JPS60132919A - 生物学的製剤の加熱処理方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、有機溶媒中に懸濁された凍結乾燥蛋白質を、
蛋白質の生物学、的活性を実質的に損失することなしに
加熱処理し、蛋白質に夾雑されたウィルスを不活化する
方法に関する。

〔従来技術〕

種々の生物学的製剤は、人及び人以外の生物起源から得
られる生物学的原料から生産される。これら生物学的製
剤は、人に医薬品として投与されうる。そのため、これ
ら製剤は、感染性の物質、例えば活性なウィルス′が除
去されていることが望ましく、現実的には必須である。

これら生物学的製剤の主原料は、人の血漿である。例え
ば、このような製剤として、人の血漿から分離される種
々の血漿分画があシ、それはアルブミン、アンティトロ
ンビン■、フィブリノタン、ファクター■（ＡＨＦ）、
及びファクター■に加えてファクター■、■及びＸを含
有するプロトロンビン複合体か例示される。

ウィルス、例えばＨＢウィルス及び／又は非Ａ１非Ｂ肝
炎ウイルスの不活化は、両分が分離される前に血漿を処
理することによって、あるいば分離された後の画分を処
理することによって達成される。

分離された両分について、感染性物質を不活化すること
は、過去に種々の方法が試みられた。例えば、漂白剤、
アルカリおよび／又は酸を含む水溶液がこの種の方法に
使われた。しかし、とのような水溶液を使うことは、生
理活性をもった蛋白質にとって非常圧有害であシ、その
生理活性、すなわちその有用性を破壊してしまうもので
あった。

その他の方法としそは、Ｕｖ熱照射はβ−プロ支、別の
方法として、蛋白質画分や血漿中に夾雑する感染性物質
を加熱処理して不活化する方法がする。９１えば、アン
ティトロンピ装置、ファクター■、アルブミン、血漿蛋
白゛質両分、そしてファクター■等を含有する水溶液を
、６０℃から１００℃の温度に加温し、夾雑するウィル
スが不漏化されていた。又、血漿自体も、加熱処理りて
いた。

え、一方ア、種ヵ。、白質画林募、蔽燥状−１例えば粉
末状態でウィルスを不活イ６るにめに加熱された。しか
しこれら条件での加熱は、予想以上に生物活性の損失を
招いた。又、乾燥状態では、一定の効果を得るととがで
きなかった。

ｄ−＜して、比ｉ的簡単で、経済的に蛋白質画分を加熱
滅菌し、当該蛋白質の生物活−性を失わせしめ□な゛い
方法の提供が期待されていた。　゛〔発明；・解決しよ
うとする問題点〕 本発明は生物学的製剤、例見は血漿から分離される蛋白
質画分中に夾雑するウィルスを不活化する方法を提供す
る。さらに詳しくは、生物学的製剤はまず乾燥粉末の形
状は調製される。乾燥粉末は有機溶媒と混合され、それ
によって液体中に粉末は懸濁される。懸濁液は一定温度
で一定時間加熱され、生物学的製剤の生物学的活ｉを実
質的に維持したまま、夾雑＋るいづれのウィルスをも不
活化する。次いで、懸濁された生物学的製剤は、有機溶
媒から分離され、さらに分離された生物学的製剤は乾燥
され、回収される。　′　□回収さ；７１ｃｍ燥生物学
的製剤は、さらに生理的に人体投与に適合した剤顧に調
製するための処理を受ける。

〔問題点を解決するための手段及び作用〕本発明におい
て、生物学的製剤、例えば′蛋白質製剤は夾雑するどん
なウィルスをも、不活化するために加熱される□。

蛋白質製剤とは、例えば人の血漿から分離される１′又
はそれ以上の蛋白−画□分である。本発明で加熱処理さ
れる蛋白−画分は、好適にはアルプミン、アンティトロ
ンビン■、フィゾリノゲン、ファクター■（ＡＨＦ）お
よびファクター■１．ｙアクタ−■、ファクター■そし
てファクターＸを含有するプロトロンビン複合体が例示
される。しかしこれらには本発明は限定されるものでは
なく、他の蛋白質製剤も、その夾雑するウィルスを不活
化するために、本発明の方法によって加熱処理が可能で
ある。

蛋白質画分の分離、例えば上記したような血漿からの分
画は当該技術分野ではよく知られている。

例えば、血漿からの蛋白質画分の分離方法は、Ｅ　、Ｊ
　、ＣｏｈｎによってＵ、Ｓ、特許第２３９００７４号
及びＥ、Ｊ、０ｏｈｎ等によってＪ　、Ａｍ　、　Ｃｈ
ｅｍ　、　Ｓｏｃ　、　。

