CN103405754A

CN103405754A - 用于生产人纤维蛋白原的增溶工艺

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Publication number: CN103405754A
Application number: CN2013103824263A
Authority: CN
Inventors: 徐建生; 王玉兵; 田健生; 梁华; 肖雷
Original assignee: WUHAN ZHONG YUAN RUI DE BIOLOGICAL PRODUCTS Co Ltd
Current assignee: WUHAN ZHONG YUAN RUI DE BIOLOGICAL PRODUCTS Co Ltd
Priority date: 2013-08-28
Filing date: 2013-08-28
Publication date: 2013-11-27
Anticipated expiration: 2033-08-28
Also published as: CN103405754B

Abstract

本发明涉及用于生产人纤维蛋白原的增溶工艺，主要步骤如下：（1）原料血浆处理；（2）冷沉淀溶解、离心；（3）病毒灭活；（4）层析精制；（5）离心分离；（6）沉淀溶解；（7）除菌过滤；（8）分装、冻干：本发明的优点：提取出的产品纯度高达95%以上，杂蛋白含量低，能有效的灭活脂包膜病毒和非脂包膜病毒，确保了制品安全；采用盐酸精氨酸和甘氨酸作为稳定剂，能使产品在冻干中得到充分的保护。通过延长冻干时间（约需4-8天，一般厂家均为3天左右），使产品在冻干过程中温度变化稳定，可得到结构均一的冻干产品；增加了人纤维蛋白原的溶解性；产品复溶后，溶解迅速，无明显可见变性蛋白。

Description

用于生产人纤维蛋白原的增溶工艺

技术领域

本发明涉及血液制品领域，特别涉及一种用于生产人纤维蛋白原的增溶工艺。

背景技术

人纤维蛋白原主要由肝脏合成，人体含量约为2.5～4.0g/L左右，大部分存在于人体血浆中，仅有不到20%存在于血管外。主要用于先天性、获得性纤维蛋白原减少症、严重肝脏损伤、肝硬化、DIC以及手术或者产后大出血等的治疗，是临床上用于大出血止血的必备急救药品之一。目前生产人纤维蛋白原主要有两种方法：一种是以血浆离心上清液经低温乙醇分离，生产出的组分I为原料，制得成品，但该工艺主要存在纯度不高的问题，生产出来的制品纯度都在80%以下，产品杂质含量偏多，患者在注射使用时，容易发生不良反应；一种是以冷沉淀为原料，通过抽提、吸附、离心、层析等制造工艺得到，采用冷沉淀为原料，通过抽提、吸附、离心、层析等制造工艺得到的人纤维蛋白原沉淀溶解性低（该法得到的成品溶解度低），溶解困难。通过添加聚山梨酯80可以达到增强纤维蛋白原在溶解液中的溶解性，提高制品的质量、纯度和最终收率的目的。通过添加聚山梨酯80可以增强纤维蛋白原在溶解液中的溶解性，达到提高制品的质量、纯度和最终收率的目的。

聚山梨酯80，化学名为聚氧乙烯20山梨醇酐单油酸酯，为淡黄色至橙黄色的粘稠液体。易溶于水、甲醇、乙醇和醋酸乙酯，在矿物油中极微溶解，属于亲水型非离子表面活性剂，为药物制剂中常用的辅料之一。由于其结构中具有较长的碳链结构，对亲脂性药物有较好的助溶作用，在制备难溶性药物制剂时，常用作助溶剂、乳化剂和稳定剂等。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种纯度高，溶解性好，稳定性高，灭活病毒效果好的生产人纤维蛋白原的増溶工艺。

为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：用于生产人纤维蛋白原的增溶工艺，主要步骤如下：

（1）原料血浆处理：将原料血浆在5000～20000rpm的速度下进行连续离心分离，得到冷沉淀；

（2）冷沉淀溶解、离心：在每公斤步骤1)所得的冷沉淀中加入3～8L注射用水，所得溶解液加热至20～40℃，搅拌使沉淀完全溶解，将其pH值调节到6.6～7.4，加入氢氧化铝凝胶，然后以5000～20000rmp的速度进行连续离心分离，离心所得上清液用洁净过滤器进行洁净过滤；

