CN101214391A - 一种高效生物胶封闭剂及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种高效生物胶封闭剂及其应用，它由主体胶冻干粉、催化剂冻干粉、主体胶溶解液和催化剂溶解液四个组分组成；使用时以主体胶溶解液将主体胶冻干粉溶解，催化剂溶解液将催化剂冻干粉溶解，然后分别吸入到双腔推液器的无菌注射器内，通过双腔推液器的锥头均匀混合二种溶液，喷涂到手术或出血创面即可形成一层半透明乳白色薄膜；本发明还公开了上述高效生物胶封闭剂各组分的制备方法，包括以猪血作为原材料制备主体胶冻干粉、催化剂冻干粉等；本发明产品为即可使用的可吸收生物胶组合物，用于组织止血、组织封口和组织粘合，可广泛应用于外科领域如普外科、骨科、心胸外科、神经外科、妇产科等。
Description
技术领域
本发明涉及一种高效生物胶封闭剂，属生物医药领域；具体的说是涉及一种能迅速形成高效生物胶薄膜，具有高度止血、粘合和封闭创面作用的生物胶药物组合物，是一种生物止血材料。
背景技术
控制出血(流血)是手术、急救和野外创伤护理的关键环节。不幸的是，来自各种原因的出血(流血)是非常见的，日常生活和工作中的意外受伤出血(流血)、外科手术中的创伤出血(流血)、来自战争的受伤出血(流血)等，如不能控制及时处理，则将有可能造成巨大损失甚至死亡。实事表明，通过使用简单的和有效的出血控制方法，可以实现给手术、急救和野外创伤护理带来极大的方便。
在第二次世界大战的最后一年血纤蛋白原和凝血酶被广泛使用。不过后来受到了禁止，因为它会传播肝炎。自美国红十字会以及其他机构开发出了血浆蛋白纯化方法，而且这些方法能消除肝炎的危险以后，单一供体血纤蛋白密封剂被广泛地在临床上使用，不仅用于出血控制，而且用于各种手术场合的手术室辅助物。上世纪80年代以后国外的主要制造商有：奥地利的Baxter-Immuno AG(商品名Tissuccol)、德国的Aventis Behring(商品名Beriplast P)、加拿大的Haemacure(商品名Hemaseel APR)、日本的Kaketsuken Pharmaceutical(商品名Bolheal)、法国的LFB-Lille(商品名Biocol)、美国的VI Technologies(商品名VIGuard F.S.)等。纤维蛋白封闭剂是模拟血凝的最后阶段反应由血浆蛋白成份组成的一种复合制剂，它可以通过凝血酶从纤维蛋白原释放纤维蛋白肽形成具有一定强度的纤维蛋白凝块，应用于临床可起到封闭创面，止血和伤口愈合的作用。工业化制造的纤维蛋白封闭剂己在许多外科手术中显示出特有的价值，备受外科医生推崇，迄今还未发现明显的毒性和不良反应。
中国专利CN1246047C公开了含纤维蛋白原、凝血酶和醇的悬浮液及其涂敷载体的方法，该专利中的纤维蛋白原、凝血酶是采用人或牛的纤维蛋白原、凝血酶，国外纤维蛋白封闭剂的纤维蛋白也多原来源于人血，凝血酶也大部分从人血提取，部分采用牛血为原料；采用人血作为纤维蛋白封闭剂制备原料有传播HBV、HIV等病毒的潜在危险，而牛血制品有传播疯牛病和感染其他人畜共患病的可能性，且可引起人凝血因子V缺乏；另外，采用人血为原料易导致产品成本高，价格昂贵，在发展中国家广泛应用受到一定的限制。干燥的血纤蛋白原-凝血酶敷料，这种敷料目前的配方中使用了牛凝血酶。尽管这种血纤蛋白原-凝血酶敷料不需要预先混合，并且便于使用，但由于它需要在4℃下保存，并且在应用于伤口上之前需要用盐溶液预先湿润，使它的应用也受到了限制。中国专利CN1214446C公开了一种高凝固性纤维蛋白原胶，其纤维蛋白原为人血纤维蛋白原、牛血纤维蛋白原或猪血纤维蛋白原，原料中也使用了人血或牛血；而且在制作工艺中使用了丙酮、乙醚等有机溶剂，不但增加了生产成本，而且在生产中易带来安全隐患。
发明内容
本发明的目的是为了提供一种更加高效、安全、稳定和使用方便的高效生物胶封闭剂，其以猪血为主原料，既降低了成本，又减少了血源性疾病的传播机会，同时所得产品可缩短封闭凝固时间，为临床病人的抢救争取更大的机会。
本发明的目的是这样实现的：一种高效生物胶封闭剂，它由主体胶冻干粉、催化剂冻干粉、主体胶溶解液和催化剂溶解液四个组分构成，其特征在于：按重量百分比计算，主体胶冻干粉含纤维蛋白原和XIII因子33.3％-71.0％，氯化钠2.0-5.6％，枸椽酸钠2.0-5.6％，蔗糖20.2％-27.8％，组氨酸0.2％-5.6％，精氨酸0.2％-5.6％，聚山梨酯0.2％-2.8％，白蛋白4.2-14.0％；催化剂冻干粉含凝血酶450IU/ml-650IU/ml，甘氨酸20mg/ml-80mg/ml，白蛋白5mg/ml-30mg/ml；主体胶溶解液含醋酸钠1mg/ml-15mg/ml，氯化钠1mg/ml-15mg/ml；催化剂溶解液含三羟甲基氨基甲烷3mg/ml-20mg/ml，盐酸3mg/ml-20mg/ml，氯化钙5mg/ml-30mg/ml。
