CN101703763A - 人纤维蛋白原的生产方法 - Google Patents

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Abstract

本发明的人纤维蛋白原的生产方法，采用了有悖于国内常规厂家从组份I提取、分离人纤维蛋白原的方法，而改从冷沉淀中提取人纤维蛋白原，生产中采用的S/D法和水浴热处理法双重病毒灭活，能有效的灭活脂包膜病毒和非脂包膜病毒，确保了制品安全；提取出的产品纯度高达90％以上，杂质蛋白含量低，产品的临床副反应小。本发明的人纤维蛋白原，生产过程中采用一甘氨酸作为稳定剂，通过延长冻干时间约需6-8天，而一般厂家均为3天左右，使得产品在冻干过程中温度变化稳定，冻干后产品的结构均一，这时再对制品进行水浴热处理，可以在最短的时间内受热均匀，在达到有效的灭活DNA和RNA非脂包膜病毒的同时保证了人纤维蛋白原的稳定性。

Description

人纤维蛋白原的生产方法
技术领域
本发明涉及血液制品领域，特别涉及一种人纤维蛋白原的生产方法。
背景技术
背景资料：人纤维蛋白原主要由肝脏合成，人体含量约为2.5～4.0g/L左右。大部分存在于人体血浆中，仅有不到20％存在于血管外。主要应用于先天性、获得性纤维蛋白原减少症、严重肝脏损伤、肝硬化、DIC以及手术或者产后大出血等的治疗，是临床上用于大出血止血的必备急救药品之一。国内目前虽有几家血液制品厂家具备可生产人纤维蛋白原的资质，但这些厂家在生产过程中采用的都是以血浆离心上清液经低温乙醇分划，生产出的组分I为原料，制得成品。但该工艺主要存在的问题，一是：纯度不高，这些厂家生产出来的制品纯度都在80％以下，产品杂质含量偏多，患者在注射使用时，容易发生不良反应；二是：作为风险性较高的血液制品，2005版《中国药典》明确规定：人纤维蛋白原制品在生产过程中必须采用二种不同的病毒灭活方法，以减少产品携带病毒的风险，确保制品的安全。对于灭活脂包膜病毒的S/D法，国内、国际已有10多年的成熟经验，是一种较好的，可彻底灭活病毒的方法。但灭活非脂包膜病毒的方法，特别是同时具备灭活DNA和RNA非脂包膜病毒的能力，国际上还没有一个完整的、成熟的方法，而100℃，30分钟的干热处理，是目前国内其他厂家采用较多的方法之一。采用该方法，需要考虑产品稳定剂的组成，通用的做法都是添加一种以上的氨基酸作为保护剂。但复合的氨基酸组成却易导致产品加热后发黄、复溶困难、及复溶后有大量的变性蛋白等问题，直接影响这些厂家产品的质量；三是：作为DNA非脂包膜病毒的模拟病毒---PPV病毒，由于其超强的耐热性和耐酸碱性，一般厂家按照从组份I制造工艺提取出的制品，在对其灭活效果上有很大的难度。我公司的人纤维蛋白原，是以冷沉淀为原料，通过抽提、吸附、离心等制造工艺，并采用国际上先进的离子交换层析技术进行提纯，使得产品的纯度得到了很大的提高。生产过程中采用一种氨基酸作为稳定剂，通过延长冻干时间(约需6天左右，而一般厂家均为3天左右)，使得产品在冻干过程中温度变化稳定，冻干后产品的结构均一。这时再对制品进行水浴热处理，可以在最短的时间内受热均匀，达到有效的灭活DNA和RNA非脂包膜病毒的效果。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种纯度高，稳定性高，灭活病毒效果好的人纤维蛋白原的生产方法。
为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：
一种人纤维蛋白原的生产方法，其中，步骤为：
(1)将病毒检测合格，并且符合国家检疫期规定的原料血浆20000～5000rmp的速度进行连续离心分离；