立見（１９４６）Ｐ、４５９−４７５　（蛋白質とリボ
蛋白質組成の分画）に開示されている。

本発明において、滅菌され加熱処理される蛋白質画分は
乾燥、例えば凍結乾燥され蛋白質粉末に調製される。粉
末は、次いで不活性な有機溶媒と混合される。粉末は都
合のよいことに有機溶媒には溶解しない。粉末は溶媒中
に粒子の型状で分散され、それによって有機溶媒／蛋白
質粉末の懸濁液を形成する。本発明において、好適な有
機溶媒はヘキサン等のようなアルカン液、アセトンジエ
チルケトン等のようなケトン、パーフルオロトリプロピ
ルアミン等のようなパーフルオロ化合物が例示される。

他の同様の有機溶媒も、処理される蛋白質粉末を懸濁状
態にしうるものであるかぎり同様に使用することができ
る。

次いで、有機溶媒／蛋白質粉末の懸濁液は一定時間、約
６０℃から約１００’Ｃの温度で加熱され、それによっ
て蛋白質に夾雑するウィルスを不活化又は致死せしめる
。一定時間とは、例えば、約５分間から約３０時間であ
シ、その処理温度に依存して決められる。比較的低い温
度で処理されるときＫは、よ勺長い時間を要し、比較的
高い温度で処理されるときにはよシ短い時間でよい。例
えば、懸濁液が約６０℃に加熱されたときには、加熱時
間は、好ましくは少なくと本約１０時間、よシ好ましく
は少なくとも約加時間である。選択的に、懸濁液が約９
８℃と１００　℃の間で処理されたときには、加熱時間
は、好ましくは約３０分間以上であシ、実質的に約１０
時間よシ短い時間で十分である。

加熱処理が終った後、加熱処理された有機溶媒／蛋白質
粉末の懸濁液は口過され／又は粉末回収処理がなされる
。そして有機溶媒はすてられる。

粉末は、次いで一定時間空気乾燥され、さらに有機溶媒
を十分に除去し滅菌生物学的製剤を提供するための慣用
手段を施した後、生理的に人体に投与可能な製剤を調製
する。

ファクター■（ＡＨＦ）は、以下の実施例１−２に示さ
れる本発明の方法によって加熱処理のために人血漿から
分離される。プロトロンビン複合体（ＰＴＣ）は、　実
施例３に示される方法によって加熱処理のために人血漿
から分離される。ＡＨＦ　とＰＴ（３は、　他の蛋白質
と同様に、当業者にはよく知られた多様な方法のいづれ
かを本発明に利用することによって加熱処理のために供
給されうる。

実施例　１ ＰＩＩＣＧ分画による人血漿からのＡＨＦＯ分画ＡＨＦ
は米国ＦＤＡによって認められた方法で回収・試験され
た人血漿から分離された。血漿は、まず約−２０℃の温
度で凍らせた。冷凍血漿は、次いで０℃から５℃で溶解
し、プールした。溶解工程中に生じる低温沈澱物が、遠
心分離によって分離され、そして表面に残存付着した過
剰の血漿を洗い流すために冷蒸留水〔〔トリスハイドロ
キシメチルアミノメタン）−ＨＣｌ緩衝液でもよい。〕
ですすいだ。すすがれた低温沈澱物は、次いで約３０か
ら６０分間０．０２　Ｍのトリス塩酸緩衝液（中性ｐＨ
）Ｋ懸濁され低温沈殿物抽出液を得た。トリス−ＡＨＦ
懸濁液は、　次いで少なくとも１ｏ分間水酸化アルミニ
ウム（Ａｌ（ＯＨ）３）ゲルに吸着させた。その後、Ａ
／（ＯＨ）３ゲルは遠心分離によって除去された。遠心
上清は、次いで膜（又はカー）　１Ｊツジフイルター）
を通して浄清した。ＡＨＦＦ液は希釈クエン酸ナトリウ
ム溶液で安定化され、ついでＰＥＧが終濃度約４．５チ
まで添加され、つづいて約３０分間温和に混合された。

生じた沈澱物は遠心分離によって除去された。、ＡＨＦ
’−ＰＥＧ遠心上清に、ＰＥＧがさらに終濃度約１５チ
まで添加され、ＡＨＦ沈澱物を得た。ＡＨＦ沈澱物の懸
濁液が温和に約３０分間混合され、沈澱物は次いで遠心
分離によって回収された。生じたＡＨＦ沈澱物は、ＰＥ
Ｇを約１チ以下に含有する約２．５Ｍのグリシン−クエ
ン酸溶液中に懸濁された。懸濁液は、均一分散混合物が
得られるまで混合された。その後、遠心分゛　離によっ
て最終的にＡＨＦ沈澱物を得た。