上述的高效生物胶封闭剂，其中，所述的主体胶冻干粉的制备方法包括如下步骤：
(1).以猪血液为原料，将猪血液于2℃-10℃低温库中静置，让其分层，用虹吸法吸取上层血浆液，下层红细胞弃去；上层血浆液用3000转/分钟-10000转/分钟的高速冷冻离心机离心30分钟-60分钟，收集血浆，用0.22μm滤膜过滤；取滤过血浆，每升加入甘氨酸1g-30g，使其溶解，将血浆降温至0～4℃，每升加入醋酸钠50g-250g，使其溶解，搅拌30分钟。用3000转/分钟-10000转/分钟的高速冷冻离心机离心，收集沉淀。
(2).取步骤(1)收集沉淀搅碎，加入由枸橼酸钠与三羟甲基氨基甲烷制成的pH值6.0-10.0的缓冲溶液，搅拌至完全溶解，过滤，测蛋白含量和溶解液体积；加入重量比为总蛋白量的0.1-12倍量的6-氨基己酸或组氨酸，搅拌至完全溶解，再用1.0μm与0.22μm的滤芯依次进行过滤，收集滤液并移入搅拌罐中，再加入由枸橼酸钠与三羟甲基氨基甲烷制成的缓冲溶液，调节pH值至5.0-9.0，每升加入聚山梨酯-80为10.13g与磷酸三丁酯3.04g，搅拌均匀，25℃保温搅拌6小时。每升加入甘氨酸1g-30g，使其溶解，将血浆降温至0～4℃，每升加入醋酸钠50g-250g，使其溶解，搅拌30分钟。用3000转/分钟-10000转/分钟的高速冷冻离心机离心，收集沉淀，得主体胶第一次纯化物。
(3).取步骤(2)收集沉淀搅碎，加入由枸橼酸钠与三羟甲基氨基甲烷制成的pH值7.0-10.0的缓冲溶液，搅拌至完全溶解，过滤，测蛋白含量和溶解液体积；加入重量比为总蛋白量的0.1-12倍量的6-氨基已酸或组氨酸，搅拌至完全溶解，再每升加入甘氨酸1g-30g，使其溶解，将溶液降温至0～4℃，每升加入醋酸钠50g-250g，使其溶解，搅拌30min。用3000转/分钟-10000转/分钟的高速冷冻离心机离心，收集沉淀。用浓度为0.1％三羟甲基氨基甲烷以盐酸调pH值3.0～7.0的溶液，分次加入沉淀中，进行搅拌洗涤3-5次，收集沉淀，得主体胶第二次纯化物。
(4).取步骤(3)最后收集沉淀350g-600g，加注射用水8000ml在37℃水浴下溶解，过滤除去杂质，并检测蛋白含量，得主体胶原液；另取组氨酸1g-100g、枸橼酸钠10g-100g、蔗糖100g-500g、氯化钠10g-100g、聚山梨酯80∶0.1g-50g、精氨酸0.1g-100g加入到约1800ml注射用水中，搅拌使其完全溶解，再加入到主体胶原液中，搅拌均匀，然后再另加入200ml含2g-25g白蛋白的溶液，搅拌均匀，加注射用水调整至10000ml，加盐酸调节pH至5.0-8.0用0.22μm滤膜过滤，灌装，冷冻干燥，100℃干热法病毒灭活30分钟，检验，包装，得主体胶冻干粉。2-8℃低温库保存。
上述的高效生物胶封闭剂，其中，所述的催化剂冻干粉的制备方法包括如下步骤：
(1).以猪血液为原料，将猪血液于4℃-15℃低温库中静置，让其分层，用虹吸法吸取上层血浆液，下层红细胞弃去；上层血浆液用3000转/分钟-10000转/分钟的高速冷冻离心机离心30分钟-60分钟，收集血浆，用0.22μm滤膜过滤；取滤过血浆，每升依次加入聚山梨酯-80∶10.13g、磷酸三丁酯3.04g到血浆中，搅拌罐中25℃搅拌6小时，再每升加入硫酸钡5g-30g，搅拌吸附2小时；用3000转/分钟-10000转/分钟的高速冷冻离心机离心，收集沉淀。
(2).取步骤(1)收集沉淀，加入1-5倍量的9％-15％的氯化钠水溶液搅拌，用转速为2000转/分钟-5000转/分钟的离心机离心30min、离心温度为4℃，弃上清液，得沉淀。重复2-4次。取沉淀加入1-5倍量的10％-20％的枸橼酸钠水溶液，搅拌30分钟，以2000转/分钟-5000转/分钟的离心机离心30分钟、离心温度为4℃，收集上清液。重复3-5次，合并上清液。
(3).取步骤(2)上清液，用0.22μm滤膜过滤。取滤液，分别加入的氯化钙溶液和甘氨酸溶液，使最后的溶液中氯化钙含量为1.8％、甘氨酸含量为1％，搅拌均匀，调pH值至4.5-8.0，以0.22μm滤膜过滤。滤液密封室温放置8小时，后转入2～8℃低温库中继续放置2-3天。超滤、脱盐、浓缩，将浓缩液离心，以2000转/分钟-5000转/分钟的离心机离心30分钟、离心温度为4℃，收集上清液，测量体积，搅拌均匀，检测凝血酶效价。
(4).取步骤(3)最后的上清液，加入甘氨酸与白蛋白溶液，加入注射用水调整最后溶液的体积，使得最后溶液的凝血酶效价为450-650IU/ml、甘氨酸含量20mg/ml-80mg/ml、白蛋白含量5mg/ml-30mg/ml，在无菌条件下，用0.22μm滤膜过滤，灌装，冷冻干燥，100℃干热法病毒灭活30分钟，检验，包装，得催化剂冻干粉。2-8℃低温库保存。