(2)沉淀溶解、离心：在每公斤步骤(1)所得的沉淀中加入3～8L注射用水，搅拌60～300分钟以上使沉淀完全溶解，调节溶解液的温度到20～40℃，将其pH值调节到6.4～7.4，然后以20000～5000rmp的速度进行连续离心分离，离心所得上清液用洁净过滤器进行洁净过滤；
(3)病毒灭活：在步骤(2)所得的上清液中添加氯化钙溶液，使所得混合溶液中氯化钙浓度为1mmol/L，并将其温度调节为20～30℃，然后再添加吐温-80和TNBP，使溶液中吐温-80的最终浓度为1％，TNBP最终浓度为0.3％，将所得液体在专用的病毒灭活罐内，以40～100rmp低速搅拌，在24～26℃条件下保温6～8小时；
(4)层析精制：用DEAE-650M凝胶层析柱吸附步骤(3)所得的溶液，对通过层析柱的滤液进行收集，吸附结束后，用3倍凝胶体积的枸橼酸盐缓冲液洗涤，将层析柱中的残余的人纤维蛋白原洗涤出来一并收集；
(5)沉淀离心分离：在步骤(4)所收集的液体中添加甘氨酸，使所得混合溶液中甘氨酸的浓度为2mol/L，待甘氨酸充分溶解完全后，将溶液冷却至0～10℃，用离心机对其以20000～5000rmp的速度进行连续离心分离；
(6)配制：用枸橼酸钠和蔗糖缓冲液溶解步骤(5)所得的沉淀，使溶解后溶液中枸橼酸钠浓度达到39～54mmol/L和蔗糖浓度为40～60g/L的范围，搅拌2～6小时使沉淀完全溶解，然后调节蛋白浓度到2.0～3.0％，并用0.5M盐酸溶液或0.5M氢氧化钠溶液将产品的pH值调节到6.4～7.4；
(7)除菌过滤：用灭菌好的过滤器对步骤(6)所得的液体进行除菌过滤；
(8)分装、冻干：对步骤(7)所得的液体进行分装，然后进行冻干，冻干时间为4～8天，冻干前先对冻干机急速冻结至-40℃以下，注意冻干过程前后和整个过程中，制品的温度不能超过35℃，冻干后制品在真空状态下完全密闭胶塞，在冻干机内部注入无菌空气，使压力达到平衡；
(9)热处理：将步骤(8)所得的产品，进行100℃±2℃，30分钟的水浴热处理。
本发明所述的人纤维蛋白原的生产方法，其中，步骤(1)中在0～4℃的条件下进行离心。
本发明所述的人纤维蛋白原的生产方法，其中，步骤(1)中所采用的原料血浆为冰冻血浆。
本发明所述的人纤维蛋白原的生产方法，其中，对冰冻血浆处理的方法为，在室温下让其自然融化，用75％的酒精进行消毒血浆袋表面，再用20～25℃左右的注射用水冲洗血浆袋表面的酒精，破袋，将血浆收集在专用的带有夹层的血浆收集罐，用25～35℃的循环水进行循环加热。
本发明所述的人纤维蛋白原的生产方法，其中，步骤(1)离心所得的沉淀保管在-30℃以下冷库内，将其取出后在室温下破碎成小块，然后再进行步骤(2)。
本发明所述的人纤维蛋白原的生产方法，其中，步骤(2)中用0.1M醋酸溶液将溶解液的PH值调节为7.0。
本发明所述的人纤维蛋白原的生产方法，其中，步骤(2)中所述的过滤器孔径为1.0μm。
本发明所述的人纤维蛋白原的生产方法，其中，步骤(3)中所得液体在专用的病毒灭活罐内，以70rmp低速搅拌，在25℃条件下保温6小时。
本发明所述的人纤维蛋白原的生产方法，其中，在步骤(7)所述的除菌过滤中，过滤器孔径为0.22～0.45μm；步骤(8)中冻干的时间为6天.
本发明中所述的枸橼酸盐缓冲液是指氯化钠浓度为120mmol/L和枸橼酸钠浓度为10mmol/L的缓冲液。
本发明的优点：
1、本发明的人纤维蛋白原的生产方法，采用了有悖于国内常规厂家从组份I提取、分离人纤维蛋白原的方法，而改从冷沉淀中提取人纤维蛋白原，生产中采用的S/D法和水浴热处理法双重病毒灭活，能有效的灭活脂包膜病毒和非脂包膜病毒，确保了制品安全；提取出的产品纯度高达90％以上，杂质蛋白含量低，产品的临床副反应小。
2、本发明的人纤维蛋白原，生产过程中采用一甘氨酸作为稳定剂，通过延长冻干时间约需6-8天，而一般厂家均为3天左右，使得产品在冻干过程中温度变化稳定，冻干后产品的结构均一，这时再对制品进行水浴热处理，可以在最短的时间内受热均匀，在达到有效的灭活DNA和RNA非脂包膜病毒的同时保证了人纤维蛋白原的稳定性。