次いで、ＡＨＦ沈澱物は、希釈トリス−クエン酸生理食
塩水に溶解され、ＰＨは約中性に調整された。最終ＡＨ
Ｆ溶液は、次いで除菌濾過膜（又はカートリツ：））で
ｒ過処理され、除菌バルク溶液を得た。除菌バルク溶液
は、次いで凍結乾燥され、本発明の方法によって加熱処
理が施された。

実施例　２　′ 人血漿からのＡＨＦの分離 低温沈澱物が、実施例１の方法と同様に回収された。す
すがれた低温沈澱物は約室温で、約０．０２Ｍのト□リ
スーＨＣｌ１緩衝液に懸濁された。ＰＨｉ約６．４に一
整され、懸濁液の温度は、低温化された。

次いで、懸濁液状遠心分離され、固型の夾雑物と沈澱物
は除去された。遠心上清は、次いで希釈凶α０Ｈでほぼ
中性ｐＨに調整され、温度は約室温に上昇された。遠心
上清は、１、ＡＪ、（ＯＨ）３ゲルで吸着処理され、そ
の後遠心分離によってＡｌ（ＯＨ）３は除去された。遠
心上清は、膜（又はカートリツ：）フィルター）によっ
て浄清された。次いで、浄清液に、終濃度が０．０２　
Ｍになるようにクエン酸凶α溶液が添加され、ｐＨがほ
ぼ中性に調整された。

ＡＨＦ溶液は、除菌濾過膜（又はカートリッジフィルタ
ー）Ｋよってｒ過され、除菌ノミルク溶液が調製された
。除菌ノ６ルクは凍結乾燥され、ＡＨＦ粉末は本発明の
方法によって加熱処理を施された実施例　３゜ 人血漿からのプロトロンビン複合体の分離プロトロンビ
ン複合体蛋白質（ＰＴＣ）が、　米国ＦＤＡによって認
められた方法罠よって回収・試験された。血漿は当初的
−２０℃の温度で凍らせた。

次いで、血漿は０℃から５℃の温度で融解させ、低温沈
澱物をえた。生じた血漿−低温沈澱物の混合物がプール
され、低温沈澱物を分離するために遠心分離をした。プ
ールされたＡＨＦの乏しい血漿は、次いで重量を測定し
、０℃から５℃に調整して、血漿のＮａ＋濃度を、その
本来の濃度から８５　と１９５ｍＭの間に漸減的に調整
して電気泳動分離をおこなった。分離されたＡＨＦの乏
しい血漿は、ついで酢酸を添加してはぼ中性ｐＨに調整
した。

ｐＨ調整をおこなったＡＨＦの乏しい血漿中に含まれる
ＰＴＧの各因子は、再調製されたＤＥＡＲ−セルロース
の添加によって吸着させた。ＤＥＡＲ−セルロースと血
漿は約３０分間混合され、その後ＤＥＡＲ−セル四−ス
は遠心分離によって集められた。Ｄａｔａ−セルロース
ｌｊ　着ｆ　ｏ　トＥｌンビン複合体杜、約０．０３　
Ｍリン酸ドと約０．０３　Ｍクエン酸８αからなるｐＨ
約６．８の緩衝液で洗浄された。洗浄液は除去された。

洗浄されたＤＥＡＥ−セルロース吸着プロトロンビン複
合体は、次いで遠心機から除去され、洗浄緩衝液に懸濁
された。生じた懸濁液は、次いでカラムに充填され、カ
ラムからの溶出液状廃棄した。ＤＥＡＥ−セルロースを
含むカラムは、次いで洗浄緩衝液で洗われた。この洗浄
液もすてられた。ＰＴＣ成分は、ｐＨ約６．８の０．０
３　Ｍリン酸Ｎａ、０．０３　Ｍクエン酸Ｎａ、及び０
．２　Ｍ　Ｎａ１ｌを含む溶出用緩衝液でカラムを洗浄
し溶出させた。

溶出液紘集められ、ＰＴＣ画分画分−プールバルク溶液
として集められた。集められたＰＴＯ画分の適当な試験
がなされ、ノ夜ルク溶液のｐＨが約中性に調整された後
、溶液は除菌口過カートリッジ（又は膜）を通過させて
口過し、それによって口過ずみＰＴＯノルク溶液を調製
し丸。口過ずみＰＴＣのバルク溶液は、次いで凍結乾燥
され九ＰＴＣ粉末線、本発明の方法によって加熱処゛理
をするｆｃｌｔ）集められた。

実施例１又は２において、提供された本発明の処理がな
されるＡＨＦは、ヘキサン、ヘプタン、アセトン又はノ
ｅ−フルオロトリプロピルアミン等のような有機溶媒中
に分散、例えば懸濁される。