上述的高效生物胶封闭剂，其中，主体胶溶解液的制备方法包括如下步骤：称取醋酸钠1g-15g和氯化钠1g-15g，加入到1000ml注射用水中，搅拌至完全溶解，用醋酸调pH值至3.5～7.0，搅拌均匀，在无菌条件下，用0.22μm滤膜过滤，灌装，轧盖，灭菌，检验，包装，得主体胶溶解液。2-8℃低温库保存。
上述的高效生物胶封闭剂，其中，催化剂溶解液的制备方法包括如下步骤：称三羟甲基氨基甲烷3g-20g和氯化钙5g-30g，加入到1000ml注射用水中，搅拌至完全溶解，用盐酸调pH值至5.0-8.0，搅拌均匀，在无菌条件下，用0.22μm滤膜过滤，灌装，轧盖，灭茵，检验，包装，得催化剂溶解液。2-8℃低温库保存。
上述的高效生物胶封闭剂的应用，将主体胶冻干粉溶于主体胶溶解液制成组份A，催化剂冻干粉溶于催化剂溶解液制成组份B，使用时分别吸入组份A与组份B到组合式推液支架(本申请人的专利产品，公告号：CN2553815Y)的双腔推液器的无菌注射器内，通过双腔推液器的锥头均匀混合二种溶液，同时呈雾状或细滴喷涂到手术或出血创面即可形成一层半透明乳白色薄膜。
上述的高效生物胶封闭剂的应用，其中，所述的组份A和组份B为液体，使用时二种溶液通过组合式推液支架(本申请人的专利产品，公告号：CN2553815Y)的锥头均匀混合，呈雾状或细滴喷涂到手术或出血创面，形成一层纤维蛋白膜，起到封闭创面或止血止渗的作用，可以用于普通外科、骨科、心胸外科、神经外科、妇产科的组织止血、组织封口和组织粘合。
本发明通过对猪纤维蛋白原及XIII因子凝固活性调解因素的研究，以最佳的组合配方和制备工艺，发明了上述高效生物胶封闭剂，具有如下特点：
1.本发明是一种生物胶组合物，组方合理，制备工艺简单，生产易实现自动化控制。
2.本发明利用猪血作为主原料进行纤维蛋白原与XIII因子以及凝血酶的提纯。由于猪的基因序列同人的基因序列极为相似，而携带人类的传染性疾病传播风险极小，既降低了成本，又避免了人类血源性疾病的传播机会。
3.本发明产品以猪血作为原料，以独特的工艺和配方制备生物胶主体胶冻干粉和催化剂冻干粉，在制备工艺中包括了去免疫原性、S/D法病毒灭活等工艺方法，使产品具有更高的可靠性与安全性。
4.本发明的最终产品配合本申请人的专利(公告号CN2553815Y)产品组合式推液支架使用，具有极佳的封闭、止血效果，其封闭凝固时间为3-5秒，较目前同类产品明显缩短(目前同类中封闭凝固时间最快的产品(如中国专利CN1214446C)的凝固时间约为9-12秒)，为临床病人的抢救争取了更大的机会。
5.本发明生产安全环保。制备工艺的全过程中彻底摒弃了以往的有机溶剂使用，操作过程中对人员和周围环境不产生危害，符合国家的环保要求。
附图说明
图1是本发明高效生物胶封闭剂形成生物胶薄膜的流程图。
具体实施方式
本发明是一种高效生物胶封闭剂，它由主体胶冻干粉、催化剂冻干粉、主体胶溶解液和催化剂溶解液四个组分构成。其中：按重量百分比计算，主体胶冻干粉含纤维蛋白原和XIII因子33.3％-71.0％，氯化钠2.0-5.6％，枸椽酸钠2.0-5.6％，蔗糖20.2％-27.8％，组氨酸0.2％-5.6％，精氨酸0.2％-5.6％，聚山梨酯0.2％-2.8％，白蛋白4.2-14.0％；催化剂冻干粉含凝血酶450IU/ml-650IU/ml，甘氨酸20mg/ml-80mg/ml，白蛋白5mg/ml-30mg/ml；主体胶溶解液含醋酸钠1mg/ml-15mg/ml，氯化钠1mg/ml-15mg/ml；催化剂溶解液含三羟甲基氨基甲烷3mg/ml-20mg/ml，盐酸3mg/ml-20mg/ml，氯化钙5mg/ml-30mg/ml。
以下通过具体的实施例子对本发明各组分的含量、制备以及应用等做进一步的阐述，但本发明并不限于此特定例子。
实施例1主体胶冻干粉制备一
采集猪血液55000ml，加入含0.147mol/L枸橼酸钠与0.154mol/L氯化钠的抗凝剂6000ml，于4℃低温库中静置6小时，让其分层，用虹吸法吸取上层血浆液，下层红细胞弃去；上层血浆液用高速冷冻离心机在10℃以3200转/分钟的转速离心40分钟，收集血浆，用0.22μm滤膜过滤；取滤过血浆20000ml，加入甘氨酸73.5g，使其溶解，将血浆降温至4℃，加入醋酸钠2605.4g，使其溶解，搅拌30分钟，高速冷冻离心机10℃用3500转/分钟的转速离心40分钟，收集沉淀，得沉淀2520.8g。将收集沉淀搅碎，加入33升由枸橼酸钠与三羟甲基氨基甲烷制成的pH值7.5的缓冲溶液，搅拌至完全溶解，过滤，测得蛋白含量为14mg/ml，得溶解液体积约35升；加入甘氨酸152.3g，搅拌至完全溶解，再用1.0μm与0.22μm的滤芯依次进行过滤，收集滤液并移入搅拌罐中，再加入由枸橼酸钠与三羟甲基氨基甲烷制成的的缓冲溶液，调节pH值至7.3，加入聚山梨酯80为354.55g与磷酸三丁酯106.4g，搅拌均匀，25℃保温搅拌6小时；加入甘氨酸249.5g，使其溶解，将血浆降温至0～4℃，加入醋酸钠8023.8g，使其溶解，搅拌30分钟。以4000转/分钟的转速3℃冷冻离心，收集沉淀，得主体胶第一次纯化物2488.6g。