（3）病毒灭活：添加吐温80和磷酸三丁酯（TNBP），将所得液体在专用的病毒灭活罐内，以40～l00rmp低速搅拌，在24～26℃条件下保温6～8小时；

（4）层析精制：在步骤（3)所得的溶液中加入枸橼酸钠、氯化钠、甘氨酸缓冲液，通过凝胶层析柱进行吸附，经层析柱流出来的液体另行收集，用于人纤维蛋白原的制造；

（5）离心分离：在步骤（4）所收集的液体中添加甘氨酸，待甘氨酸充分溶解完全后，将溶液冷却至0～10℃，用离心机对其以5000～20000rmp的速度进行连续离心分离，得到人纤维蛋白原沉淀；

（6）沉淀溶解：对步骤（5）所得沉淀加入聚山梨酯80进行溶解，得到溶解液；

（7）除菌过滤：使用灭菌好的过滤器对步骤（6)所得的液体进行除菌过滤；

（8）分装、冻干：对步骤（7)所得的液体进行分装，然后进行冻干，冻干时间为4～8天，冻干前先使冻干机急速冻结至-40℃以下，注意冻干过程前后和整个过程中，制品的温度不能超过35℃，冻干后制品在真空状态下完全密闭胶塞，在冻干机内部注入无菌空气，使压力达到平衡。

按上述方案，步骤（2）中按每公斤冷沉淀加入100～110g氢氧化铝凝胶。

按上述方案，步骤（4）枸橼酸钠、氯化钠、甘氨酸缓冲液配制比例为7:5:18。

按上述方案，步骤（5)中在0～4℃的条件下进行离心。

按上述方案，步骤（6）所述的沉淀溶解的具体步骤是：在每公斤步骤（5）所得沉淀物中加入5～10L注射用水，按每升溶解水加入12～15g枸橼酸钠、20～30g盐酸精氨酸、3～10g氯化钠、10-15g甘氨酸，调节pH6.8～7.4，升温30～40℃。

按上述方案，在步骤（6）所得溶解液中加入聚山梨酯80，其用量为30～50μg/ml溶解液。

按上述方案，在步骤（3）使溶液中吐温80的最终浓度为1%，磷酸三丁酯最终浓度为0.3%。

按上述方案，在步骤（5）使所得混合溶液中甘氨酸的浓度为3mol/L。

本发明中制备的主要反应机理是：吐温80化学结构中具有较长的碳链结构，对亲脂性药物具有较好的助溶作用，并能提高药物的稳定性。利用上述特点，在人纤维蛋白原半成品的制备过程中，加入30～50μg/ml的聚山梨酯80，从而增强人纤维蛋白原溶解性和稳定性。

本发明的优点：

1、本发明的人纤维蛋白原的生产方法，采用了从冷沉淀中提取人纤维蛋白原，加强了血浆的综合利用，提取出的产品纯度高达95%以上，杂蛋白含量低，生产中采用的S/D法和水浴热处理法双重病毒灭活，能有效的灭活脂包膜病毒和非脂包膜病毒，确保了制品安全。

2、部分厂家采取蔗糖作为稳定剂，干热后成品略有发黄。本发明生产人纤维蛋白原过程中，采用盐酸精氨酸和甘氨酸作为稳定剂，能使产品在冻干中得到充分的保护。通过延长冻干时间（约需4-8天，一般厂家均为3天左右），使产品在冻干过程中温度变化稳定，可得到结构均一的冻干产品。此法得到的产品在进行水浴热处理时，能在最短时间内受热均匀，从而可在有效的灭活非脂包膜病毒的同时保证人纤维蛋白原的稳定性。

3、本发明生产人纤维蛋白原过程中，加入聚山梨酯（吐温）80，增加了人纤维蛋白原的溶解性。聚山梨酯80作为表面活性剂对人纤维蛋白原也起到了一定的保护作用。产品复溶后，溶解迅速，无明显可见变性蛋白。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明做进一步详细的说明，但是此说明不会构成对本发明的限制。

一、实施例

实施例1

1、血浆挑选：

依据生产计划在-20℃冷库内将冰冻血浆称量后出库。对出库的冰冻血浆进行筛选，除去破损血浆。合格血浆洗净后放于干净的不锈钢桶中，将周转箱垒至4-5层，放入2-15℃冷库过夜。