次いでＡＨＦ懸濁液線、約６０℃から１００℃で５分間
と約３０時間の間で加熱処理される。　加熱処理が完了
後、懸濁液は、口過され、そしてＡＨＦ粉末拡回収され
る。除菌ＡＩ（Ｆ粉末線、次いで空気乾燥によって残存
有機溶媒が除去される。

空気乾燥された加熱処理ＡＨＦ粉末は、次いでグルコー
ス溶液中に溶解される。（使用されるグルコース溶液の
量は、好ましくは加熱処理されるＡＨＦ粉末のゆ当シ約
２０±１０１溶液である。

グルフース／ＡＨＦ溶液のＰＨは、希釈８α０Ｈ溶液又
は希釈ＨＧｌ溶液で、７．０±０．１に調整される。

次いで最終ＡＨＦ溶液は、遠心分離され、先に除菌口過
された膜（又はカートリツ：））で口過され不溶性（変
性した）蛋白質が除去された。

次いで、ＡＨＦ溶液はテストのた絵にサンプリングされ
分注され除菌口過された。凍結乾燥されたＡＨＦ粉末は
、要時滅菌水に溶解され、適当な生理学的水溶液、又は
患者への投与に適した剤型に調製される。

各種実験は、本発明の加熱処理をおこなう蛋白質画分の
種々の特性の決定に応じておこなわれる。

実施例　４ アセトン中でのＡＨＦ粉末の加熱処ｌｌ実施例２の方法
によって人血漿から得られたロットＡｌ−１１５０から
の凍結ＡＨＦ粉末の０，５グラムがアセトンの２０−中
に溶解され、１０分間かきまぜｍＫよって混合され、ア
セトン中のＡＨＦの懸濁液を得た。懸濁液はバイアル中
にシールされ、６０℃−１０時間の処理がなされた。加
熱処理が完了した後、加熱処理ＡＨＦ粉末を回収するた
めに？ットマン／ｌ６１０紙によって懸濁液を口過した
。

アセトンは廃棄した。ＡＨＦ粉末は、次いで１２−１８
時間空気乾燥し、蒸留水の２０１１／中に溶解した。

さらに、溶液は不溶性物質を除くために口過した。

得られた加熱処理Ａ’ＨＦ溶液のサンプルは、ＡＨＦ活
性について分析し、加熱処理されなかった同一ロットか
ら得たＡＨＦのコントロール試料のＡＨＦ活性と比較し
た。

加熱処理されたＡＨＦは、コントロールのＡＨＦ活性の
７０．７１を保持していた。

実施例　５ ヘキサン中でのＡＨＦ粉末の加熱処理 ロツ）ＡＩ−１１５０よ〕得た凍結乾燥ＡＨＦ粉末の０
．５ダ、ラムに、上述の実施例４の方法に準じて加熱処
理がおとなわれた。但し、実施例４のアセトンはヘキサ
ンに変えられた。加熱処理ＡＨＦ１コントロールなＡＨ
Ｆ活性の６２．４％を保持していた。

実施例　６ パーフルオロトリプロビルアミン中でのＡＨＦ粉末の加
熱処理 ロットＡｌ−１１５０から得た０、５グラムの凍結乾燥
ＡＨＦ粉末に対して上述の実施例４において、アセトン
をパーフルオロトリプロピルアミンに変えたこと以外は
同様の方法をくりかえした。加熱処理ＡＨＦは、コント
ロールのＡＨＦ活性の５９．７１を保持していた。

実施例　７ ヘプタン中でのＡＨＦ粉末の加熱処理時間の検耐実施例
２によって得られたロットＡｌ−１８８１由来の凍結乾
燥ＡＨＦ粉末をヘプタン中に溶解し、撹拌棒で１０分間
攪拌し、ＡＨＦのへブタン中懸濁液を調製した。懸濁液
はバイアル中にシールし、９８℃で沸騰させた。サンプ
ルは、　５’：、１０．１５．２０そして３０分間間隔
で加熱処理粉末として採取した。

各々の加熱処理後、各粉末−へブタン懸濁液サンプルは
、ワットマン７ｇ６１０紙によって口過され、加熱処理
ＡＨＦ粉末として回収された。ヘプタンはすてられた。

各々のサンプルは、１２−１８時間空気乾燥され、次い
で蒸留水に溶解させ、不溶性物質を除去するために口過
した。得られた加熱処理ＡＨＦ溶液の各々のサンプルは
活性を測定され、加熱処理されなかった同じロット腐１
から得られたコントロールのＡＨＦサンプルと比較した
。コントロールのＡＨＦ活性は、２．４単位／ｄであシ
、−力木発明の加熱処理ＡＨＦの活性は以下のようであ
った。