取主体胶第一次纯化物，加入33升由枸橼酸钠与三羟甲基氨基甲烷制成的pH值10.0的缓冲溶液，搅拌至完全溶解，过滤，甘氨酸104.2g，搅拌至完全溶解，将溶液降温至3℃，加入醋酸钠4800g，使其溶解，搅拌30分钟。用4000转/分钟的转速3℃冷冻离心，收集沉淀。沉淀用浓度为0.1％三羟甲基氨基甲烷以盐酸调pH值7.0的溶液，分次加入沉淀中，进行搅拌洗涤4次，收集沉淀，得主体胶第二次纯化物2378.5g。取主体胶第二次纯化物600g，加注射用水8000ml在37℃水浴下溶解，过滤除去杂质，得主体胶原液；另取组氨酸70g、枸橼酸钠90g、蔗糖150g、氯化钠20g、聚山梨酯80∶5.0g、精氨酸1.8g加入到约1800ml注射用水中，搅拌使其完全溶解，再加入到主体胶原液中，搅拌均匀，然后再另加入200ml含5g白蛋白的溶液，搅拌均匀，加注射用水调整至10000ml，加盐酸调节pH至7.2用0.22μm滤膜过滤，灌装，冷冻干燥，100℃干热法病毒灭活30分钟，检验，包装，得主体胶冻干粉。2-8℃低温库保存。
实施例2主体胶冻干粉制备二
采集猪血液50000ml，加入含0.151mol/L枸橼酸钠与0.148mol/L氯化钠的抗凝剂5700ml，于4℃低温库中静置8小时，让其分层，用虹吸法吸取上层血浆液，下层红细胞弃去；上层血浆液用高速冷冻离心机在10℃以5000转/分钟的转速离心30分钟，收集血浆，用0.22μm滤膜过滤；取滤过血浆18000ml，加入甘氨酸86.5g，使其溶解，将血浆降温至2℃，加入醋酸钠3024.8g，使其溶解，搅拌30分钟，高速冷冻离心机10℃用4000转/分钟的转速离心30分钟，收集沉淀，得沉淀2490.8g。将收集沉淀搅碎，加入32升由枸橼酸钠与三羟甲基氨基甲烷制成的pH值6.5的缓冲溶液，搅拌至完全溶解，过滤，测得蛋白含量为16mg/ml，得溶解液体积约33升；加入6-氨基己酸254.9g，搅拌至完全溶解，再用1.0μm与0.22μm的滤芯依次进行过滤，收集滤液并移入搅拌罐中，再加入由枸橼酸钠与三羟甲基氨基甲烷制成的的缓冲溶液，调节pH值至7.2，加入聚山梨酯80为334.3g与磷酸三丁酯100.2g，搅拌均匀，25℃保温搅拌6小时；加入甘氨酸312.7g，使其溶解，将血浆降温至2℃，加入醋酸钠6817.2g，使其溶解，搅拌30分钟。以5000转/分钟的转速2℃冷冻离心，收集沉淀，得主体胶第一次纯化物2416.6g。取主体胶第一次纯化物，加入32升由枸橼酸钠与三羟甲基氨基甲烷制成的pH值9.0的缓冲溶液，搅拌至完全溶解，过滤，6-氨基已酸100.2g，搅拌至完全溶解，再加入甘氨酸320.1g，使其溶解，将溶液降温至2℃，加入醋酸钠5200g，使其溶解，搅拌30分钟。用8000转/分钟的转速2℃冷冻离心，收集沉淀。沉淀用浓度为0.1％三羟甲基氨基甲烷以盐酸调pH值6.8的溶液，分次加入沉淀中，进行搅拌洗涤3次，收集沉淀，得主体胶第二次纯化物2392.5g；取主体胶第二次纯化物580g，加注射用水8000ml在37℃水浴下溶解，过滤除去杂质，得主体胶原液；另取组氨酸40g、枸橼酸钠30g、蔗糖200g、氯化钠60g、聚山梨酯80∶10g、精氨酸6g加入到约1800注射用水中，搅拌使其完全溶解，再加入到主体胶原液中，搅拌均匀，然后再另加入200ml含10g白蛋白的溶液，搅拌均匀，加注射用水调整至10000ml，加盐酸调节pH至7.0，用0.22μm滤膜过滤，灌装，冷冻干燥，100℃干热法病毒灭活30分钟，检验，包装，得主体胶冻干粉。2-8℃低温库保存。
实施例3主体胶冻干粉制备三
采集猪血液60000ml，加入含0.145mol/L枸橼酸钠与0.151mol/L氯化钠的抗凝剂6000ml，于5℃低温库中静置6小时，让其分层，用虹吸法吸取上层血浆液，下层红细胞弃去；上层血浆液用高速冷冻离心机在10℃以5000转/分钟的转速离心60分钟，收集血浆，用0.22μm滤膜过滤；取滤过血浆22000ml，加入甘氨酸95.8g，使其溶解，将血浆降温至3℃，加入醋酸钠2931.8g，使其溶解，搅拌30分钟，高速冷冻离心机10℃用6000转/分钟的转速离心30分钟，收集沉淀，得沉淀2685.8g。将收集沉淀搅碎，加入35升由枸橼酸钠与三羟甲基氨基甲烷制成的pH值7.8的缓冲溶液，搅拌至完全溶解，过滤，测得蛋白含量为18mg/ml，得溶解液体积约36.5升；加入甘氨酸190.5g，搅拌至完全溶解，再用1.0μm与0.22μm的滤芯依次进行过滤，收集滤液并移入搅拌罐中，再加入由枸橼酸钠与三羟甲基氨基甲烷制成的的缓冲溶液，调节pH值至7.3，加入聚山梨酯-80为371.2g与磷酸三丁酯110.9g，搅拌均匀，25℃保温搅拌6小时；加入甘氨酸298.5g，使其溶解，将血浆降温至3℃，加入醋酸钠7865.8g，使其溶解，搅拌30分钟。以6000转/分钟的转速3℃冷冻离心，收集沉淀，得主体胶第一次纯化物2688.6g。