物质。举例性的物质如钙(例如钙盐)、镁(例如镁盐)、促凝血酶原激酶、肌动蛋白、凝血酶、胶原、血小板混悬液、沉淀或变性的蛋白、复合糖、硅石、锌、硅藻土、高岭土、鲁塞尔蝰蛇毒、利托菌素以及它们的混合物。但是，凝固试剂也可在通常存在于正常伤口处的流体中发现，从而使纤维蛋白原形成纤维蛋白胶或封闭剂，但速率一般比较慢。
本文所用的术语“阳离子剂”是指阳离子的物质，其与纤维蛋白原发生反应或相互作用从而产生一定量的沉淀或絮凝，以便至少在某种程度上可将沉淀或絮凝物从其流体中分离。合适的阳离子剂的例子包括胺类，例如鱼精蛋白、聚赖氨酸、聚烯丙胺、组蛋白及它们的混合物。
本文所用的术语“约”是用来提供数字范围端点的弹性，其表示给定的数值可以是“略高于”或“略低于”端点。该术语的弹性程度可以通过特定变量来表示，并且处于本领域技术人员基于经验和本文的相关描述而能加以确定的知识范围之内。
如本文所用，可以为了方便而在共同列表中提供多种成分。但是，这些列表应当被视为如同该列表的每个成员都作为分开的和唯一的成员各自进行了确认。因此，如果没有相反的说明的话，所述列表中每个单独的成员都不应当仅仅根据它们出现在共同的组中就被视为该列表的任何其他成员的事实上的替代方案。
浓度、数量以及其它数值数据在本文中可以范围形式来表达或者提供。应当理解，这类范围形式仅仅用于方便和简洁的目的，因此应当被灵活地解释为不仅包括该范围边界所具体描述的数值，而且包括在该范围内涵盖的所有单个数值或亚范围，就如同每个数值和亚范围被具体描述一样。例如，数值范围“约0.01-2.0”应当被解释为不仅包括具体描述的数值约0.01到约2.0，还包括在所述范围内的单个数值和亚范围。因此，单个数值例如0.5、0.7和1.5，以及亚范围如0.5-1.7、0.7-1.5和1.0-1.5等，都包括在该数值范围内。同样的原则也适用于仅描述了一个数值的范围。而且，不论范围的宽度或所描述的特征如何，都应当采用这种解释。
在理解这些定义后，可以认识到提供制备用于通过造成血液凝固而减少或停止出血的浓缩纤维蛋白原组合物的方法是有利的。
因此，本发明提供了浓缩纤维蛋白原组合物、系统以及相关制备方法和用途。
本文提供了制备和凝固浓缩纤维蛋白原组合物的方法。步骤可包括：向包含纤维蛋白原的流体中加入足够量的阳离子剂，使纤维蛋白原形成纤维蛋白原沉淀，收集纤维蛋白原沉淀，并在收集后将该纤维蛋白原沉淀悬浮或溶解在液态溶媒中以形成浓缩纤维蛋白原组合物。额外的步骤包括使该浓缩纤维蛋白原组合物凝固。
在另一项实施方案中，治疗伤口的方法可以包括：向包含纤维蛋白原的流体中加入足够量的阳离子剂，使纤维蛋白原形成纤维蛋白原沉淀，收集纤维蛋白原沉淀，并在收集后将该纤维蛋白原沉淀悬浮或溶解在液态溶媒中以形成浓缩纤维蛋白原组合物。额外的步骤可以包括将浓缩纤维蛋白原组合物与凝固试剂混合来形成纤维蛋白封闭剂，并向伤口应用一定量的纤维蛋白封闭剂，从而形成凝块。
在另一项实施方案中，从血液中制备浓缩纤维蛋白原组合物的方法可以包括：向血液中加入足够量的阳离子剂，从而使全血中存在的纤维蛋白原形成纤维蛋白原沉淀，收集纤维蛋白原沉淀，并在收集后将该纤维蛋白原沉淀悬浮或溶解在液态溶媒中以形成浓缩纤维蛋白原组合物。
在另一项实施方案中，制备和使用自体的纤维蛋白胶的方法可以包括：从个体收集包含纤维蛋白原的流体，向包含纤维蛋白原的流体样品中加入足够量的阳离子剂，使纤维蛋白原形成纤维蛋白原沉淀，并收集纤维蛋白原沉淀。额外的步骤包括将纤维蛋白原沉淀悬浮或溶解在液态溶媒中，形成浓缩纤维蛋白原组合物，并将该浓缩纤维蛋白原组合物应用于个体的伤口以形成纤维蛋白胶，其中该纤维蛋白胶形成凝块。
在另一项实施方案中，制备纤维蛋白胶的系统可以包括：第一种组分，其为包含10mg/ml至200mg/ml纤维蛋白原以及至少一种选自因子II、因子IX、因子X和因子XIII的凝血因子的流体。该系统还可以包括第二种组分，其包含用于所述纤维蛋白原的凝固试剂。当第一种组分和第二种组分接触时，可以形成纤维蛋白胶。
在另一项实施方案中，制备浓缩纤维蛋白原组合物的方法可以包括：向包含纤维蛋白原的流体中加入足够量的鱼精蛋白，使得纤维蛋白原形成纤维蛋白原沉淀，通过离心收集纤维蛋白原沉淀，在收集完成后，将纤维蛋白原沉淀物悬浮或溶解在包含柠檬酸钠的液态溶媒中，以形成浓缩纤维蛋白原组合物。在浓缩纤维蛋白原组合物中的纤维蛋白原的浓度可以至少是包含纤维蛋白原的流体中纤维蛋白原浓度的两倍。
在另一项实施方案中，制备纤维蛋白胶的系统可以包括：包含10mg/ml至200mg/ml纤维蛋白原和至少一种选自因子II、因子IX、因子X和因子XIII的凝血因子的流体。在应用于伤口时，可以形成纤维蛋白胶。
应当注意，当提及浓缩纤维蛋白原组合物、其制备方法以及在纤维蛋白胶和纤维蛋白胶系统中的相关使用方法时，所有此类论述都可被认为适用于所有这些实施方案，无论其是否在实施方案的上下文中被明确地论述。因此，例如在论述用于制备纤维蛋白胶的浓缩纤维蛋白原组合物时，该浓缩纤维蛋白原组合物还可以用于制备纤维蛋白胶的系统，反之亦然。