2、血浆收集：首先用37℃以下注射用水洗涤，使血浆达到脱壳状态；再经75－80%乙醇消毒，每4～5箱血浆消毒好后，更换新的酒精。然后将此血浆袋捞到洗涤台上，再用37℃以下注射用水充分淋洗血浆袋表面。破袋，将血浆收集在专用的带有夹层的血浆收集罐中，用35℃的循环水进行循环加热，融化好的血浆及时转移到离心专用罐，并控制血浆的温度在4℃，注入离心机以10000rmp的速度进行连续离心分离，离心的上清液用于人血白蛋白、人免疫球蛋白等的制造，离心的固体成分——冷沉淀5.0kg，置于冰柜-30℃保存，用于人纤维蛋白原的生产。

3、冷沉淀溶解、离心：将保管于-30℃以下冷库内的冷沉淀5.0kg拿出，尽可能破碎成小块，加入15L注射用水，所得溶解液加热温度到40℃，搅拌90分钟使冷沉淀完全溶解，使用0.1M醋酸溶液将其pH值调至7.2。然后以10000rmp的速度进行连续离心分离，离心所得上清液用洁净过滤器进行洁净过滤，得滤液16L。

4、病毒灭活：将收集罐中产品的温度调节为20-30℃，然后添加聚山梨酯80161.6g和TNBP48.5ml，使溶液中二者的最终浓度分别达到1%和0.3%。在病毒灭活罐内，以40rmp低速搅拌，在25℃条件下加热保温6小时。

5、层析精制：在步骤（4）所得的溶液中加入枸橼酸钠、氯化钠、甘氨酸缓冲液2L，通过DEAE-650M凝胶层析柱进行吸附，经层析柱流出来的液体另行收集，用于人纤维蛋白原的制造。

6、离心分离：在步骤（5)所收集的液体中添加甘氨酸6kg，使所得混合溶液中甘氨酸的浓度为3mol/L，待甘氨酸充分溶解完全后，将溶液冷却至0-10℃，用离心机对其以5000--20000rmp的速度进行连续离心分离,得到人纤维蛋白原沉淀0.5kg；

7、沉淀溶解:在所得0.5kg沉淀中加入5L注射用水，60g枸橼酸钠、100g盐酸精氨酸、15g氯化钠、50g甘氨酸，低速搅拌溶解，调节pH至6.8—7.4，升温30—40℃；

8、加入聚山梨酯80：加入量为30μg/ml；

9、除菌过滤：使用灭菌好的过滤器对步骤8)所得的液体进行除菌过滤；

10、分装、冻干：对步骤9)所得的液体进行分装，然后进行冻干，冻干时间为4～8天，冻干前先使冻干机降温至-40℃以下，注意冻干过程前后和整个过程中，制品的温度不能超过35℃，冻干后制品在真空状态下完全密闭胶塞，在冻干机内部注入无菌空气，使压力达到平衡。

实施例2

1、血浆挑选：

依据生产计划从-20℃冷库内将冰冻血浆称量后出库。对出库的冰冻血浆进行筛选，将破损血浆挑选出来，破损的血浆要及时挑出，洗净后放于干净的不锈钢桶中。破损血浆不能生产冷沉淀；将周转箱垒至4-5层，血浆放入2-8度冷库过夜。

2、血浆收集：首先用37℃以下注射用水洗涤，使血浆达到脱壳状态；再经75－80%乙醇消毒。每4～5箱血浆消毒好后，更换新的酒精,然后将此血浆袋捞到洗涤台上。再用37℃以下注射用水充分淋洗血浆袋表面。破袋，将血浆收集在专用的带有夹层的血浆收集罐，用30℃的循环水进行循环加热，融化好的血浆及时转移到离心专用罐，并控制血浆的温度在4℃，注入离心机以10000rmp的速度进行连续离心分离，离心的上清液用于人血白蛋白、人免疫球蛋白等的制造，离心的固体成分——冷沉淀5.0kg，置于冰柜-30℃保存，用于人纤维蛋白原的生产。

3、冷沉淀溶解、离心：将保管于-30℃以下冷库内的冷沉淀5.0kg拿出，尽可能破碎成小块，加入40L注射用水，所得溶解液加热温度到30℃，搅拌300分钟使冷沉淀完全溶解，使用0.1M醋酸溶液将其pH值调节到6.8，然后以20000rmp的速度进行连续离心分离，离心所得上清液用洁净过滤器进行洁净过滤，得滤液41L。