取主体胶第一次纯化物，加入35升由枸橼酸钠与三羟甲基氨基甲烷制成的pH值8.5的缓冲溶液，搅拌至完全溶解，过滤，组氨酸112.2g，搅拌至完全溶解，再加入甘氨酸280.4g，使其溶解，将溶液降温至3℃，加入醋酸钠5800g，使其溶解，搅拌30分钟。用6000转/分钟的转速3℃冷冻离心，收集沉淀。沉淀用浓度为0.1％三羟甲基氨基甲烷以盐酸调pH值7.0的溶液，分次加入沉淀中，进行搅拌洗涤5次，收集沉淀，得主体胶第二次纯化物2540.4g。取主体胶第二次纯化物520g，加注射用水8000ml在37℃水浴下溶解，过滤除去杂质，得主体胶原液；另取组氨酸30g、枸橼酸钠20g、蔗糖280g、氯化钠90g、聚山梨酯80∶3.0g、精氨酸7.8g加入到约1800注射用水中，搅拌使其完全溶解，再加入到主体胶原液中，搅拌均匀，然后再另加入200ml含20g白蛋白的溶液，搅拌均匀，加注射用水调整至10000ml，加盐酸调节pH至6.8用0.22μm滤膜过滤，灌装冷冻干燥瓶中，冷冻干燥，100℃干热法病毒灭活30分钟，检验，包装，得主体胶冻干粉。2-8℃低温库保存。
实施例4催化剂冻干粉制备一
采集猪血液50000ml，加入含0.151mol/L枸橼酸钠、0.148mol/L氯化钠与0.138mol/L草酸钾的抗凝剂5000ml，于5℃低温库中静置8小时，让其分层，用虹吸法吸取上层血浆液，下层红细胞弃去；上层血浆液用3500转/分钟的转速10℃冷冻离心50分钟，收集血浆，用0.22μm滤膜过滤；取滤过血浆24000ml，依次加入聚山梨酯-80∶243.1g、磷酸三丁酯73.0g到血浆中，搅拌罐中25℃搅拌6小时，再加入硫酸钡480g，搅拌吸附2小时；用5000转/分钟的转速10℃冷冻离心40分钟，收集沉淀，得沉淀590g；取沉淀，加入1200ml的9％的氯化钠水溶液搅拌，用转速为3200转/分钟的离心机离心30min、离心温度为4℃，弃上清液，得沉淀。重复2次。取沉淀加入1200ml的10％的枸橼酸钠水溶液，搅拌30分钟，以3500转/分钟的离心机离心30分钟、离心温度为4℃，收集上清液。重复3次，合并上清液；取上清液，用0.22μm滤膜过滤；取滤液，分别加入200ml的36％氯化钙溶液和200ml的20％甘氨酸溶液，搅拌均匀，调pH值至7.0，以0.22μm滤膜过滤，滤液密封室温放置8小时，后转入2℃低温库中继续放置2天。超滤、脱盐、浓缩，得浓缩液500ml，将浓缩液离心，以4000转/分钟的离心机离心30分钟、离心温度为4℃，收集上清液，测量体积为480ml，搅拌均匀，检测凝血酶效价为2600IU/ml；取上清液，加入甘氨酸120g与6％的白蛋白溶液1000ml，加入注射用水调整溶液的体积至4000ml，检测凝血酶效价为650IU/ml，在无菌条件下，用0.22μm滤膜过滤，灌装，冷冻干燥，100℃干热法病毒灭活30分钟，检验，包装，得催化剂冻干粉。2-8℃低温库保存。
实施例5催化剂冻干粉制备二
采集猪血液60000ml，加入含0.151mol/L枸橼酸钠、0.148mol/L氯化钠与0.138mol/L草酸钾的抗凝剂6000ml，于14℃低温库中静置6小时，让其分层，用虹吸法吸取上层血浆液，下层红细胞弃去；上层血浆液用5000转/分钟的转速10℃冷冻离心40分钟，收集血浆，用0.22μm滤膜过滤；取滤过血浆26000ml，依次加入聚山梨酯-80∶264.4g、磷酸三丁酯79.1g到血浆中，搅拌罐中25℃搅拌6小时，再加入硫酸钡540g，搅拌吸附2小时；用6000转/分钟的转速10℃冷冻离心30分钟，收集沉淀，得沉淀650g；取沉淀，加入1200ml的15％的氯化钠水溶液搅拌，用转速为5000转/分钟的离心机离心30min、离心温度为4℃，弃上清液，得沉淀。重复4次。取沉淀加入1500ml的20％的枸橼酸钠水溶液，搅拌30分钟，以5000转/分钟的离心机离心30分钟、离心温度为4℃，收集上清液。重复5次，合并上清液；取上清液，用0.22μm滤膜过滤；取滤液，分别加入400ml的36％氯化钙溶液和400ml的20％甘氨酸溶液，搅拌均匀，调pH值至7.0，以0.22μm滤膜过滤，滤液密封室温放置8小时，后转入4℃低温库中继续放置3天。超滤、脱盐、浓缩，得浓缩液2000ml，将浓缩液离心，以5000转/分钟的离心机离心30分钟、离心温度为4℃，收集上清液，测量体积为1950ml，搅拌均匀，检测凝血酶效价为1800IU/ml；取上清液，加入甘氨酸250g与6％的白蛋白溶液1500ml，加入注射用水调整溶液的体积至6000ml，检测凝血酶效价为580IU/ml，在无菌条件下，用0.22μm滤膜过滤，灌装，冷冻干燥，100℃干热法病毒灭活30分钟，检验，包装，得催化剂冻干粉。2-8℃低温库保存。
实施例6催化剂冻干粉制备三