具体实施方式
实施例1
1、血浆收集：将病毒检测合格，并且符合国家检疫期规定的冰冻原料血浆100L，在室温下自然融化，用75％的酒精进行消毒血浆袋表面，再用25℃的注射用水冲洗血浆袋表面的酒精，破袋，将血浆收集在专用的带有夹层的血浆收集罐，用35℃的循环水进行循环加热，融化好的血浆及时转移到离心专用罐，并控制血浆的温度在4℃，注入离心机以5000rmp的速度进行连续离心分离，离心的上清液用于人血白蛋白、人免疫球蛋白等的制造，离心的固体成分---冷沉淀2.0kg用于人纤维蛋白原的生产。
2、冷沉淀溶解、离心：
将保管于-30℃以下冷库内的冷沉淀2.0kg拿出，尽可能破碎成小块，加入6L注射用水，搅拌60分钟使冷沉淀完全溶解。调节溶解液的温度到40℃，使用0.1M醋酸溶液将其pH值调节到7.4，然后以5000rmp的速度进行连续离心分离，离心所得上清液用洁净过滤器进行洁净过滤，得滤液7L。
3、病毒灭活：
在收集的离心上清液中添加氯化钙溶液70ml，使得溶液中氯化钙浓度达到1mmol/L，将收集罐中产品的温度调节为℃，然后添加吐温-8073.5g和TNBP22.1ml，使溶液中二者的最终浓度分别达到1％和0.3％。在专用的病毒灭活罐内，以100rmp低速搅拌，在25℃条件下加热6小时，灭活产品中可能残存的或者生产中带入的脂包膜病毒。病毒灭活后的作业场所、空调及设备要与灭活前的完全分开。
4、层析精制：
用DEAE-650M凝胶吸附病毒灭活后的溶液，此时对通过层析柱的滤液进行收集，用于人纤维蛋白原的制造。吸附结束后，用3倍凝胶体积量的枸橼酸盐缓冲液洗涤，将层析柱中的残余的人纤维蛋白原洗涤出来，二者一并收集到专用的人纤维蛋白原收集罐，共收集洗出液8L。
5、沉淀离心分离：
在收集的滤液中添加甘氨酸1200g，充分溶解完全后冷却至10℃，以5000rmp的速度进行连续离心分离，此时得到的即为纤维蛋白原沉淀.此步骤同时也去除了用于病毒灭活的吐温-80和TNBP.
6、配制：
用枸橼酸钠和蔗糖缓冲液溶解二次沉淀，使溶解后溶液中枸橼酸钠浓度达到54mmol/L，蔗糖浓度为60g/L，搅拌6小时使沉淀完全溶解，然后调节蛋白浓度到3.0％，并用0.5M盐酸溶液2.0ml将产品的pH值调节到7.4。
7、除菌过滤：
用灭菌好的过滤器对配制的液体进行除菌过滤，过滤器的孔径为0.22μm。过滤结束后检查除菌过滤器的完整性，不合格时要迅速再过滤一次，确保产品达到无菌要求。
8、分装、冻干：
在洁净度为100级的区域内按照标示的装量进行分装，冻干前先对冻干机急速冻结至-40℃以下，注意冻干工程中制品的温度不能超过35℃，冻干时间为8小时。冻干后制品在真空状态下完全密闭胶塞，在冻干机内部注入无菌空气，使压力达到平衡。
9、热处理：
冻干结束后的产品，进行100℃±2℃，30分钟的水浴热处理，灭活可能残存的或生产中带入的非脂包膜病毒，确保了制品的安全。
实施例2
1、血浆收集：将病毒检测合格，并且符合国家检疫期规定的冰冻原料血浆100L，在室温下自然融化，用75％的酒精进行消毒血浆袋表面，再用20℃的注射用水冲洗血浆袋表面的酒精，破袋，将血浆收集在专用的带有夹层的血浆收集罐，用25℃的循环水进行循环加热，融化好的血浆及时转移到离心专用罐，并控制血浆的温度在0℃，注入离心机以20000rmp的速度进行连续离心分离，离心的上清液用于人血白蛋白、人免疫球蛋白等的制造，离心的固体成分---冷沉淀2.0kg用于人纤维蛋白原的生产。
2、冷沉淀溶解、离心：
将保管于-30℃以下冷库内的冷沉淀2.0kg拿出，尽可能破碎成小块，加入16L注射用水，搅拌300分钟使冷沉淀完全溶解。调节溶解液的温度到20℃，使用0.1M醋酸溶液将其pH值调节到6.4，然后以20000rmp的速度进行连续离心分离，离心所得上清液用洁净过滤器进行洁净过滤，得滤液17L。