4、病毒灭活：将收集罐中产品的温度调节为20-30℃，然后添加吐温-80414.1g和TNBP124.2ml，使溶液中二者的最终浓度分别达到1%和0.3%。在病毒灭活罐内，以40rmp低速搅拌，在25℃条件下加热保温6小时。

5、层析精制：在步骤（4)所得的溶液中加入枸橼酸钠、氯化钠、甘氨酸缓冲液2L，通过DEAE-650M凝胶层析柱进行吸附，经层析柱流出来的液体另行收集，用于人纤维蛋白原的制造。

6、离心分离：在步骤（5)所收集的液体中添加甘氨酸2kg，使所得混合溶液中甘氨酸的浓度为3mol/L，待甘氨酸充分溶解完全后，将溶液冷却至0-10℃，用离心机对其以5000--20000rmp的速度进行连续离心分离,得到人纤维蛋白原沉淀0.5kg；

7、沉淀溶解:在所得0.5kg沉淀中加入5L注射用水，60g枸橼酸钠、100g盐酸精氨酸、15g氯化钠、50g甘氨酸，低速搅拌溶解，调节pH6.8—7.4，升温30—40℃；

8、加入吐温80：吐温80加入量按35μg/ml；

9、除菌过滤：使用灭菌好的过滤器对步骤（8)所得的液体进行除菌过滤；

10、分装、冻干：对步骤（9)所得的液体进行分装，然后进行冻干，冻干时间为4～8天，冻干前先对冻干机降温至-5℃以下，注意冻干过程前后和整个过程中，制品的温度不能超过30℃，冻干后制品在真空状态下完全密闭胶塞，在冻干机内部注入无菌空气，使压力达到平衡。实施例3

1、血浆挑选：

2、血浆收集：首先用37℃以下注射用水洗涤，使血浆达到脱壳状态；再经75－80%乙醇消毒。每4～5箱血浆消毒好后，更换新的酒精,然后将此血浆袋捞到洗涤台上。再用37℃以下注射用水充分淋洗血浆袋表面。破袋，将血浆收集在专用的带有夹层的血浆收集罐，用25℃的循环水进行循环加热，融化好的血浆及时转移到离心专用罐，并控制血浆的温度在4℃，注入离心机以10000rmp的速度进行连续离心分离，离心的上清液用于人血白蛋白、人免疫球蛋白等的制造，离心的固体成分——冷沉淀5.0kg用于人纤维蛋白原的生产。

3、冷沉淀溶解、离心：将保管于-30℃以下冷库内的冷沉淀5.0kg拿出，尽可能破碎成小块，加入27.5L注射用水，所得溶解液加热温度到30℃，搅拌300分钟使冷沉淀完全溶解。使用0.1M醋酸溶液将其pH值调节到7.2，然后以12000rmp的速度进行连续离心分离，离心所得上清液用洁净过滤器进行洁净过滤，得滤液28.5L。

4、病毒灭活：将收集罐中产品的温度调节为20-30℃，然后添加吐温-80288g和TNBP86.4ml，使溶液中二者的最终浓度分别达到1%和0.3%。在专用的病毒灭活罐内，以40rmp低速搅拌，在25℃条件下加热6小时。

5、层析精制：在步骤（4)所得的溶液中加入枸橼酸钠、氯化钠、甘氨酸缓冲液2L，通过凝胶层析柱进行吸附，经层析柱流出来的液体另行收集，用于人纤维蛋白原的制造。

7、沉淀溶解:

在所得0.5kg沉淀中加入5L注射用水，60g枸橼酸钠、100g盐酸精氨酸、15g氯化钠、50g甘氨酸，低速搅拌溶解，调节pH6.8—7.4，升温30—40℃；

8、加入吐温80：吐温80加入量按40μg/ml；

10、分装、冻干：对步骤（9)所得的液体进行分装，然后进行冻干，冻干时间为4～8天，冻干前先对冻干机降温至-5℃以下，注意冻干过程前后和整个过程中，制品的温度不能超过30℃，冻干后制品在真空状态下完全密闭胶塞，在冻干机内部注入无菌空气，使压力达到平衡。