采集猪血液55000ml，加入含0.147mol/L枸橼酸钠、0.146mol/L氯化钠与0.135mol/L草酸钾的抗凝剂5500ml，于12℃低温库中静置8小时，让其分层，用虹吸法吸取上层血浆液，下层红细胞弃去；上层血浆液用4000转/分钟的转速10℃冷冻离心50分钟，收集血浆，用0.22μm滤膜过滤；取滤过血浆25000ml，依次加入聚山梨酯-80∶254.3g、磷酸三丁酯76.0g到血浆中，搅拌罐中25℃搅拌6小时，再加入硫酸钡600g，搅拌吸附2小时；用5000转/分钟的转速10℃冷冻离心40分钟，收集沉淀，得沉淀700g；取沉淀，加入1500ml的10％的氯化钠水溶液搅拌，用转速为4000转/分钟的离心机离心30min、离心温度为4℃，弃上清液，得沉淀。重复3次。取沉淀加入1500ml的15％的枸橼酸钠水溶液，搅拌30分钟，以4000转/分钟的离心机离心30分钟、离心温度为4℃，收集上清液。重复4次，合并上清液；取上清液，用0.22μm滤膜过滤；取滤液，分别加入300ml的36％氯化钙溶液和300ml的20％甘氨酸溶液，搅拌均匀，调pH值至7.0，以0.22μm滤膜过滤，滤液密封室温放置8小时，后转入4℃低温库中继续放置2天。超滤、脱盐、浓缩，得浓缩液1200ml，将浓缩液离心，以4500转/分钟的离心机离心30分钟、离心温度为4℃，收集上清液，测量体积为1280ml，搅拌均匀，检测凝血酶效价为2200IU/ml；取上清液，加入甘氨酸180g与6％的白蛋白溶液1500ml，加入注射用水调整溶液的体积至6000ml，检测凝血酶效价为450IU/ml，在无菌条件下，用0.22μm滤膜过滤，灌装，冷冻干燥，100℃干热法病毒灭活30分钟，检验，包装，得催化剂冻干粉。2-8℃低温库保存。
实施例7主体胶溶解液与催化剂溶解液的制备一
称取醋酸钠40.8g和氯化钠64.3g，加入到10000ml注射用水中，搅拌至完全溶解，用醋酸调pH值至6.5，搅拌均匀，在无菌条件下，用0.22μm滤膜过滤，灌装，轧盖，灭茵，检验，包装，得主体胶溶解液。2-8℃低温库保存。
称取三羟甲基氨基甲烷61g和氯化钙66g，加入到10000ml注射用水中，搅拌至完全溶解，用盐酸调pH值至7.0，搅拌均匀，在无菌条件下，用0.22μm滤膜过滤，灌装，轧盖，灭茵，检验，包装，得催化剂溶解液。2-8℃低温库保存。
实施例8主体胶溶解液与催化剂溶解液的制备二
称取醋酸钠20.2g和氯化钠84.9g，加入到10000ml注射用水中，搅拌至完全溶解，用醋酸调pH值至7.0，搅拌均匀，在无菌条件下，用0.22μm滤膜过滤，灌装，轧盖，灭茵，检验，包装，得主体胶溶解液。2-8℃低温库保存。
称取三羟甲基氨基甲烷42g和氯化钙85g，加入到10000ml注射用水中，搅拌至完全溶解，用盐酸调pH值至7.0，搅拌均匀，在无菌条件下，用0.22μm滤膜过滤，灌装，轧盖，灭茵，检验，包装，得催化剂溶解液。2-8℃低温库保存。
实施例9主体胶溶解液与催化剂溶解液的制备三
称取醋酸钠62.5g和氯化钠48.3g，加入到10000ml注射用水中，搅拌至完全溶解，用醋酸调pH值至6.5，搅拌均匀，在无菌条件下，用0.22μm滤膜过滤，灌装，轧盖，灭茵，检验，包装，得主体胶溶解液。2-8℃低温库保存。
称取三羟甲基氨基甲烷72g和氯化钙57g，加入到10000ml注射用水中，搅拌至完全溶解，用盐酸调pH值至6.5，搅拌均匀，在无菌条件下，用0.22μm滤膜过滤，灌装，轧盖，灭茵，检验，包装，得催化剂溶解液。2-8℃低温库保存。
实施例10组合生物胶的涂层制备
业已发现，采用一种含纤维蛋白原与凝血酶的生物胶的成功涂敷，取决于所形成生物胶的质地、凝固时间等。因此，人们希望能够提供一种用于制备具有一定质地、凝固时间短的生物胶与涂敷方法，特别是对于制备适合于含纤维蛋白原与凝血酶涂敷的生物胶，从而得到一种用于治疗和密封伤口的医用止血材料。所形成的生物胶的作用与过程模拟血液凝固过程的最后一阶段，凝血酶断裂纤维蛋白原的(αA、βB)2链而释放酸性多肽A和B，使纤维蛋白原转化为纤维蛋白单体，各单体自发聚集成无桥键相连的多聚体；同时凝血酶激活XIII因子，激活的XIII因子在Ca2+的作用下催化各纤维蛋白单体间两条γ链的谷氨酰氨残基和赖氨酸的ε-氨基形成共价键，最终形成稳定的纤维蛋白多聚体。其呈一种十字交叉、多层、均匀的网状结构，能够网罗住红细胞及有形成份，同时为成纤维细胞及毛细血管的爬行及生长提供生物支架。
因此，所述生物胶的涂层制备的方法，可包括以下步骤：
实施例1的主体胶冻干粉溶于实施例7主体胶溶解液制成组份A1，实施例4的催化剂冻干粉溶于实施例7催化剂溶解液制成组份B1，制成组份A1和组份B1二种液体溶液，使用时分别吸入组份A1与组份B1到组合式推液支架(本公司的专利CN2553815Y产品)双腔推液器的无菌注射器内，通过双腔推液器的锥头均匀混合二种溶液，同时通过锥头的喷口喷涂到手术或出血创面，即形成一层半透明乳白色生物胶薄膜，起到封闭创面或止血止渗的作用，可以用于普通外科、骨科、心胸外科、神经外科、妇产科的组织止血、组织封口和组织粘合。生物胶薄膜的形成如图1所示。