3、病毒灭活：
在收集的离心上清液中添加氯化钙溶液170ml，使得溶液中氯化钙浓度达到1mmol/L，将收集罐中产品的温度调节为30℃，然后添加吐温-80178.5g和TNBP53.7ml，使溶液中二者的最终浓度分别达到1％和0.3％。在专用的病毒灭活罐内，以40rmp低速搅拌，在24℃条件下加热7小时，灭活产品中可能残存的或者生产中带入的脂包膜病毒。病毒灭活后的作业场所、空调及设备要与灭活前的完全分开。
4、层析精制：
用DEAE-650M凝胶层析柱吸附病毒灭活后的溶液，此时对通过层析柱的滤液进行收集，用于人纤维蛋白原的制造。吸附结束后，用3倍凝胶体积量的枸橼酸盐缓冲液洗涤，将层析柱中的残余的人纤维蛋白原洗涤出来，二者一并收集到专用的人纤维蛋白原收集罐，共收集洗出液18.5L。
5、沉淀离心分离：
在收集的滤液中添加甘氨酸2775g，充分溶解完全后冷却至0℃，用离心机以20000rmp的速度进行连续离心分离，此时得到的即为纤维蛋白原沉淀。此步骤同时也去除了用于病毒灭活的吐温-80和TNBP。
6、配制：
用事枸橼酸钠和蔗糖缓冲液溶解二次沉淀，使溶解后溶液中枸橼酸钠浓度达到39mmol/L，蔗糖浓度为40g/L，搅拌2小时使沉淀完全溶解，然后调节蛋白浓度到2.0％，并用0.5M盐酸溶液2.0ml将产品的pH值调节到6.4。
7、除菌过滤：
用灭菌好的过滤器对配制的液体进行除菌过滤，过滤器的孔径为0.45μm。过滤结束后检查除菌过滤器的完整性，不合格时要迅速再过滤一次，确保产品达到无菌要求。
8、分装、冻干：
在洁净度为100级的区域内按照标示的装量进行分装，冻干前先对冻干机急速冻结至-40℃以下，注意冻干工程中制品的温度不能超过35℃，冻干时间为4小时。冻干后制品在真空状态下完全密闭胶塞，在冻干机内部注入无菌空气，使压力达到平衡。
9、热处理：
冻干结束后的产品，进行100℃±2℃，30分钟的水浴热处理，灭活可能残存的或生产中带入的非脂包膜病毒，确保了制品的安全。
实施例3
1、血浆收集：将病毒检测合格，并且符合国家检疫期规定的冰冻原料血浆100L，在室温下自然融化，用75％的酒精进行消毒血浆袋表面，再用22℃的注射用水冲洗血浆袋表面的酒精，破袋，将血浆收集在专用的带有夹层的血浆收集罐，用30℃的循环水进行循环加热，融化好的血浆及时转移到离心专用罐，并控制血浆的温度在2℃，注入离心机以12000rmp的速度进行连续离心分离，离心的上清液用于人血白蛋白、人免疫球蛋白等的制造，离心的固体成分---冷沉淀2.0kg用于人纤维蛋白原的生产。
2、冷沉淀溶解、离心：
将保管于-30℃以下冷库内的冷沉淀2.0kg拿出，尽可能破碎成小块，加入11L注射用水，搅拌300分钟使冷沉淀完全溶解。调节溶解液的温度到20℃，使用0.1M醋酸溶液将其pH值调节到7.0，然后以12000rmp的速度进行连续离心分离，离心所得上清液用洁净过滤器进行洁净过滤，得滤液12L。
3、病毒灭活：
在收集的离心上清液中添加氯化钙溶液120ml，使得溶液中氯化钙浓度达到1mmol/L，将收集罐中产品的温度调节为20℃，然后添加吐温-80126g和TNBP37.9ml，使溶液中二者的最终浓度分别达到1％和0.3％。在专用的病毒灭活罐内，以70rmp低速搅拌，在26℃条件下加热6小时，灭活产品中可能残存的或者生产中带入的脂包膜病毒。病毒灭活后的作业场所、空调及设备要与灭活前的完全分开。
4、层析精制：
用DEAE-650M凝胶层析柱吸附病毒灭活后的溶液，此时对通过层析柱的滤液进行收集，用于人纤维蛋白原的制造.吸附结束后，用3倍凝胶体积量的枸橼酸盐缓冲液洗涤，将层析柱中的残余的人纤维蛋白原洗涤出来，二者一并收集到专用的人纤维蛋白原收集罐，共收集洗出液13L.