根据本发明的方法和系统，纤维蛋白原可以从多种生理或人造的包含纤维蛋白原的流体中收集。在本发明的一方面，该包含纤维蛋白原的流体可以是全血。在另一方面，该包含纤维蛋白原的流体可以是血浆，包括普通血浆以及富含血小板的血浆(PRR)和缺乏血小板的血浆(PPP)。血液或血浆的来源可以是来源于人或其它动物。本发明特别是可用于当包含纤维蛋白原的流体是所希望的纤维蛋白原来源时，它也同样是浓缩纤维蛋白原的应用或者最终从浓缩纤维蛋白原形成的纤维蛋白胶的目标对象时。例如，在预期进行手术时制备。血浆的纤维蛋白原水平在个体间有很大差异，其受年龄、性别、种族、酒精摄入和吸烟以及某些疾病影响。在普通患者群体中通常的纤维蛋白原浓度为2-6mg/mL；然而，从非浓缩的纤维蛋白原溶液制备的凝块不能提供所需的机械特性，从而导致封闭剂的再现性较差和不可靠的效力。本发明提供了控制最终浓缩物中的纤维蛋白原浓度的能力，因此有助于使封闭剂性能的差异最小化。
当选择了包含纤维蛋白原的流体时，就可以向该流体中加入阳离子剂，使该纤维蛋白原沉淀或者絮凝。有很多种阳离子剂可以使用，包括多种胺类，包括鱼精蛋白、聚赖氨酸、聚烯丙胺、组蛋白及其混合物。在一项实施方案中，鱼精蛋白是阳离子剂。由阳离子剂如鱼精蛋白引起的纤维蛋白原沉淀是迅速的，并且通常导致在包含纤维蛋白原的流体中的大量(如果基本上不是全部的)纤维蛋白原得到回收。其还有利于包括因子X、因子XIII和/或因子II在内的某些凝血因子的沉淀。
当沉淀产生后，可以通过任何本领域已知的收集手段对沉淀的纤维蛋白原进行收集，包括但不限于重力沉降、离心、过滤或其组合。在一项实施方案中，通过过滤来进行收集。过滤可以是有利的收集方法，因为其可以使用便携式过滤装置来进行，例如美国专利公布号20070037132中所示，其引入本文作为参考，在另一项实施方案中，沉淀的纤维蛋白原的收集可以通过离心来实现。
当收集完成后，可将该纤维蛋白原沉淀物悬浮或溶解在液体载体中以形成浓缩纤维蛋白原组合物。该液态溶媒可以是水性或非水性的，只要其为生理学可接受的并且不会使纤维蛋白原显著降解或变性。液态溶媒的实例包括但不限于柠檬酸钠、氢氧化钠、氢氧化钾、肝素、硫酸类肝素的水溶液、其它阴离子的溶液，及其混合物等。在一项实施方案中，该液态溶媒是柠檬酸钠水溶液。
本发明的浓缩纤维蛋白原组合物中的纤维蛋白原浓度可以是产生纤维蛋白原的包含纤维蛋白原的液体浓度的至少两倍，换言之，本发明的方法提供了将原始的包含纤维蛋白原的流体制成浓缩纤维蛋白原组合物后，纤维蛋白原浓度至少增加100％。在一项实施方案中，在浓缩纤维蛋白原组合物中存在的纤维蛋白原可以是10mg/ml-200mg/ml的浓度。在另一项实施方案中，在浓缩纤维蛋白原组合物中存在的纤维蛋白原可以是20mg/ml-100mg/ml的浓度。在另一项实施方案中，在浓缩纤维蛋白原组合物中存在的纤维蛋白原可以是20mg/ml-60mg/ml的浓度。在另外一项实施方案中，在浓缩纤维蛋白原组合物中的纤维蛋白原可以以至少约15mg/ml的浓度存在。
上述的收集纤维蛋白原方法的其它益处是可以同时收集可能存在于包含纤维蛋白原的流体中的凝血因子。所述凝血因子可以包括但不限于因子X、因子IX、因子XIII、因子II、因子VIII等，其存在于血浆和全血中。因此，在一项实施方案中，按照任何上述方法获得的浓缩纤维蛋白原组合物可以包含因子IX、因子X、因子XIII、因子II和因子VIII中的至少一种因子。在另一项实施方案中，按照任何上述方法获得的浓缩纤维蛋白原组合物可以包含因子X、因子IX、因子XIII、因子II和因子VIII中的至少两种因子。在另外一项实施方案中，按照任何上述方法获得的浓缩纤维蛋白原组合物可以包含因子X、因子IX、因子XIII和因子VIII中的每一种因子。当包含浓缩纤维蛋白原的组合物是获自全血或血浆时，至少一种凝血因子，例如因子X、因子II、因子IX或因子XIII，可以在浓缩纤维蛋白原组合物中以至少两倍于血浆或全血中的凝血因子浓度的浓度存在，但这并不是必需的。仅仅是这些凝血因子在浓缩纤维蛋白原组合物中的存在就可以为增强凝固功能带来益处。
通过本发明的任何方法制备的浓缩纤维蛋白原组合物都可以用于制备纤维蛋白封闭剂或纤维蛋白胶，其可以应用于伤口。伤口的实例包括意外割伤、刺伤、内出血、其它损伤、外科手术切口等。因此，术语“伤口”不一定意味着该伤口是暴露在空气中，但是与其正常状态相比它是开放性的。通常而言，伤口将暴露在空气中，但是内出血也包括在本文中。本发明的纤维蛋白原组合物可以通过将浓缩纤维蛋白原组合物与一定量的凝血酶或其它凝固试剂混合以形成纤维蛋白封闭剂而应用于伤口。该纤维蛋白封闭剂可以应用于伤口，迅速形成凝块，其减少或停止伤口的活动性出血。在一个实施例中，如果使用凝血酶的话，其可以以每ml纤维蛋白封闭剂中为50单位-500单位的量存在于纤维蛋白封闭剂中。
本发明的纤维蛋白封闭剂还可以包含其它可在伤口愈合和血液凝固中有帮助的化合物，例如任何凝血因子(如上文所述)或凝固试剂。在一项实施方案中，该纤维蛋白封闭剂可以包含至少一种选自因子X、因子XIII、因子II、因子VIII及其混合物的凝血因子。如果存在的话，因子VIII可以帮助形成具有所需特性的更为粘稠的封闭剂。在纤维蛋白封闭剂中包含的因子XIII所具有的一项益处是它确保纤维蛋白封闭剂交联，并因此降低了对纤溶作用的敏感性。因子XIII需要钙作为辅因子，以使纤维蛋白交联，提高凝块的抗张强度，减少其断裂。