５分間処理：　１．３８単位／ｍ１ １０分間処理：　１．５８単位／ｄ １５分間処理：　１．５６単位／ｄ ２０分間処理：　１．５８単位／ｄ ３０分間処理：　１．３５単位／履ｌ 加熱処理サンプルの活性は、平均においてコントロール
サンプルの６２．８　％を保持していた。

実施例　８ ヘプタン中での蛋白質画分の加熱処理 実施例１の方法の３つの工程から得られた蛋白質の２つ
のサンプルと実施例２の方法によって調製されたＡＨＦ
のサンプルが、本発明の方法によって加熱処理された。

実施例１の方法によって得られる蛋白質のサンプルは、
低温沈澱物の２つのサンプル、低温沈澱物の抽出物の２
つのサンプル、Ａ１１（ＯＨ）　３０液の２つのサンプ
ルからなる。低温沈澱物および低温沈澱物の抽出物のサ
ンプル杜、凍結乾燥されヘキサン中で加熱処理された。

一方Ａ／（ＯＨ）３　口重と実施例２の方法によって得
られたＡＨＦの各々２つのサンプルは、凍結乾燥後へブ
タン中で加熱処理された。

各々のサンプルの凍結乾燥粉末は、バイアル中で各々の
有機溶媒に分散され、撹拌棒で１０分間攪拌された。各
々のサンプル瓶は、シールされ、ω℃−１０分間加熱処
理された。加熱処理が完了後、各々のサンプルは、ワッ
トマン４１０紙で口過され、各々の蛋白質粉末を回収し
た。各サンプルは、１２−１８時間空気乾燥され、次い
で各々の乾燥粉末サンプルは、バイアル中の１．０％グ
ルコース溶液に溶解さ九た。使用される１チグルコース
の量は、加熱処理粉末の一当シ２０±ＩＯＡ’であった
。ｐＨは、希釈ＮａＯＨ溶液又は希釈ＨＣｌ溶液で適当
に７±０．１に調整した。最終的に得られた蛋白質溶液
は、次いで除菌口過膜（又はカートリッジフィルター）
を使って口過された。得られた蛋白質粉末溶液は、無菌
試験のためにサンプリングされ、あらかじめ滅菌された
バイアル瓶に分注された。各々の蛋白質粉末溶液は、凍
らせ無菌条件下で凍結乾燥を施した。蛋白質溶液の凍結
乾燥後、生産物は、回収率をめるなめに分析された。そ
の結果を表１に示した。

※　回収率チ、杜、生産物の調製の、ために使われた原
料血漿中の総ＡＨＦ活性の百分率としての凍結乾燥され
た最終生産物中の総ＡＩ（Ｆ活性を示す。

、−１実施例　９ 、、実施例２によって調製されたＡＨＦの加熱処理、　
低温沈澱物の３″：）の別々のサンプル（３００Ｉｉ）
を実施例２の方法で調製した。３度の処理によって各々
得た凍結乾燥粉末をヘプタン中、に分散させ、、撹拌棒
で１０分間攪拌した。各々のサンプルは、バイアル中に
シールされ、ω℃で１０時間処理をした。加熱処理に続
いて、ＡＨＦ粉末／ヘプタン懸濁液杜１ワットマン４１
フイルタ一紙を通して口過され％ＡＨＦｌｌＩ末を回収
した。

粉末は１２−１８時間空気乾燥さ□れ、次もで蒸留水圧
溶解させ、口過、凍結乾燥をおこなった。

加熱処理凍結乾燥粉末と未処理凍結乾燥ＡＨＦ濃縮物よ
シなる相当するコントロールの、性質を比較した。比較
の結果は、表２に示した。

表　２ ※　チ総蛋白質とは、各々のノ２イアルにおける一定量
の滅菌水での蛋白質浸度をいい、１ｏｏｙ当りの蛋白質
のダラム薮として表わされている。

幽※　回収率とは、生産物を調製するために使われた原
料血漿の総ＡＨＦ活性の１１合として凍結乾燥された最
終生産物における総ＡＨＦ　ｌ意味する。

実施例　１０ 実施例２（パイロット規模）で調製されたＡＨＦの加熱
処理 実施例２によって得た低温沈澱物の１ゆをヘプタン中に
懸濁し、撹拌棒で１０分間かきまぜた。粉末／ヘプタン
懸濁液をバイアル中に７−ルし、６０’Ｃ−１０時間処
理をした。加熱処理の完了後、粉末／ヘプタン懸濁液は
、ワットマン４１フイルタ一紙を通して口過され、ＡＨ
Ｆ粉末を回収した。　粉末は１２−１８時間空気乾燥さ
れ、次いで蒸留水に溶解し、さらに懸濁物を除くために
口過をした。この口重をバイアルに分注し、凍結乾燥し
た。