实施例11本发明实施产品的物理效果效果检验
1.实施例1、实施例4与实施例7的物理效果测试：
(1).溶解时间测定：将实施例1的主体胶冻干粉溶解于实施例7主体胶溶解液制成组份A1，实施例4的催化剂冻干粉溶解于实施例7催化剂溶解液制成组份B1，溶解时间3分钟。
(2).凝固时间测定，取组份A1与组份B1分别吸入到组合式推液支架(本申请人的专利产品，公告号：CN2553815Y)双腔推液器的无菌注射器内，通过双腔推液器的锥头均匀混合二种溶液，同时喷涂到玻璃板面上，用秒表计时，凝固时间3-5秒。
(3).强度测定：在直径5.0cm，高0.5cm(表面积为19.6cm2)的无菌器皿内，加入组份A1和组份B1的溶液各2.5ml，36.5℃条件下，放置10分钟，将膜从皿中完整取出，形状为胶膜状，有弹性。绕屈180°无发生断裂现象。
2.实施例2、实施例5与实施例8的物理效果测试：
(1).溶解时间测定：将实施例2的主体胶冻干粉溶解于实施例8主体胶溶解液制成组份A2，实施例5的催化剂冻干粉溶解于实施例8催化剂溶解液制成组份B2，溶解时间2分钟。
(2).凝固时间测定，取组份A2与组份B2分别吸入到组合式推液支架(本申请人的专利产品，公告号：CN2553815Y)双腔推液器的无菌注射器内，通过双腔推液器的锥头均匀混合二种溶液，同时喷涂到玻璃板面上，用秒表计时，凝固时间2-4秒。
(3).强度测定：在直径5.0cm，高0.5cm(表面积为19.6cm2)的无菌器皿内，加入组份A2和组份B2的溶液各2.5ml，36.5℃条件下，放置10分钟，将膜从皿中完整取出，形状为胶膜状，有弹性。绕屈180°无发生断裂现象。
3.实施例3、实施例6与实施例9的物理效果测试：
(1).溶解时间测定：将实施例3的主体胶冻干粉溶解于实施例9主体胶溶解液制成组份A3，实施例6的催化剂冻干粉溶解于实施例9催化剂溶解液制成组份B3，溶解时间4分钟。
(2).凝固时间测定，取组份A3与组份B3分别吸入到组合式推液支架(本申请人的专利产品，公告号：CN2553815Y)双腔推液器的无菌注射器内，通过双腔推液器的锥头均匀混合二种溶液，同时喷涂到玻璃板面上，用秒表计时，凝固时间3-5秒。
(3).强度测定：在直径5.0cm，高0.5cm(表面积为19.6cm2)的无菌器皿内，加入组份A3和组份B3的溶液各2.5ml，36.5℃条件下，放置10分钟，将膜从皿中完整取出，形状为胶膜状，有弹性。绕屈180°无发生断裂现象。
Claims (8)
1.一种高效生物胶封闭剂，由主体胶冻干粉、催化剂冻干粉、主体胶溶解液和催化剂溶解液四个组分构成，其特征在于：
按重量百分比计算，所述的主体胶冻干粉含：纤维蛋白原和XIII因子33.3％-71.0％，氯化钠2.0-5.6％，枸椽酸钠2.0-5.6％，蔗糖20.2％-27.8％，组氨酸0.2％-5.6％，精氨酸0.2％-5.6％，聚山梨酯0.2％-2.8％，白蛋白4.2-14.0％；所述的催化剂冻干粉含：凝血酶450IU/ml-650IU/ml，甘氨酸20mg/ml-80mg/ml，白蛋白5mg/ml-30mg/ml；所述的主体胶溶解液含：醋酸钠1mg/ml-15mg/ml，氯化钠1mg/ml-15mg/ml；所述的催化剂溶解液含三羟甲基氨基甲烷3mg/ml-20mg/ml，盐酸3mg/ml-20mg/ml，氯化钙5mg/ml-30mg/ml。
2.根据权利要求1所述的高效生物胶封闭剂，其特征在于：所述的主体胶冻干粉、催化剂冻干粉是以猪血作为原材料制备的。
3.根据权利要求1所述的高效生物胶封闭剂，其特征在于所述主体胶冻干粉的制备方法包括如下步骤：
(1).以猪血液为原料，将猪血液于2℃-10℃低温库中静置，让其分层，用虹吸法吸取上层血浆液，下层红细胞弃去；上层血浆液用3000转/分钟-10000转/分钟的高速冷冻离心机离心30分钟-60分钟，收集血浆，用0.22μm滤膜过滤；取滤过血浆，每升加入甘氨酸1g-30g，使其溶解，将血浆降温至0～4℃，每升加入醋酸钠50g-250g，使其溶解，搅拌30分钟；用3000转/分钟-10000转/分钟的高速冷冻离心机离心，收集沉淀；
(2).取步骤(1)收集沉淀搅碎，加入由枸橼酸钠与三羟甲基氨基甲烷制成的pH值6.0-10.0的缓冲溶液，搅拌至完全溶解，过滤，测蛋白含量和溶解液体积；加入重量比为总蛋白量的0.1-12倍量的6-氨基已酸或组氨酸，搅拌至完全溶解，再用1.0μm与0.22μm的滤芯依次进行过滤，收集滤液并移入搅拌罐中，再加入由枸橼酸钠与三羟甲基氨基甲烷制成的缓冲溶液，调节pH值至5.0-9.0，每升加入聚山梨酯80为10.13g与磷酸三丁酯3.04g，搅拌均匀，25℃保温搅拌6小时；每升加入甘氨酸1g-30g，使其溶解，将血浆降温至0～4℃，每升加入醋酸钠50g-250g，使其溶解，搅拌30分钟；用3000转/分钟-10000转/分钟的高速冷冻离心机离心，收集沉淀，得主体胶第一次纯化物；