可以与浓缩纤维蛋白原组合物进行组合用于纤维蛋白封闭剂或纤维蛋白胶的凝固试剂包括但不限于：钙盐、镁盐、促凝血酶原激酶、肌动蛋白、凝血酶、胶原、血小板混悬液、沉淀或变性的蛋白、复合糖、硅石、锌、硅藻土、高岭土、鲁塞尔蝰蛇毒、利托菌素及其混合物。一般而言，当凝固试剂与浓缩纤维蛋白原组合物一起使用以形成纤维蛋白胶时，在将纤维蛋白胶应用于伤口前，迅速混合凝固试剂与浓缩纤维蛋白原组合物。凝固试剂可以加入或与浓缩纤维蛋白原组合物混合而形成纤维蛋白胶。在一项实施方案中，凝固试剂可以存在于分开的或者第二种流体中，该流体在需要使用纤维蛋白胶的时间之前与浓缩纤维蛋白原组合物(即，第一种流体)迅速混合。为了避免凝固过早形成，第一种溶液即浓缩纤维蛋白原组合物和包含凝固试剂的第二种溶液可以在分开的容器中保存，直到使用前。在本发明的一项实施方案中，第二种溶液可以以伤口分泌的流体形式由伤口本身提供。
在另一项实施方案中，纤维蛋白封闭剂可以包含钙和镁。将钙或镁加入纤维蛋白原浓缩物可以增加所形成凝块的抗张强度和粘合强度，推测(至少一部分)是由于因子XIII作为辅因子在使纤维蛋白原交联中起作用。在某些情况下，可能需要钙、镁在纤维蛋白封闭剂中的阈浓度以产生最大效应(对于抗拉强度为8.9mM，对于粘合强度为3.6mM，该浓度是基于钙或镁以氯化钙或氯化镁存在时的浓度)，说明需要足够的钙或镁在其与因子XIII相互作用之前，与存在于纤维蛋白流体中的阴离子成分结合，例如来自柠檬酸钠的柠檬酸根离子。一般而言，氯化钙或氯化镁在纤维蛋白封闭剂中的浓度超过0.05M时对所得凝块的抗张强度没有积极作用，并且在某些情况下该凝块的抗张强度可能会降低。在不受理论束缚的情况下，认为该结果可能是由于离子强度增加和纤维蛋白原的部分沉淀，这两者都对凝块的完整性有不利影响。一般而言，认为任何生理学可接受的钙或镁来源都可以使用，包括钙盐或镁盐。在一项实施方案中，钙或镁可以氯化钙(CaCl2)或氯化镁(MgCl2)存在。在一项实施方案中，钙可以氯化钙形式在纤维蛋白原封闭剂中以1.8nM-100nM的氯化钙浓度存在。在另一项实施方案中，钙可以氯化钙形式在纤维蛋白原封闭剂中以8.9nM-50nM的氯化钙浓度存在。在一项实施方案中，镁可以氯化镁形式在纤维蛋白原封闭剂中以1.8nM-100nM的氯化镁浓度存在。在另一项实施方案中，镁可以氯化镁形式在纤维蛋白原封闭剂中以8.9nM-50nM的氯化镁浓度存在。
当本发明的纤维蛋白原封闭剂应用于伤口时，其有助于通过粘合组织而使缺口粘接，并通过形成凝块来止血。在一项实施方案中，纤维蛋白原封闭剂可以在少于约5分钟内停止个体出血。在另一项实施方案中，纤维蛋白原封闭剂可以在少于约3分钟内停止个体出血。在另外一项实施方案中，纤维蛋白原封闭剂可以在少于约1.5分钟内停止个体出血。此外，在另一项实施方案中，纤维蛋白原封闭剂可以在少于约5分钟内在体外形成凝块。在另一项实施方案中，纤维蛋白原封闭剂可以在少于约3分钟内在体外形成凝块。在另外一项实施方案中，纤维蛋白原封闭剂可以在少于约1.5分钟内在体外形成凝块。在另外一项实施方案中，纤维蛋白原封闭剂可以在少于约30秒内在体外形成凝块。
实施例
以下实施例说明了目前已知的本发明的优选实施方案。但是，也可实施其它实施方案，它们同样涵盖于本发明的范围内。
实施例1从全血制备缺乏血小板的血浆
按照赫尔辛基宣言的原则，从健康成年人供者中通过静脉穿刺采集血液到柠檬酸钠(Sigma化学品公司，St.Louis，MO；终浓度0.38g/100mL)中。将血液在1200g离心30分钟，得到缺乏血小板的血浆(PPP)。该缺乏血小板的血浆可以立即用于制备纤维蛋白原浓缩物或者可以储存用于在稍晚的时间使用。在储存时，PPP应当储存在-80℃。
实施例2从混合的人血浆中制备纤维蛋白原浓缩物
通过加入硫酸鱼精蛋白(Sigma化学品公司)，从混合的人血浆中沉淀纤维蛋白原。用硫酸鱼精蛋白制备40mg/mL的储备液。接着将鱼精蛋白加入血浆中(终浓度＝10mg/ml)，混合，继而在1000g离心5分钟以使沉淀物沉积。随后滗出血浆，将剩余沉淀物溶解于0.2M柠檬酸钠(37℃，pH 7.4)。
实施例3测定纤维蛋白原和因子XIII的浓度
按实施例2所述制备浓缩的纤维蛋白原溶液。采用酶联免疫吸附试验(ELISA；AssayPro LLC，布鲁克林，纽约)评价纤维蛋白原和因子XIII的浓度。所建立的ELISA板的色强度用Dynex MRX微孔板读数器(DynexTechnologies，Chantilly，VA)测量，并与标准曲线比较。
血浆中的纤维蛋白原浓度用Clauss法测量，其中血浆样品在CoaData2000凝血时间测定仪(Labor GmbH，汉堡，德国)中在过量的凝血酶存在下凝固。记录凝血时间，根据标准曲线计算纤维蛋白原浓度。
在浓缩物中与纤维蛋白原结合的鱼精蛋白的量使用125I-鱼精蛋白测定。使用IODOGEN预涂覆的管(产品号28601，Pierce，Rockford，IL)，按照其推荐的程序，用125碘标记2mg的鱼精蛋白。在最终试验中，将1.0mg125I-鱼精蛋白与99.0mg未标记的鱼精蛋白混合，接着加入10ml血浆中。所形成的沉淀物用水洗涤3次，溶解于0.2M柠檬酸钠中，并通过γ计数来测量与纤维蛋白原浓缩物相关的放射性的量。