この実施例によって得らｎた加熱処理ＡＨＦ濃縮物の性
質を表３に示した。

表　３ ※及び東※　表２脚注と同意。

実施例　１１ 実施例１で得られたＰＥＧ沈澱物からなる蛋白質画分の
加熱処理 実施例１によって調製されるＰＥＧ沈澱工程にある蛋白
質の４０ｇのサンプルを０．０２Ｍクエン酸Ｎαに溶解
し、そのｐＨを約７に調整した。溶液は、口過し、さら
に凍結乾燥した。凍結乾燥粉末は、ヘプタン中に分散し
、ω℃−１０時間加熱処理した。

加熱処理懸濁液は、口過し、蛋白質の粉末を回収した。

回収された粉末は、１２−１８時間空気乾燥され、次い
でｐＨ７，０±０．５の１．０チグルコース溶液に溶解
した。得られた溶液は、除菌口過膜で口遇し、バイアル
に分注し、滅菌条件下で凍結乾燥した。

加熱処理生産物の性質は、実施例１の方法によって得ら
れたＡＨＦ（（ｊ＝ｚ卜Ａ３−２２６０）のコントロー
ルサンプルト比較した。コントロールサンプルとは、本
発明の加熱処理を受けていないサンプルを意味する。表
４にこの結果を示した。

表　４ ※　ＡＨＦ単位／ｗＩｇ蛋白質 ※棗　表２脚注と同意 実施例　１２ ＰＴＣの加熱処理 実施例３（ロット鷹７２−０５９−８Ｌ、）によって得
られた凍結乾燥ＰＴＣ粉末を、　ヘプタン中に分散させ
た。得られた懸濁液を同量ｆつ各バイアルに分注し、６
０℃−１０時間の処理をした。３つの因子の活性、すな
わちファクター■、ファクター■、ファクターＸについ
て、加熱処理後に分析し、加熱処理をしなかったコント
ロールと比較した。結果を表５に示した。

表　５ 実施例　１３ 加熱処理蛋白質画分中のＨＢウィルス活性（チンパンジ
ーテスト） 低温沈澱物の２６２Ｉｉｆ：ＰＥＧ沈澱工程に至る実雄
側１の方法によって得た。ＰＥＧ沈澱物は、０．０２　
Ｍクエン酸Ｎαに溶解され、ｐＨ１ｄ、約７に調整した
。溶液は、口過され、次いでバイアルに分注した。各バ
イアルは約２５０単位のＡＨＦ活性をもっていた。感染
性ＨＢウィルス〔５００チンノンジ感染投与量（ＣＩＤ
）又は１０ρｏｏ　Ｇ！Ｄ　）が各々のバイアルに注入
された。各々のバイアル製剤は凍結乾燥され粉末にし、
さらにヘプタン中に分散させ、個々に加熱処理をした。

バイアルの第１のグループを約ω℃で加持間（６２℃±
２℃）加熱処理した。

ノ２イアルの第２のグループは９８℃で３０分間の加熱
処理をした。コン）ｏ−ル製剤は加熱処理をしなかった
。各サンプルは各々の処理後、口過され、１２−１８時
間空気乾燥させ蛋白質の粉末を得た。各サンプルは、次
いでｌＱｍの滅菌水に溶解した。サンプルはチンパンジ
ーに投与し、各サンプル中の）１Ｂウイルスの感染性の
残存の有無を試験した。

７つのサンプルは、７匹のチン、ｅンジ―に以下の方法
で注射投与をした；約ω℃で２０ｉ間へブタ□ン中で処
理した５０００ＩＤを含む２つのサンプル；約ω℃で加
持間へブタン中で処理した１０ρＱＱ　ＧＩＤを含む２
つのサンプル：９８℃で３０分間へブタン中で処理した
５０１１Ｄを含む１つのサンプル；９８℃で３０分間へ
ブタン中で処理した１０，０００　ＧＩＤを含む１つの
サンプル；５００ＣＩＤを含む１つのコントロールサン
プル（不加熱）。

各々の試験サンプルの全量を個々のチンパンジーに静脈
内投与した。そしてチンパンジーは、以降６ケ月間観察
をおこなった。血液試料を分析のため□に６ケ月間１週
間単位で採取した。そして、チンパンジーが８２ｍ１肝
炎をおこしているかどうかを検定した。血液試料がＨＢ
ＩＡＩについて陰性であれば、そのシンパンジーはＢ型
肝炎をおこしていないのであ）、一方血液試料がＨＢ＃
ＡＪｉｌ陽性であれば、該チンパンジーはＢ型肝炎をお
こしているのである。６ケ月のチンパンジー試験の結果
を表６に示した。