5、沉淀离心分离：
在收集的滤液中添加甘氨酸1950g，充分溶解完全后冷却至5℃，以12000rmp的速度进行连续离心分离，此时得到的即为纤维蛋白原沉淀。此步骤同时也去除了用于病毒灭活的吐温-80和TNBP。
6、配制：
用事枸橼酸钠和蔗糖缓冲液溶解二次沉淀，使溶解后溶液中枸橼酸钠浓度达到47mmol/L，蔗糖浓度为50g/L，搅拌4小时使沉淀完全溶解，然后调节蛋白浓度到2.5％，并用0.5M盐酸溶液1.7ml将产品的pH值调节到7.0。
7、除菌过滤：
用灭菌好的过滤器对配制的液体进行除菌过滤，过滤器的孔径为0.35μm。过滤结束后检查除菌过滤器的完整性，不合格时要迅速再过滤一次，确保产品达到无菌要求。
8、分装、冻干：
在洁净度为100级的区域内按照标示的装量进行分装，冻干前先对冻干机急速冻结至-40℃以下，注意冻干工程中制品的温度不能超过35℃，冻干时间 为4小时。冻干后制品在真空状态下完全密闭胶塞，在冻干机内部注入无菌空气，使压力达到平衡。
9、热处理：
冻干结束后的产品，进行100℃±2℃，30分钟的水浴热处理，灭活可能残存的或生产中带入的非脂包膜病毒，确保了制品的安全。
实施例4
对实施例1所获得的产品和国内某厂家制品依照《中国药典》2005版(三部)规定的试验方法和试验标准进行的现行主要质量标准对比分析结果：
本发明经过S/D病毒灭活和100℃，30分钟的水浴热处理，以及离子交换层析纯化制得的人纤维蛋白原，其相关的质控项目如复溶时间、水分、纯度、凝固活力等远高于现行国家药典的标准和其他国内同行业公司的质量，相关的质量数据对比分析详见下表：
  试验项目   现行药典标准   公司制品(本发明)   国内某厂家制品
  鉴别试验(免疫双扩散)   仅与抗人的血浆产生沉淀线   合格   合格
  外观   为灰白色或淡黄色疏松体，复溶后溶液应为澄明溶液，可带轻微乳光   合格   合格
  真空度   瓶内应出现蓝紫色辉光   合格   合格
  试验项目   现行药典标准   公司制品(本发明)   国内某厂家制品
  可见异物   瓶内应出现蓝紫色辉光   合格   合格
  装量差异   符合规定   合格   合格
  热稳定性试验   无凝块或纤维蛋白析出   合格   合格
  复溶时间   ≤30分钟   15   26
  水分   ≤5.0％   2.2   4.4
  纯度   ≥70.0％   96   72
  纤维蛋白原总量   ≥0.5g/瓶   0.63   0.52
  凝固活力   ≤60秒   12   48
  磷酸三丁酯残留量   ≤10μg/ml   1.1   7.8
  聚山梨酯80残留量   ≤100μg/ml   9.8   34
  无菌检查   无菌生长   合格   合格
  异常毒性检查(小鼠)   动物健存，体重增加   合格   合格
  异常毒性检查(豚鼠)   动物健存，体重增加   合格   合格
  热原检查   合格   合格   合格
由上表可看出，本发明所制得的人纤维蛋白原，纯度、水分含量等重要指标远高于现行药典标准和他公司制品的质量标准，杂质蛋白含量低，产品的临床副反应小。
实施例5
该“人纤维蛋白原制备方法”中，引入了国际上先进的特定双重病毒灭活方法：S/D处理法(24～26℃，6～8小时)和终产品水浴处理法(100℃，30分钟)，可有效地灭活生产中、原料中带入或残存的脂包膜病毒和DNA、RNA非脂包膜病毒，该病毒灭活效果已通过国家权威机构---中国药品生物制品检定所和军事科学院艾滋病检测确认实验室的复验证，具有良好的灭活效果，能最大限度的减少输注本产品可能给患者带来的安全风险.详细的灭活病毒能力的验证参见下表：
表一：实施例1、2、3中水浴热处理法灭活DNA非脂包膜病毒的模拟病毒---EMCV的效果，样品1、样品2、样品3对应为实施例1、2、3过程中步骤(8)的相关产品。备注：病毒滴度单位：LgTCID50/0.1ml
  处理时间   样品1   样品2   样品3
  0分钟   5.75   5.50   5.63
  5分钟   ≤0.50   ≤0.50   ≤0.50
  15分钟   ≤0.50   ≤0.50   ≤0.50
  30分钟   ≤0.50   ≤0.50   ≤0.50
  30分钟灭活病毒EMCV的效果(LgTCID50/0.1ml)   ≥5.25   ≥5.00   ≥5.13
3种样品的平均灭活效果较国家标准提高了28.16％。
表二：实施例1、2、3水浴热处理法灭活RNA非脂包膜病毒的模拟病毒---PPV的效果，样品1、样品2、样品3对应为实施例1、2、3过程中步骤(8)的相关产品。
  处理时间   样品1   样品2   样品3
  0分钟   5.38   5.25   5.13
  5分钟   ≤0.63   0.75   ≤0.50
  15分钟   ≤0.50   ≤0.50   ≤0.50
  30分钟   ≤0.50   ≤0.50   ≤0.50
  30分钟灭活PPV病毒的效果(LgTCID50/0.1ml)   ≥4.88   ≥4.75   ≥4.63
备注：病毒滴度单位：LgTCID50/0.1ml
3种样品的平均灭活效果较国家标准提高了18.83％
表三：实施例1、2、3中S/D处理法灭活脂包膜病毒HIV的效果，样品1、样品2、样品3对应为实施例1、2、3过程中步骤(8)的相关产品.