按照文献的指导，通过改变加入血浆中的鱼精蛋白的量而使鱼精蛋白终浓度达到5mg/mL到15mg/mL，可以获得不同的纤维蛋白原浓度。在血液或血浆的鱼精蛋白浓度为10mg/mL时，可以沉淀和回收到最多的纤维蛋白原(96±4％，n＝4)(图1)。较低的鱼精蛋白浓度沉淀了较少的纤维蛋白原，较高的鱼精蛋白浓度可造成低密度聚集物的沉淀，其可能难以分离，并且可能不易溶解。
使用鱼精蛋白沉淀来提取纤维蛋白原的效率受到温度的影响。通过在37、22、15和7℃下将鱼精蛋白(10mg/mL)加入血浆样品，可以研究纤维蛋白原沉淀的温度依赖性的性质。当提取温度为22℃和更低时，纤维蛋白原的回收不是温度依赖性的(图2)，并且在22℃回收(96±4％，n＝4，22℃)比在37℃(75±6％，n＝4)显著更好。
当使用血浆时，纤维蛋白原浓缩物中的因子XIII的回收可以达到终浓度3.60±0.05μg/mL，其为最初血浆中的因子XIII的47±0.6％(n＝4)。
实施例4沉淀的纤维蛋白原的凝固性
回收的纤维蛋白原的凝固性评价如下。按照实施例2的制备方法制备并使用纤维蛋白原溶液。向1mL纤维蛋白原溶液中加入100uL牛凝血酶(Vital Products公司，Boynton Beach，FL，500U/mL)，使凝块在22℃放置30分钟。接着将凝块在3500g离心2分钟，取出上清液。通过ELISA测定在纤维蛋白原浓缩物溶液和凝块上清液中存在的纤维蛋白原的量，根据差异来确定凝块中存在的纤维蛋白原。
为了评价掺入凝块中的因子XIII，上述过程可在加入氯化钙(SpectrumQuality Products公司，Gardena，CA)的条件下重复。在凝块上清液和浓缩物中的纤维蛋白原和因子XIII的量可以用ELISA测量，根据差异来确定凝块中保留的纤维蛋白原和因子XIII的量。
如上所述，浓缩物中的纤维蛋白原聚合形成凝块。在凝块中保留的纤维蛋白原的量测定为原始浓缩物中纤维蛋白原的量的98±0.9％(n＝4)。当向浓缩物中加入氯化钙时，未观察到纤维蛋白原凝固性的改变，并且有30±1％的因子XIII与凝块结合(n＝4)。
实施例5肝素对纤维蛋白原浓缩物凝固作用的影响
在临床上大多数需要抗凝作用的操作中都使用肝素。评价了肝素对纤维蛋白原和因子XIII的收集以及对所收集的纤维蛋白原随后凝固的影响。将血液吸入含有猪的肝素(ESi Pharmaceuticals，Cherry Hill，NJ；终浓度2U/mL)的注射器中，在1200g离心30分钟以获得PPP。将鱼精蛋白加入到已知量的血浆中以使血浆浓度为10、11或12mg/mL。按上文的实施例2所述来制备纤维蛋白原浓缩物。用ELISA测定浓缩物中的纤维蛋白原和因子XIII的量。
当血液被收集到肝素中时，最大产量的纤维蛋白原出现在血浆中鱼精蛋白浓度为11mg/mL时(与之不同的是当不存在肝素时为10mg/mL)，使血浆中95±1％(n＝4)的纤维蛋白原沉淀。在该鱼精蛋白浓度下，在浓缩物中发现了31±3％(n＝4)的血浆中的因子XIII。当存在肝素时，未观察到纤维蛋白原凝固性的改变。
实施例6纤维蛋白凝块的抗张强度
测试了纤维蛋白凝块的抗张强度。将有机玻璃加工成两半部分的狗骨形的模子，形成凝块的形状。将硬海绵置于端部，以使凝块在其中或围绕其形成；海绵通过带有O环封口的可移动的有机玻璃托中的插销被固定在模子中。凝块直径在狭窄颈部的中心为2mm，在较宽的端部为6.5mm，长度为31mm，模子的总体积为1.5mL。狭窄的颈部提供了凝块断裂的最薄弱点；使凝块断裂的力被用作其抗张强度的指征。
通过同时将不同注射器中的纤维蛋白原和凝血酶排到共同的导管中，再将混合物通过一端的海绵进入模子并通过另一端的海绵排出而制备试验样品。注意避免在空腔填充过程中引入空气。所述的海绵有凝块物质渗透至其核心，提供了在测试过程中牢固吸附凝块的方法。当对样品给予时间进行“愈合”(除非是在测试不同的愈合时间，否则为30分钟)后，取下有机玻璃模子，将凝块转移至Instron Model 1120通用测试仪器(Instron公司，Norwood，MA，最大载量500g)上，在此处它通过海绵“夹子”被固定在端点。在样品以100mm/分钟伸张的同时，记录应力-应变曲线，直到其破裂。抗张强度被记录为持续的最大应力。
实施例7纤维蛋白凝块的粘合强度
测试了纤维蛋白凝块的粘合强度。通过将纤维蛋白胶夹在两条主动脉组织之间，并随后将它们拉开，从而模拟封闭剂粘合组织的性能来评价纤维蛋白胶的粘合强度。牛的主动脉通过将主动脉沿长度方向纵切并将其摊平来制备。接着将该主动脉切成更小的条，每个约3cm长，1cm宽。由于凝块不粘附内皮层，所以将小条沿长度方向在血管外膜和内膜之间切开，得到两条更薄的条，它们各有一侧暴露的介质。使用封闭剂(0.1mL)覆盖到约1cm2面积的所示暴露介质上。形成重叠的连接处(占各条约1/3的长度)，并在22℃下用100g重量保持在此位置上使之“愈合”30分钟。愈合后的样品的未重叠端点被夹在Instron Model 1120通用测试仪器(最大载量500g)上，在样品以100mm/分钟伸张的同时，记录应力-应变曲线，直到重叠(胶合)的连接处断开。用持续的最大应力除以连接处的面积(通过在连接处断开后仍可见到的胶合区域来指示，并用数字测径仪测量)而获得粘合强度。