表　６ ６７月のチンノ′ソンジー試験の結果状、実施例１３の
蛋白質製剤において少なくともＨＢウィルスのｓｏｏ　
ｃ：ｃｎ　ｉｊ約ω℃で加持間の処理によってその感染
性が不活化されることが、実験Ａ３９□２と４００で示
された。結果は、ま良実雄側１３の蛋白質製剤の約ω”
Ｃ−２０時間の加熱処理祉、５０Ｇと１０１）Ｇ。

Ｃ１ＩＤの間でのＨＢウィルスの投与を不活化すること
を示している。このことは、１の陰性チンパンジー（／
％　３８２．１０，０００　ＣＩＤを投与）と１の陽性
チン／Ｑ　７　：）−（Ａ　４１７．１０，０００　Ｃ
ＩＤを投与）によって明らかである。さらに結果は、実
施例１３の蛋白質製剤の９８℃−３０分間の加熱処理け
、ＨＢウィルスの５０００ＩＤを不活化することはでき
ないことを示している。これは、試験動物４３９８と３
８０における陽性判定によって明らかである。

一方、９８℃−３０分間の加熱処理は、ＨＢ　？イルス
の５０００ＩＤ投与を完全には不活化できない。

このような加熱処理は、ＨＢウィルスのよシ少ない投与
量でしか不活化そきないめだろう。

ｔ＊Ｓケ月の観察の間Ｋ、コントロールの動物（テンパ
レジー／％　４１９　）　”−ｉｔ非Ａｌ１ｍＢ型の肝
炎にかかった。一方他のどの試験−物も仁の型の肝炎−
一かからなかった。そのた□め実施例１３の蛋白質製−
の加熱処理は、不確定ではあるが非Ａ非Ｂ型肝炎ウィル
スのある投与量を不活化することに成功したと結論し九
。

実施例　１４゜ 実施例１によって調製されたＰＥＧ沈澱物からなる蛋白
質画分の加熱処理（臨床試験） 人の血漿の生産物をＰＩＣＧ沈澱工程に至る実施例１に
概要を示した方法によって処置した。

ＰＥＧ沈澱は−ストは、次いで集められ分割された；Ｉ
は実施例１の連続方法によって処理され、それはＡＨＦ
のコントロールロット（Ａ３−２５９０）とした。ちは
、０．０２　Ｍクエン酸８α溶液に溶解し喪。溶液のｐ
Ｈは、約７に調整し、除菌口過され凍結乾燥された。

０．０２　Ｍクエン酸前溶液に溶解された蛋白質粉末、
すなわちＡＨＦは、　２つのロフトに分割した。

第１のＡＨＦロット（Ａ９−２５９０Ｂ）はへブタン中
に分散させ、バイアルに分注しシールした。次いで６０
°±１℃で夏時間と１０分間加熱した。加熱の完了後、
ＡＨＦの粉末／ヘプタン懸濁液は、ワットマン／Ｉ６１
フィルターで口過されＡＨＦ粉末を回収した。ＡＨＦ粉
末は、次いで１２−１８時間空気乾燥された。乾燥粉末
は、約７のｐＨ０１チグルコース溶液に溶解された。得
られた溶液性、除菌口過され、分注、凍結乾燥された。

第２のＡＨＦロット（Ａ９−２５９ＯＡ）は、ヘプタン
中に分散された。そして、ＡＨＦＨＦ粉末／ヘノ２フ の完了後，ＡＨＦ粉末／ヘプタン懸濁液は、ワットマン
／ｌ６１０紙によって口過されＡＨＦ粉末を回収した。

粉末は、１２　−　１８時間空気乾燥され、さらにこれ
を１係グルコース溶液に再溶解し、そのｐＨを約７に調
整した。得られた溶液は、除菌口過され、バイアルに分
注され凍結乾燥した。

コントロールロットと２つの加熱処理されたロットのサ
ンプルについて分析した。結果を表７に示した。

表　７ ※　：単位／バイアル ※※　：　ｇ／１００ｍ ※秦※　：　ＡＨＦ単位／ダ蛋白質 ※＊崩※：　■／バイアル コントロールロット（　Ａ３　−　２５９０　）のＡＨ
Ｆと実施例１４によって得られた加熱処理四ツ）（４９
−２５９０ＡとＡ９−２５９０Ｂ）を、滅菌水に溶解し
、最終溶液のｄ当少少なくともＡＨＦの２０単位を含む
バイアルを調製した。

所定の日にロットＡ３−２５９０　（コントロール）の
ＡＨＦ溶液ζ及び患者に応じて一週間前又は−週間後に
四ツ）Ａ９−２５９ＯＡの加熱処理ＡＨＦ溶液を、７人
の患者に注射投与した。

所定の８にロットＡ３−２５９０　（コントロール）の
ＡＨＦ溶液を、及び患者に応じて一週間前又は−週間後
にロットＡ９−２５９０Ｂの加熱処理ＡＨＦ溶液を６人
の異なった患者に注射投与した。