  处理时间   样品1   样品2   样品3
  0小时   7.00   7.00   7.00
  4小时   ＜3.0   ＜3.0   ＜3.0
  5小时   ＜3.0   ＜3.0   ＜3.0
  6小时   ＜3.0   ＜3.0   ＜3.0
  6小时灭活HIV病毒的效果(LgTCID50/0.1ml)   ＞4.00   ＞4.00   ＞4.00
备注：上述批号的样品，在24～26℃作用6小时，能使HIV病毒滴度下降3.5个Log以上，且经过细胞培养盲传三代，未出现细胞病变。
表四：实施例1、2、3中S/D处理法灭活脂包膜病毒VSV的效果，样品1、样品2、样品3对应为实施例1、2、3过程中步骤(8)的相关产品。
  处理时间   样品1   样品2   样品3
  0分钟   4.25   4.38   4.00
  15分钟   ≤0.00   ≤-0.13   ≤-0.13
  30分钟   ≤-0.13   ≤-0.38   ≤-0.38
  1小时   ≤-0.50   ≤-0.50   ≤-0.50
  2小时   ≤-0.50   ≤-0.50   ≤-0.50
  4小时   ≤-0.50   ≤-0.50   ≤-0.50
  6小时   ≤-0.50   ≤-0.50   ≤-0.50
  6小时灭活VSV病毒的效果(LgTCID50/0.1ml)   ≥4.50   ≥4.63   ≥4.13
备注：上述批号的样品，在24～26℃作用6小时，能使VSV病毒滴度下降4.0个Log以上，且经过细胞培养盲传三代，未出现细胞病变.
3种样品的平均灭活效果较国家标准提高了10.5％
表五：实施例1、2、3中S/D处理法灭活脂包膜病毒sindbis的效果，样品1、样品2、样品3对应为实施例1、2、3过程中步骤(8)的相关产品。
  处理时间   样品1   样品2   样品3
  0分钟   4.64   4.61   4.76
  30分钟   1.48   1.46   1.48
  1小时   ≤0.00   ≤0.00   ≤0.00
  2小时   ≤0.00   ≤0.00   ≤0.00
  4小时   ≤0.00   ≤0.00   ≤0.00
  6小时   ≤0.00   ≤0.00   ≤0.00
  6小时灭活sindbis病毒的效果(LgTCID50/0.1ml)   ≥4.64   ≥4.61   ≥4.76
备注：上述批号的样品，在24～26℃作用6小时，能使sindbis病毒滴度下降4.0个Log以上，且经过细胞培养盲传三代，未出现细胞病变。
3种样品的平均灭活效果较国家标准提高了16.75％
以上所述的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案作出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

Claims (9)

1.一种人纤维蛋白原的生产方法，其特征在于，步骤为：
(1)将病毒检测合格，并且符合国家检疫期规定的原料血浆20000～5000rmp的速度进行连续离心分离；
(2)沉淀溶解、离心：在每公斤步骤(1)所得的沉淀中加入3～8L注射用水，搅拌60～300分钟以上使沉淀完全溶解，调节溶解液的温度到20～40℃，将其pH值调节到6.4～7.4，然后以20000～5000rmp的速度进行连续离心分离，离心所得上清液用洁净过滤器进行洁净过滤；
(3)病毒灭活：在步骤(2)所得的上清液中添加氯化钙溶液，使所得混合溶液中氯化钙浓度为1mmol/L，并将其温度调节为20～30℃，然后再添加吐温-80和TNBP，使溶液中吐温-80的最终浓度为1％，TNBP最终浓度为0.3％，将所得液体在专用的病毒灭活罐内，以40～100rmp低速搅拌，在24～26℃条件下保温6～8小时；
(4)层析精制：用DEAE-650M凝胶层析柱吸附步骤(3)所得的溶液，对通过层析柱的滤液进行收集，吸附结束后，用3倍凝胶体积的枸橼酸盐缓冲液洗涤，将层析柱中的残余的人纤维蛋白原洗涤出来一并收集；
(5)沉淀离心分离：在步骤(4)所收集的液体中添加甘氨酸，使所得混合溶液中甘氨酸的浓度为2mol/L，待甘氨酸充分溶解完全后，将溶液冷却至0～10℃，用离心机对其以20000～5000rmp的速度进行连续离心分离；
(6)配制：用枸橼酸钠和蔗糖缓冲液溶解步骤(5)所得的沉淀，使溶解后溶液中枸橼酸钠浓度达到39～54mmol/L和蔗糖浓度为40～60g/L的范围，搅拌2～6小时使沉淀完全溶解，然后调节蛋白浓度到2.0～3.0％，并用0.5M盐酸溶液或0.5M氢氧化钠溶液将产品的pH值调节到6.4～7.4；
(7)除菌过滤：用灭菌好的过滤器对步骤(6)所得的液体进行除菌过滤；
(8)分装、冻干：对步骤(7)所得的液体进行分装，然后进行冻干，冻干时间为4～8天，冻干前先对冻干机急速冻结至-40℃以下，注意冻干过程前后和整个过程中，制品的温度不能超过35℃，冻干后制品在真空状态下完全密闭胶塞，在冻干机内部注入无菌空气，使压力达到平衡；