实施例8钙对抗张强度和粘合强度的影响
为了评价在向纤维蛋白原浓缩物中加入氯化钙时抗张强度的增加(参见结果部分)是否由因子XIII造成，对从纯纤维蛋白原(Enzyme ResearchLaboratories，Swansea，Mid Glamorgan，英国)制备的样品在加入和不加入因子XIII(Enzyme Research Laboratories，Swansea，Mid Glamorgan，英国，平均官能度为6200Loewy单位/mg)和钙的条件下的抗张强度进行了测量。从15mg/mL纯纤维蛋白原浓缩物(按实施例2所述制备)制备了如下所述的样品：
1.只有纤维蛋白原
2.纤维蛋白原+氯化钙(8.9mM)
3.纤维蛋白原+因子XIII(10μg/mL)
4.纤维蛋白原+因子XIII(10μg/mL)+氯化钙(8.9mM)。
通过将氯化钙(浓度为1.8-100mM)加入到15mg/mL纤维蛋白原浓缩物中，研究钙对凝块抗张强度和粘合强度的影响。钙浓度为8.9-50mM时达到最大的抗张强度，钙浓度为3.6-100mM时获得最大的粘合强度(图3)。
如上所述在加入和不加入钙和因子XIII的条件下从纯纤维蛋白原制备凝块。当因子XIII和钙一起加入时，抗张强度增加约50kPa(图4)，类似地，发现当钙浓度从0增加到8.9mM时，封闭剂的抗张强度增加65kPa(图3)。
实施例9愈合时间对抗张强度的影响
通过将用模子制备的凝块和胶合的主动脉条(如实施例7所述)在22℃下愈合1、5、10、15、30和60分钟来评价愈合时间对抗张强度和粘合强度的影响。在加入和不加入氯化钙(8.9mM)的条件下从15mg/mL纤维蛋白原浓缩物制备样品。
对于不同愈合时间的凝块，加钙的在1分钟内(可以被测量的最短时间)达到最大抗张强度，未加钙的约为5分钟(图5)。钙存在时的最大粘合强度约两倍于不含钙时的粘合强度，但是需要更长的愈合时间来实现(15分钟对比5分钟)。
实施例10纤维蛋白原浓度对抗张强度的影响
为了评价纤维蛋白原浓度对抗张强度和粘合强度的影响，在加入和不加入氯化钙(终浓度8.9mM)的条件下使用纤维蛋白原浓度15、30、45和60mg/mL来制备样品。对照采用混合的人血浆(纤维蛋白原浓度约3mg/mL)、纯纤维蛋白原(15mg/mL)和Tisseel(平均纤维蛋白原浓度约95mg/mL)。模制的凝块和胶合的连接处的愈合时间为30分钟。
发现抗张强度和粘合强度随纤维蛋白原浓度增加而近似于线性的增加(图6)。从血浆制备的样品的粘合强度接近于从鱼精蛋白-纤维蛋白原浓缩物制备的样品的曲线。15mg/mL纯纤维蛋白原样品的抗张强度显著高于15mg/mL鱼精蛋白-纤维蛋白原样品(p＜0.05)。与浓缩纤维蛋白原形成的蛋白胶相比，发现鱼精蛋白在纤维蛋白原浓缩物中的存在降低了所形成的蛋白胶的粘合强度。
在每种纤维蛋白原浓度下，与不加钙的纤维蛋白原浓缩物相比，加入氯化钙都显著增加抗张强度(p＜0.05)和粘合强度(p＜0.05)。当向纯纤维蛋白原中加入氯化钙时，未观察到抗张强度或粘合强度的改变，推测这是因为在纯纤维蛋白原浓缩物中没有因子XIII存在。而且，当向柠檬酸盐血浆中加入氯化钙时，也未观察到抗张强度或粘合强度的改变。这可能是因为：1)某些游离的钙仍然存在于柠檬酸盐血浆中，使得因子XIII在即使不加入氯化钙时也能起作用；或者2)血浆中的因子XIII浓度很低(与鱼精蛋白-纤维蛋白原浓缩物中的浓度20、50、70和95μg/mL相比而言，在血浆中正常的浓度为10μg/mL)。
Tisseel显示出与鱼精蛋白-纤维蛋白原浓缩物(45-60mg/mL纤维蛋白原)在加钙的条件下制备的封闭剂相似的抗张强度，以及与鱼精蛋白-纤维蛋白原浓缩物(45-60mg/mL纤维蛋白原)在不加钙的条件下制备的封闭剂相似的粘合强度。Tisseel的粘合强度显著低于由30、45和60mg/mL的纤维蛋白原浓缩物在加入氯化钙条件下形成的封闭剂胶的粘合强度(p＜0.05)。
15mg/mL的纯纤维蛋白原样品的抗张强度和粘合强度显著高于15mg/mL鱼精蛋白-纤维蛋白原样品(p＜0.05)。这两种制备物的主要差别在于其中一种使用鱼精蛋白进行沉淀。为了检验该假设(即，加入鱼精蛋白对抗张强度有不利影响)，从纯纤维蛋白原通过鱼精蛋白沉淀制备了纤维蛋白原浓缩物(15mg/mL)，与15mg/mL没有进行沉淀的纯纤维蛋白原浓缩物进行比较(纤维蛋白原浓度在这两种样品中都已进行了确认)。鱼精蛋白沉淀的纯纤维蛋白原的抗张强度显著低于(p＜.05)纯纤维蛋白原(图7)，推测这是由于浓缩物中存在鱼精蛋白。
实施例11纤维蛋白溶解的抑制剂对抗张强度的影响