(3).取步骤(2)收集沉淀搅碎，加入由枸橼酸钠与三羟甲基氨基甲烷制成的pH值7.0-10.0的缓冲溶液，搅拌至完全溶解，过滤，测蛋白含量和溶解液体积；加入重量比为总蛋白量的0.1-12倍量的6-氨基己酸或组氨酸，搅拌至完全溶解，再每升加入甘氨酸1g-30g，使其溶解，将溶液降温至0～4℃，每升加入醋酸钠50g-250g，使其溶解，搅拌30分钟；用3000转/分钟-10000转/分钟的高速冷冻离心机离心，收集沉淀；用浓度为0.1％三羟甲基氨基甲烷以盐酸调pH值3.0～7.0的溶液，分次加入沉淀中，进行搅拌洗涤3-5次，收集沉淀，得主体胶第二次纯化物；
(4).取步骤(3)最后收集沉淀350g-600g，加注射用水8000ml在37℃水浴下溶解，过滤除去杂质，并检测蛋白含量，得主体胶原液；另取组氨酸1g-100g、枸橼酸钠10g-100g、蔗糖100g-500g、氯化钠10g-100g、聚山梨酯80∶0.1g-50g、精氨酸0.1g-100g加入到约1800ml注射用水中，搅拌使其完全溶解，再加入到主体胶原液中，搅拌均匀，然后再另加入200ml含2g-25g白蛋白的溶液，搅拌均匀，加注射用水调整至10000ml，加盐酸调节pH至5.0-8.0用0.22μm滤膜过滤，灌装，冷冻干燥，100℃干热法病毒灭活30分钟，检验，包装，得主体胶冻干粉。2-8℃低温库保存。
4.根据权利要求1所述的高效生物胶封闭剂，其特征在于所述催化剂冻干粉的制备方法包括如下步骤：
(1).以猪血液为原料，将猪血液于4℃-15℃低温库中静置，让其分层，用虹吸法吸取上层血浆液，下层红细胞弃去；上层血浆液用3000转/分钟-10000转/分钟的高速冷冻离心机离心30分钟-60分钟，收集血浆，用0.22μm滤膜过滤；取滤过血浆，每升依次加入聚山梨酯-80∶10.13g、磷酸三丁酯3.04g到血浆中，搅拌罐中25℃搅拌6小时，再每升加入硫酸钡5g-30g，搅拌吸附2小时；用3000转/分钟-10000转/分钟的高速冷冻离心机离心，收集沉淀；
(2).取步骤(1)收集沉淀，加入1-5倍量的9％-15％的氯化钠水溶液搅拌，用转速为2000转/分钟-5000转/分钟的离心机离心30min、离心温度为4℃，弃上清液，得沉淀；重复2-4次；取沉淀加入1-5倍量的10％-20％的枸橼酸钠水溶液，搅拌30分钟，以2000转/分钟-5000转/分钟的离心机离心30分钟、离心温度为4℃，收集上清液；重复3-5次，合并上清液；
(3).取步骤(2)上清液，用0.22μm滤膜过滤；取滤液，分别加入氯化钙溶液和甘氨酸溶液，使最后的溶液中氯化钙含量为1.8％、甘氨酸含量为1％，搅拌均匀，调pH值至4.5-8.0，以0.22μm滤膜过滤；滤液密封室温放置8h，后转入2～8℃低温库中继续放置2-3天；超滤、脱盐、浓缩，将浓缩液离心，以2000转/分钟-5000转/分钟的离心机离心30分钟、离心温度为4℃，收集上清液，测量体积，搅拌均匀，检测凝血酶效价；
(4).取步骤(3)最后的上清液，加入甘氨酸与白蛋白溶液，加入注射用水调整最后溶液的体积，使得最后溶液的凝血酶效价为450-650IU/ml、甘氨酸含量20mg/ml-80mg/ml、白蛋白含量5mg/ml-30mg/ml，在无菌条件下，用0.22μm滤膜过滤，灌装，冷冻干燥，100℃干热法病毒灭活30分钟，检验，包装，得催化剂冻干粉；2-8℃低温库保存。
5.根据权利要求1所述的高效生物胶封闭剂，其特征在于所述主体胶溶解液的制备方法包括：称取醋酸钠1g-15g和氯化钠1g-15g，加入到1000ml注射用水中，搅拌至完全溶解，用醋酸调pH值至3.5～7.0，搅拌均匀，在无菌条件下，用0.22μm滤膜过滤，灌装，轧盖，灭茵，检验，包装，得主体胶溶解液；2-8℃低温库保存。
6.根据权利要求1所述的高效生物胶封闭剂，其特征在于所述催化剂溶解液的制备方法包括：称三羟甲基氨基甲烷3g-20g和氯化钙5g-30g，加入到1000ml注射用水中，搅拌至完全溶解，用盐酸调pH值至5.0-8.0，搅拌均匀，在无菌条件下，用0.22μm滤膜过滤，灌装，轧盖，灭茵，检验，包装，得催化剂溶解液；2-8℃低温库保存。
7.权利要求1所述的高效生物胶封闭剂的应用，其中所述的主体胶冻干粉溶于主体胶溶解液制成组份A，催化剂冻干粉溶于催化剂溶解液制成组份B，使用时分别吸入组份A与组份B到双腔推液器的无菌注射器内，通过双腔推液器的锥头均匀混合二种溶液，同时喷涂到手术或出血创面，形成一层半透明乳白色薄膜。
8.根据权利要求6所述的高效生物胶封闭剂的应用，其中所述的组份A和组份B为液体，使用时二种溶液均匀混合，应用于普通外科、骨科、心胸外科、神经外科、妇产科的组织止血、组织封口和组织粘合。
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