ＡＨＦ溶液の３から６のバイアルが、各々別々に注射投
与された。

ロットＡ３−２５９０（コントロール）又はＡ９−２５
９０Ｂの溶液の投与によっては何等の副作用は生じなか
った。被験患者の１人は、四ツ）Ａ９−２５９ＯＡのＡ
ＨＦ溶液を投与したとき弱い頭痛を経験したが、これ社
−過性のものであった。仁の患者は何等の処置を必要と
せず、約１０分後にはもはや何等の不快感を感じなかっ
た。四ツ）Ａ９−２５９ＯＡのＡＨＦ溶液の注射をされ
た他の患者６人は，何等の変微娘なかった。

この試験の間、コントロールロット（Ａ３−２５９０）
のＡＨＦ溶液の投与患者への効果において、ロッ）Ａ９
−２５９ＯＡ又はロットＡ９−２５９０ＢのＡＨＦの投
与患者への効果と比較して伺等格別の差違は見い出され
なかった。またＡＨＦの生体内回復もしくは生体内半減
期の点で、コントロールロット（Ａ３−２５９０）と２
つの加熱処理ロット（Ａ９−２５９０Ａ及びＡ９−２５
９０　Ｂ　）の間には、何等本質的な差違はなかった。

すなわち、これら製剤は同等の生物学的有用性を保持し
ていることを意味していた。

以上の本発明の説明において、加熱処理される蛋白質と
して実施例１−３の方法によって提供されるＡＨＦとＰ
ＴＣを具体例として示したが、他の方法によって得られ
るＡＨＦとＰＴＣも当然に本発明からなる加熱処理をお
こなうことができる。

また上述したように、ＡＨＦとＰＴＯ以外の蛋白質製剤
も、本発明の方法によって加熱処理をすることができ、
それによってその生物学的活性を実質的に保持して滅菌
生物学的製剤を提供することができる。

生物学的製剤に夾雑するウィルスを不活化する工程に関
する上述の実施例の記載は、発明の明確化のためである
。当業者には、当然のことであるが、多様性ゆえに、本
発明は上述の特別な実施例に限定されるものではない。

本発明の概要は、特（ほか３名）

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １）以下の工程よシなる生物学的製剤に夾雑するウィル
   スを不活化する方法： （α）生物学的製剤を乾燥粉末の形状にすること；（ｈ
   ）　この生物学的製剤の乾燥粉末を、有機溶媒に混合さ
   せ、溶媒中に粉末を懸濁すること；（Ｃ）　次いで、生
   物学的製剤に夾雑するどんなウィルスをも不活化するが
   生物学的製剤の生物学的活性は実質的に維持させるに十
   分な条件で懸濁液を一定時間、一定温度で加熱処理する
   こと； （ｄ）　有機溶媒から、懸濁された生物学的製剤を分離
   し、分離された血漿画分を回収すること。 ２）加熱温度が、約６０℃から約１００℃である特許請
   求の範囲第１項に記載の方法。 ３）加熱時間が、約５分間から約３０時間である特許請
   求の範囲第１項に記載の方法。 ４）有機溶媒が、アルカン、ケトン、そしてパーフルオ
   ロ化合物の群から選ばれる特許請求の範囲第１項に記載
   の方法。 ５）有機溶媒が、ヘプタンである特許請求の範囲第１項
   に記載の方法。 ６）有機溶媒が、ヘキサンである特許請求の範囲第１項
   に記載の方法。 ７）　有機溶媒が、アセトンである特許請求の範囲第１
   項に記載の方法。 ８）有機溶媒が、ノｅフルオロトリゾロビルアミンであ
   る特許請求の範囲第１項に記載の方法。 ９ン　一定温度が、約６０℃であシ、一定時間が。 約１０時間から約３０時間である特許請求の範囲第１項
   に記載の方法。 １０　懸濁液が、約９５℃から約１００℃の一定温度で
   、約３０分間から約１０時間の一定時間加熱処理される
   特許請求の範囲第１項に記載の方法。 １１）　生物学的製剤が、人の血漿から分画された少な
   くとも１つの蛋白質画分である特許請求の範囲第１項に
   記載の方法。 １２）生物学的製剤が、アルブミン、アンティトロンビ
   ン１１フイプリノゲン、ファクター■、プロトロンビン
   複合体、そしてこれらの混合物の群から選ばれる特許請
   求の範囲第１項記載の方法。 １３）　生物学的製剤が、人血漿から分離されたファク
   ター■含有画分である特許請求の範囲第１項に記載の方
   法。 １４）　ウィルスが、Ｂ型肝炎ウィルスである特許請求
   の範囲第１項に記載の方法。