由于负责血浆中的纤溶作用的酶可以影响凝块的抗张强度和粘合强度，所以研究了纤溶作用抑制剂的存在对抗张强度和粘合强度的影响。在加入或不加入氯化钙(8.9mM)的条件下从15mg/mL纤维蛋白原浓缩物制备样品。在某些样品中，将抑肽酶(特斯乐注射剂，拜尔公司，West Haven，CT)加入到纤维蛋白原浓缩物中(终浓度＝3000KIU/mL)。在其他样品中，将ε-氨基己酸(Sigma化学品公司)加入到纤维蛋白原浓缩物中(终浓度＝10mg/mL)。在加入抗纤维蛋白溶解药后，未观察到抗张强度或粘合强度的显著改变(图8)。
实施例12从全血中制备自体的纤维蛋白胶
使用蓝头的真空采血管(vacutainer)系统来收集柠檬酸盐血(20ml)，并转移到预先分装了200mg鱼精蛋白(4.0ml，来自50mg/ml的溶液)的30ml注射器中，轻柔混合5分钟，将鱼精蛋白和血的混合溶液2倒入如图9所示的特别设计的管中。当血液通过滤器6时，沉淀的纤维蛋白原被捕获在玻璃珠4(0.1mm直径的珠，在1-cm柱中，由尼龙筛网滤器支持)上。一旦所有的血液排尽，将滤器用15ml等份的盐水(0.15M NaCl)清洗3次，以除去未粘附的细胞/蛋白质。在第三次清洗后，排出所有残余在管中的盐水，关闭龙头，加入2.0ml 0.2M柠檬酸钠。在用巴斯德吸管充分混合后，将所述流体排出到3-ml注射器中作为纤维蛋白原浓缩物。当纤维蛋白原浓缩物与凝血酶溶液(在2M CaCl2中，浓度为每ml纤维蛋白原浓缩物中为500单位的溶液；1∶4体积/浓缩物体积)混合时，立即形成粘稠的纤维蛋白凝胶，用作纤维蛋白封闭剂。从将血液加入混合室到回收浓缩物的时间一般不超过15分钟。从全血中制备的纤维蛋白原浓缩物具有类似于市售的纤维蛋白胶Tisseel V(Baxter Healthcare，CA)的物理化学特性。
应当理解，上述的方案仅是对本发明原理的应用的说明。在不背离本发明的主旨和范围的条件下，可以做出许多修改和替代方案，同时本发明已经在附图中显示并且通过特征和细节以及目前看来是最实际和最优选的本发明实施方案而得到了充分的描述，对本领域普通技术人员而言很明显的是，在不背离如权利要求所述的本发明的原理和概念的条件下可以进行很多修改。

Claims (97)

1.制备和凝固浓缩纤维蛋白原组合物的方法，其包括：向包含纤维蛋白原的流体中加入足够量的阳离子剂，使纤维蛋白原形成纤维蛋白原沉淀；收集纤维蛋白原沉淀；收集后，将该纤维蛋白原沉淀悬浮或溶解于液态溶媒中以形成浓缩纤维蛋白原组合物；以及使该浓缩纤维蛋白原组合物凝固。
2.如权利要求1所述的方法，其中浓缩纤维蛋白原组合物具有至少是包含纤维蛋白原的流体中纤维蛋白原浓度的两倍的纤维蛋白原浓度。
3.如权利要求1所述的方法，其中所述的收集是通过重力沉降、离心、过滤或其组合来进行。
4.如权利要求3所述的方法，其中所述的收集是通过过滤来进行。
5.如权利要求4所述的方法，其中所述的收集是使用便携式过滤装置来进行。
6.如权利要求3所述的方法，其中所述的收集是通过离心来进行。
7.如权利要求1所述的方法，其中液态溶媒包括选自柠檬酸钠、氢氧化钠、氢氧化钾、肝素、硫酸类肝素及其混合物的成员。
8.如权利要求1所述的方法，其中液态溶媒包括柠檬酸钠。
9.如权利要求1所述的方法，其中包含纤维蛋白原的流体是全血。
10.如权利要求1所述的方法，其中阳离子剂选自鱼精蛋白、聚赖氨酸、聚烯丙胺、组蛋白及它们的混合物。
11.如权利要求10所述的方法，其中阳离子剂是鱼精蛋白.
12.如权利要求1所述的方法，其中包含纤维蛋白原的流体是血浆。
13.如权利要求1所述的方法，其中所述的收集是通过离心来进行并且液态溶媒包括柠檬酸钠。
14.如权利要求1所述的方法，其中存在于浓缩纤维蛋白原组合物中的纤维蛋白原的浓度为10mg/ml-200mg/ml。
15.如权利要求1所述的方法，其中存在于浓缩纤维蛋白原组合物中的纤维蛋白原的浓度为20mg/ml-100mg/ml。
16.如权利要求1所述的方法，其中存在于浓缩纤维蛋白原组合物中的纤维蛋白原的浓度为20mg/ml-60mg/ml。
17.如权利要求1所述的方法，其中存在于浓缩纤维蛋白原组合物中的纤维蛋白原的浓度至少为约15mg/ml。
18.如权利要求1所述的方法，其中浓缩纤维蛋白原组合物还包含至少一种选自因子II、因子IX、因子X和因子XIII的凝血因子。
19.如权利要求1所述的方法，其中浓缩纤维蛋白原组合物还包含至少两种选自因子IX、因子X、因子XIII和因子II的凝血因子。
20.如权利要求1所述的方法，其中浓缩纤维蛋白原组合物还包含至少三种选自因子II、因子IX、因子X和因子XIII的凝血因子。
21.如权利要求1所述的方法，其中浓缩纤维蛋白原组合物还包含每一种凝血因子II、因子IX、因子X和因子XIII。
22.如权利要求1所述的方法，其中凝固步骤包括将凝固试剂与浓缩纤维蛋白原组合物混合。
23.如权利要求22所述的方法，其中凝固试剂选自钙盐、镁盐、促凝血酶原激酶、肌动蛋白、凝血酶、胶原、血小板混悬液、沉淀或变性的蛋白、复合糖、硅石、锌、硅藻土、高岭土、鲁塞尔蝰蛇毒、利托菌素及其混合物。
24.如权利要求22所述的方法，其中凝固试剂是钙盐。
25.治疗伤口的方法，其包括：
a)向包含纤维蛋白原的流体中加入足够量的阳离子剂，使纤维蛋白原形成纤维蛋白原沉淀；
b)收集纤维蛋白原沉淀；
c)收集后，将该纤维蛋白原沉淀悬浮或溶解于液态溶媒中以形成浓缩纤维蛋白原组合物；