(9)热处理：将步骤(8)所得的产品，进行100℃±2℃，30分钟的水浴热处理。
2.如权利要求1所述的人纤维蛋白原的生产方法，其特征在于，步骤(1)中在0～4℃的条件下进行离心。
3.如权利要求2所述的人纤维蛋白原的生产方法，其特征在于，步骤(1)中所采用的原料血浆为冰冻血浆。
4.如权利要求3所述的人纤维蛋白原的生产方法，其特征在于，对冰冻血浆处理的方法为，在室温下让其自然融化，用75％的酒精进行消毒血浆袋表面，再用20～25℃左右的注射用水冲洗血浆袋表面的酒精，破袋，将血浆收集在专用的带有夹层的血浆收集罐，用25～35℃的循环水进行循环加热。
5.如权利要求4所述的人纤维蛋白原的生产方法，其特征在于，步骤(1)离心所得的沉淀保管在-30℃以下冷库内，将其取出后在室温下破碎成小块，然后再进行步骤(2)。
6.如权利要求5所述的人纤维蛋白原的生产方法，其特征在于，步骤(2)中用0.1M醋酸溶液将溶解液的PH值调节为7.0。
7.如权利要求6所述的人纤维蛋白原的生产方法，其特征在于，步骤(2)中所述的过滤器孔径为1.0μm。
8.如权利要求7所述的人纤维蛋白原的生产方法，其特征在于，步骤(3)中所得液体在专用的病毒灭活罐内，以70rmp低速搅拌，在25℃条件下保温6小时。
9.如权利要求1-8任一项所述的人纤维蛋白原的生产方法，其特征在于，在步骤(7)所述的除菌过滤中，过滤器孔径为0.22～0.45μm；步骤(8)中冻干的时间为6天。
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Cited By (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102212129A (zh) * 2011-05-05 2011-10-12 邦和药业股份有限公司 柱层析法从组分i中提取人纤维蛋白原的方法
CN102286095A (zh) * 2011-07-06 2011-12-21 大田华灿生物科技有限公司 纤维蛋白原的制备方法
CN102295696A (zh) * 2011-08-16 2011-12-28 山东泰邦生物制品有限公司 由冷沉淀制备凝血因子ⅷ、纤维蛋白原和纤维结合蛋白的方法
CN103328503A (zh) * 2010-09-20 2013-09-25 欧克塔医药公司 纤维蛋白原生产方法
CN103351432A (zh) * 2013-07-09 2013-10-16 武汉中原瑞德生物制品有限责任公司 从血浆组分沉淀中提取人凝血因子ⅷ和人纤维蛋白原的工艺
CN103405754A (zh) * 2013-08-28 2013-11-27 武汉中原瑞德生物制品有限责任公司 用于生产人纤维蛋白原的增溶工艺
CN104231072A (zh) * 2014-10-09 2014-12-24 江西博雅生物制药股份有限公司 一种从冷沉淀提取凝血因子ⅷ的废料中提取人纤维蛋白原的制备工艺
US10112972B2 (en) 2012-03-13 2018-10-30 Octapharma Ag Process for production of fibrinogen and fibrinogen produced thereby
CN109621012A (zh) * 2019-01-30 2019-04-16 四川伍衍生物科技有限公司 一种复合蛋白凝胶及其制备方法
CN111560064A (zh) * 2020-06-05 2020-08-21 博雅生物制药集团股份有限公司 一种高浓度人纤维蛋白原的制备工艺
CN111848783A (zh) * 2020-07-29 2020-10-30 同路生物制药有限公司 一种人纤维蛋白原的制备方法
CN113214384A (zh) * 2021-04-26 2021-08-06 泰州博莱得利生物科技有限公司 犬纤维蛋白原的制备方法及其产品
CN113698470A (zh) * 2021-09-02 2021-11-26 成都蓉生药业有限责任公司 一种人纤维蛋白原的纯化方法

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105504046A (zh) * 2015-12-23 2016-04-20 同路生物制药有限公司 一种人纤维蛋白原的制备方法

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1438243A (zh) * 2003-03-13 2003-08-27 上海生物制品研究所 一种制备纤维结合蛋白的方法
CN100345591C (zh) * 2003-08-01 2007-10-31 上海新兴医药股份有限公司 耐干热处理的速溶冻干纤维蛋白原制剂