二、本发明实施例1-3所得产品经测试完全达到或超过了《中国药典》2010年版（三部）的相关要求和国内已上市的同类产品，相关数据的对比分析见下表：

从上表可以看出，本发明所制得的人纤维蛋白原，其关键质量指标如纯度、凝固活力、复溶时间、外观均超过2010年版《中国药典》和国内已经上市的其它公司的产品。

三、本发明所采用的S/D病毒灭活和干热病毒灭活均进行验证，验证结果如下：

1、S/D法病毒灭活效果验证：

本发明所采用的S/D法对PRV的灭活效果：

注：★病毒滴度单位：LgTCID₅₀/0.1ml

＃与零小时未做处理对照比较

本实验病毒检测限：10LgTCID₅₀/0.1ml

本发明所采用的S/D法对丙型肝炎病毒（HCV）的灭活效果：

注：★病毒滴度单位：LgTCID₅₀/0.1ml

＃与零小时未做处理对照比较

本实验病毒检测限：10LgTCID₅₀/0.1ml

结果显示，本发明所采用的S/D法病毒灭活经25±1℃水浴处理1小时后，指示病毒PRV和HCV的下降滴度已大于4Lg,故认为此法（25±1℃水浴处理6小时）能有效灭活该两种指示病毒。

2、干热病毒灭活效果验证：

结果显示，本发明所采用的干热法（100℃，30分钟）病毒灭活处理20分钟后就能有效的灭活EMCV和PPV病毒，充分证明该法病毒灭活效果的有效性。

上述情况表明，本发明采用DEAE-650M凝胶吸附，可以有效的吸附制品中杂凝血因子，使制品更稳定。

本发明采用甘氨酸沉淀法进行蛋白质的分离，分离条件温和，能够更好的保持蛋白质的活性和纯度。

本发明在中间品中加入聚山梨酯80，有效促进了人纤维蛋白原成品的溶解性，并对产品的稳定性也起到了一定的增强作用。

本发明采用从冷沉淀中提取人纤维蛋白原，生产中采用的S/D法和水浴热处理法双重病毒灭活，能有效的灭活脂包膜病毒和非脂包膜病毒，确保了制品的安全，提取出的产品纯度高达95%以上，杂质蛋白含量低。

Claims

1.用于生产人纤维蛋白原的增溶工艺，主要步骤如下：

（3）病毒灭活：添加吐温80和磷酸三丁酯，将所得液体在专用的病毒灭活罐内，以40～l00rmp低速搅拌，在24～26℃条件下保温6～8小时；

（6）沉淀溶解：对步骤（5）所得沉淀加入吐温80进行溶解，得到溶解液；

2.如权利要求1所述的用于生产人纤维蛋白原的增溶工艺，其特征在于步骤（2）中按每公斤冷沉淀加入100～110g氢氧化铝凝胶。

3.如权利要求1或2所述的用于生产人纤维蛋白原的增溶工艺，其特征在于步骤（4）枸橼酸钠、氯化钠、甘氨酸缓冲液配制比例为7:5:18。

4.如权利要求1或2所述的用于生产人纤维蛋白原的增溶工艺，其特征在于步骤（5)中在0～4℃的条件下进行离心。

5.如权利要求1或2所述的用于生产人纤维蛋白原的增溶工艺，其特征在于步骤（6）所述的沉淀溶解的具体步骤是：在每公斤步骤（5）所得沉淀物中加入5～10L注射用水，按每升溶解水加入12～15g枸橼酸钠、20～30g盐酸精氨酸、3～10g氯化钠、10-15g甘氨酸，调节pH6.8～7.4，升温30～40℃。

6.如权利要求5所述的用于生产人纤维蛋白原的增溶工艺，其特征在于在步骤（6）所得溶解液中加入吐温80，其用量为30～50μg/ml溶解液。

7.如权利要求1或2所述的用于生产人纤维蛋白原的增溶工艺，其特征在于在步骤（3）使溶液中吐温80的最终浓度为1%，磷酸三丁酯最终浓度为0.3%。

8.如权利要求3所述的用于生产人纤维蛋白原的增溶工艺，其特征在于在步骤（5）使所得混合溶液中甘氨酸的浓度为3mol/L。