d)将浓缩纤维蛋白原组合物与凝固试剂混合形成纤维蛋白封闭剂，和
e)将一定量的纤维蛋白封闭剂应用于伤口，从而形成凝块。
26.如权利要求25所述的方法，其中伤口是外科手术产生的切口。
27.如权利要求25所述的方法，其中伤口是受伤的结果。
28.如权利要求27所述的方法，其中受伤是溃疡、骨折或组织撕裂。
29.如权利要求25所述的方法，其中在伤口位置有身体表面的活动性出血。
30.如权利要求25所述的方法，其中凝固试剂选自钙盐、镁盐、促凝血酶原激酶、肌动蛋白、凝血酶、胶原、血小板混悬液、沉淀或变性的蛋白、复合糖、硅石、锌、硅藻土、高岭土、鲁塞尔蝰蛇毒、利托菌素及其混合物。
31.如权利要求25所述的方法，其中凝血酶以每ml纤维蛋白封闭剂中为50单位-500单位的浓度存在于纤维蛋白封闭剂中。
32.如权利要求25所述的方法，其中浓缩纤维蛋白原组合物包含至少一种选自因子II、因子IX、因子X和因子XIII的凝血因子。
33.如权利要求25所述的方法，其中凝固试剂包括钙、镁或其混合物。
34.如权利要求33所述的方法，其中凝固试剂包括钙，并且其以氯化钙形式在纤维蛋白原封闭剂中以1.8nM-100nM的浓度存在。
35.如权利要求33所述的方法，其中凝固试剂包括钙，并且其以氯化钙形式在纤维蛋白原封闭剂中以8.9nM-50nM的浓度存在。
36.如权利要求33所述的方法，其中凝固试剂包括镁，并且其以氯化镁形式在纤维蛋白原封闭剂中以1.8nM-100nM的浓度存在。
37.如权利要求33所述的方法，其中凝固试剂包括镁，并且其以氯化镁形式在纤维蛋白原封闭剂中以8.9nM-50nM的浓度存在。
38.如权利要求25所述的方法，其中纤维蛋白原封闭剂在少于5分钟内形成凝块。
39.如权利要求25所述的方法，其中纤维蛋白原封闭剂在少于约3分钟内形成凝块。
40.如权利要求25所述的方法，其中纤维蛋白原封闭剂在少于约1.5分钟内形成凝块。
41.如权利要求25所述的方法，其中纤维蛋白原封闭剂在少于约30秒内形成凝块。
42.从血液中制备浓缩纤维蛋白原组合物的方法，其包括：向血液中加入足够量的阳离子剂，使存在于全血中的纤维蛋白原形成纤维蛋白原沉淀；收集纤维蛋白原沉淀；收集后，将该纤维蛋白原沉淀悬浮或溶解于液态溶媒中以形成浓缩纤维蛋白原组合物。
43.如权利要求42所述的方法，其中浓缩纤维蛋白原组合物具有至少是包含纤维蛋白原的流体中纤维蛋白原浓度的两倍的纤维蛋白原浓度。
44.如权利要求42所述的方法，其中该方法还包括使浓缩纤维蛋白原组合物凝固的步骤。
45.如权利要求42所述的方法，其中收集是通过重力沉降、离心、过滤或其组合来进行。
46.如权利要求45所述的方法，其中收集是通过过滤来进行。
47.如权利要求42所述的方法，其中收集是通过离心来进行。
48.如权利要求42所述的方法，其中液态溶媒包括选自柠檬酸钠、氢氧化钠、氢氧化钾、肝素、硫酸类肝素及其混合物的成员。
49.如权利要求42所述的方法，其中存在于浓缩纤维蛋白原组合物中的纤维蛋白原的浓度为10mg/ml-200mg/ml。
50.如权利要求42所述的方法，其中存在于浓缩纤维蛋白原组合物中的纤维蛋白原的浓度为20mg/ml-100mg/ml。
51.如权利要求42所述的方法，其中存在于浓缩纤维蛋白原组合物中的纤维蛋白原的浓度为20mg/ml-60mg/ml。
52.如权利要求42所述的方法，其中浓缩纤维蛋白原组合物还包含至少一种选自因子II、因子IX、因子X和因子XIII的凝血因子。
53.如权利要求42所述的方法，其中至少一种凝血因子在浓缩纤维蛋白原组合物中以所述至少一种凝血因子在全血中浓度的25％的浓度存在。
54.如权利要求42所述的方法，其中至少一种凝血因子在浓缩纤维蛋白原组合物中以所述至少一种凝血因子在全血中浓度的50％的浓度存在。
55.如权利要求42所述的方法，其中至少一种凝血因子在浓缩纤维蛋白原组合物中以所述至少一种凝血因子在全血中浓度的75％的浓度存在。
56.如权利要求42所述的方法，其中浓缩纤维蛋白原组合物还包含至少两种选自因子II、因子IX、因子X和因子XIII的凝血因子。
57.如权利要求42所述的方法，其中浓缩纤维蛋白原组合物还包含至少三种选自因子II、因子IX、因子X和因子XIII的凝血因子。
58.如权利要求42所述的方法，其中阳离子剂选自鱼精蛋白、聚赖氨酸、聚烯丙胺、组蛋白及它们的混合物。
59.制备和使用自体的纤维蛋白胶的方法，其包括：收集来自个体的包含纤维蛋白原的流体；向包含纤维蛋白原的流体样品中加入足够量的阳离子剂，使纤维蛋白原形成纤维蛋白原沉淀；收集纤维蛋白原沉淀；将该纤维蛋白原沉淀悬浮或溶解于液态溶媒中以形成浓缩纤维蛋白原组合物；将浓缩纤维蛋白原组合物应用于个体伤口以形成纤维蛋白胶，其中该纤维蛋白胶形成凝块。
60.如权利要求59所述的方法，其中收集是通过重力沉降、离心、过滤或其组合来进行。
61.如权利要求59所述的方法，其中液态溶媒包括选自柠檬酸钠、氢氧化钠、氢氧化钾、肝素、硫酸类肝素及其混合物的成员。
62.如权利要求59所述的方法，其中包含纤维蛋白原的流体是全血。
63.如权利要求59所述的方法，其中包含纤维蛋白原的流体是血浆。