CN101143211A (zh) * 2007-10-30 2008-03-19 哈尔滨世亨生物工程药业股份有限公司 耐热人纤维蛋白原的生产方法
CN101229367B (zh) * 2008-01-21 2010-07-28 江西博雅生物制药股份有限公司 人纤维蛋白原制剂的制备方法
CN101371921B (zh) * 2008-10-08 2013-02-13 余美伦 一种速溶冻干纤维蛋白原和凝血酶制剂组合物、制备方法及其用途

Cited By (23)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106046147A (zh) * 2010-09-20 2016-10-26 欧克塔医药公司 纤维蛋白原生产方法
CN103328503A (zh) * 2010-09-20 2013-09-25 欧克塔医药公司 纤维蛋白原生产方法
US9938318B2 (en) 2010-09-20 2018-04-10 Octapharma Ag Process for production of fibrinogen
US9371355B2 (en) 2010-09-20 2016-06-21 Octapharma Ag Process for production of fibrinogen
CN103328503B (zh) * 2010-09-20 2016-08-24 欧克塔医药公司 纤维蛋白原生产方法
CN102212129A (zh) * 2011-05-05 2011-10-12 邦和药业股份有限公司 柱层析法从组分i中提取人纤维蛋白原的方法
CN102212129B (zh) * 2011-05-05 2013-12-18 邦和药业股份有限公司 柱层析法从组分i中提取人纤维蛋白原的方法
CN102286095A (zh) * 2011-07-06 2011-12-21 大田华灿生物科技有限公司 纤维蛋白原的制备方法
CN102295696A (zh) * 2011-08-16 2011-12-28 山东泰邦生物制品有限公司 由冷沉淀制备凝血因子ⅷ、纤维蛋白原和纤维结合蛋白的方法
CN102295696B (zh) * 2011-08-16 2013-06-26 山东泰邦生物制品有限公司 由冷沉淀制备凝血因子ⅷ、纤维蛋白原和纤维结合蛋白的方法
US11401300B2 (en) 2012-03-12 2022-08-02 Octapharma Ag Process for production of fibrinogen and fibrinogen produced thereby
US10112972B2 (en) 2012-03-13 2018-10-30 Octapharma Ag Process for production of fibrinogen and fibrinogen produced thereby
CN103351432A (zh) * 2013-07-09 2013-10-16 武汉中原瑞德生物制品有限责任公司 从血浆组分沉淀中提取人凝血因子ⅷ和人纤维蛋白原的工艺
CN103405754B (zh) * 2013-08-28 2015-03-11 武汉中原瑞德生物制品有限责任公司 用于生产人纤维蛋白原的增溶工艺
CN103405754A (zh) * 2013-08-28 2013-11-27 武汉中原瑞德生物制品有限责任公司 用于生产人纤维蛋白原的增溶工艺
CN104231072A (zh) * 2014-10-09 2014-12-24 江西博雅生物制药股份有限公司 一种从冷沉淀提取凝血因子ⅷ的废料中提取人纤维蛋白原的制备工艺
CN109621012A (zh) * 2019-01-30 2019-04-16 四川伍衍生物科技有限公司 一种复合蛋白凝胶及其制备方法
CN111560064A (zh) * 2020-06-05 2020-08-21 博雅生物制药集团股份有限公司 一种高浓度人纤维蛋白原的制备工艺
CN111848783A (zh) * 2020-07-29 2020-10-30 同路生物制药有限公司 一种人纤维蛋白原的制备方法
CN111848783B (zh) * 2020-07-29 2023-07-04 同路生物制药有限公司 一种人纤维蛋白原的制备方法
CN113214384A (zh) * 2021-04-26 2021-08-06 泰州博莱得利生物科技有限公司 犬纤维蛋白原的制备方法及其产品
CN113214384B (zh) * 2021-04-26 2023-10-10 泰州博莱得利生物科技有限公司 犬纤维蛋白原的制备方法及其产品
CN113698470A (zh) * 2021-09-02 2021-11-26 成都蓉生药业有限责任公司 一种人纤维蛋白原的纯化方法

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