64.如权利要求59所述的方法，其中存在于浓缩纤维蛋白原组合物中的纤维蛋白原的浓度为10mg/ml-200mg/ml。
65.如权利要求59所述的方法，其中存在于浓缩纤维蛋白原组合物中的纤维蛋白原的浓度为20mg/ml-100mg/ml。
66.如权利要求59所述的方法，其中存在于浓缩纤维蛋白原组合物中的纤维蛋白原的浓度为20mg/ml-60mg/ml。
67.如权利要求59所述的方法，其中浓缩纤维蛋白原组合物还包含至少一种选自因子II、因子IX、因子X和因子XIII的凝血因子。
68.如权利要求59所述的方法，其中浓缩纤维蛋白原组合物还包含至少两种选自因子II、因子IX、因子X和因子XIII的凝血因子。
69.如权利要求59所述的方法，其中浓缩纤维蛋白原组合物还包含至少三种选自因子II、因子IX、因子X和因子XIII的凝血因子。
70.如权利要求59所述的方法，其中浓缩纤维蛋白原组合物与用来加快伤口上的纤维蛋白胶形成速度的凝固试剂一起应用于伤口。
71.如权利要求70所述的方法，其中凝固试剂选自钙盐、镁盐、促凝血酶原激酶、肌动蛋白、凝血酶、胶原、血小板混悬液、沉淀或变性的蛋白、复合糖、硅石、锌、硅藻土、高岭土、鲁塞尔蝰蛇毒、利托菌素及其混合物。
72.如权利要求70所述的方法，其中凝固试剂和浓缩纤维蛋白原组合物在应用步骤之前或应用过程中立即混合。
73.如权利要求59所述的方法，其中浓缩纤维蛋白原组合物通过其与存在于伤口位置的体液相互作用来形成纤维蛋白胶。
74.如权利要求59所述的方法，其中阳离子剂选自鱼精蛋白、聚赖氨酸、聚烯丙胺、组蛋白及它们的混合物。
75.制备纤维蛋白胶的系统，该系统包括：
第一种组分，所述第一种组分是包含10mg/ml-200mg/ml纤维蛋白原以及至少一种选自因子II、因子IX、因子X和因子XIII的凝血因子的流体；和
第二种组分，其包含用于所述纤维蛋白原的凝固试剂，其中当所述第一种组分与第二种组分接触时，形成纤维蛋白胶。
76.如权利要求75所述的系统，其中凝血因子是因子X。
77.如权利要求76所述的系统，其中因子X在第一种组分中以因子X在正常血液中浓度的25％的浓度存在。
78.如权利要求75所述的系统，其中凝血因子是因子II。
79.如权利要求78所述的系统，其中因子II在第一种组分中以因子II在正常血液中浓度的25％的浓度存在。
80.如权利要求75所述的系统，其中凝血因子是因子XIII。
81.如权利要求80所述的系统，其中因子XIII在第一种组分中以因子XIII在正常血液中浓度的25％的浓度存在。
82.如权利要求75所述的系统，其中在第一种组分中至少存在两种凝血因子。
83.如权利要求75所述的系统，其中在第一种组分中至少存在三种凝血因子。
84.如权利要求75所述的系统，其中在第一种流体中存在每一种凝血因子II、因子IX、因子X和因子XIII。
85.如权利要求75所述的系统，其中存在于第一种组分中的纤维蛋白原的浓度为10mg/ml-100mg/ml。
86.如权利要求75所述的系统，其中存在于第一种组分中的纤维蛋白原的浓度为20mg/ml-60mg/ml。
87.如权利要求75所述的系统，其中第二种组分由伤口提供。
88.如权利要求75所述的系统，其中该系统的配置使得第一种组分与第二种组分存在于不同容器内。
89.如权利要求75所述的系统，其中凝固试剂选自钙盐、镁盐、促凝血酶原激酶、肌动蛋白、凝血酶、胶原、血小板混悬液、沉淀或变性的蛋白、复合糖、硅石、锌、硅藻土、高岭土、鲁塞尔蝰蛇毒、利托菌素及其混合物。
90.如权利要求75所述的系统，其中第一种流体的制备是通过以下步骤：向包含纤维蛋白原的流体中加入足够量的鱼精蛋白，使纤维蛋白原形成纤维蛋白原沉淀；收集纤维蛋白原沉淀；将纤维蛋白原沉淀悬浮或溶解在液态溶媒中以形成第一种流体。
91.制备浓缩纤维蛋白原组合物的方法，其包括：向包含纤维蛋白原的流体中加入足够量的鱼精蛋白，使纤维蛋白原形成纤维蛋白原沉淀；通过离心收集纤维蛋白原沉淀；收集后，将纤维蛋白原沉淀悬浮或溶解在包含柠檬酸钠的液态溶媒中，形成浓缩纤维蛋白原组合物；其中在浓缩纤维蛋白原组合物中的纤维蛋白原浓度是包含纤维蛋白原的流体中纤维蛋白原浓度的至少两倍。
92.如权利要求91所述的方法，其中包含纤维蛋白原的流体是全血。
93.如权利要求91所述的方法，其中包含纤维蛋白原的流体是血浆。
94.如权利要求91所述的方法，其中存在于浓缩纤维蛋白原组合物中的纤维蛋白原的浓度为10mg/ml-200mg/ml。
95.如权利要求91所述的方法，其中存在于浓缩纤维蛋白原组合物中的纤维蛋白原的浓度为20mg/ml-60mg/ml。
96.如权利要求91所述的方法，其中浓缩纤维蛋白原组合物还包含至少一种选自因子II、因子IX、因子X和因子XIII的凝血因子。
97.制备纤维蛋白胶的系统，该系统包括：包含10mg/ml-200mg/ml纤维蛋白原以及至少一种选自因子II、因子IX、因子X和因子XIII的凝血因子的流体，其中在应用于伤口时形成纤维蛋白胶。
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