CN107827974A - 一种人纤维蛋白原的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种人纤维蛋白原的制备方法，包括如下步骤：(1)将人血浆低温乙醇沉淀组分I溶解于提取液中，得到组分I溶液；(2)对步骤(1)得到的组分I溶液进行S/D灭活；(3)将赖氨酸亲和层析介质用平衡液平衡，然后对步骤(2)得到的溶液进行柱层析，收集穿透峰；(4)将阳离子交换层析介质用平衡液平衡，然后对步骤(3)得到的穿透峰进行柱层析，层析结束后用淋洗液淋洗层析柱，最后用洗脱液洗脱，收集洗脱峰，得到人纤维蛋白原。本发明提供的方法操作简单，能够有效去除纤溶酶原，得到的人纤维蛋白原制品具有较高的纯度和稳定性。

Description

一种人纤维蛋白原的制备方法
技术领域
本发明属于生物制药技术领域，具体涉及一种人纤维蛋白原的制备方法。
背景技术
人纤维蛋白原是由肝脏合成的一种凝血因子，在血浆中含量约为2-4g/L，最重要的生理功能是参与凝血过程。人纤维蛋白原是一种纤维状蛋白，具有对称的二聚体结构，两个单体氨基酸形成中心E结构域，羧基端形成两个膨大的末端D结构域。在凝血酶的作用下，人纤维蛋白原E、D结构域活化，暴露出结合位点。每个E结构域与2个相邻人纤维蛋白原的D结构结合，最终形成网状结构，实现凝血功能。
目前人纤维蛋白原的生产主要采用低温乙醇法(CN 102286095A)，以血浆为原料，共经过3-4次乙醇沉淀得到人纤维蛋白原。该方法主要的缺陷为制品外观较差，纯度低，质量稳定性差。
也有报道采用层析法制备人纤维蛋白原，如CN 101703763A采用DEAE-650M凝胶层析柱对S/D灭活的血浆提取液进行分离。但是该层析方法是流穿的方法，即杂蛋白被吸附，人纤维蛋白原流出，因此仍然需要一步或多步沉淀以除去S/D试剂。而且，层析介质有一定的特异性，不能保证所有杂蛋白都被吸附去除，导致产品的纯度较低。
另外，人血浆中含有纤溶酶原，上述低温乙醇沉淀法和层析法均难以将其有效除去。纤溶酶原能与纤维蛋白特异性结合，在临床使用中可以将其与溶栓药物结合，使药物特异性地作用于血栓位点，减少药物副作用，其本身具有良好的应用价值。但是纤溶酶原在纤维蛋白降解过程中也起到重要作用，其残留在纤维蛋白原制品中，则会导致产品稳定性下降。
如果在制备人纤维蛋白原的同时，能够将纤溶酶原分离出来，则不仅可以提高人纤维蛋白原制品的稳定性，还可获得纤溶酶原制品，提高血浆原料的利用率。
发明内容
针对现有技术存在的不足，本发明的目的在于提供一种人纤维蛋白原的制备方法，该方法操作简单，能够有效去除纤溶酶原，得到高纯度、稳定性好的人纤维蛋白原制品。
为达此目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供一种人纤维蛋白原的制备方法，包括如下步骤：
(1)将人血浆低温乙醇沉淀组分I溶解于提取液中，得到组分I溶液；
(2)对步骤(1)得到的组分I溶液进行S/D灭活；
(3)将赖氨酸亲和层析介质用平衡液平衡，然后对步骤(2)得到的溶液进行柱层析，收集穿透峰；
(4)将阳离子交换层析介质用平衡液平衡，然后对步骤(3)得到的穿透峰进行柱层析，层析结束后用淋洗液淋洗层析柱，最后用洗脱液洗脱，收集洗脱峰，得到人纤维蛋白原溶液。
赖氨酸亲和层析介质对纤溶酶原具有较强的吸附力，对人纤维蛋白原则不吸附，阳离子交换层析介质主要吸附人纤维蛋白原。本发明采用赖氨酸亲和层析可以有效去除纤溶酶原，采用阳离子交换层析在提高人纤维蛋白原纯度的同时去除S/D试剂，简化工艺流程。
第二方面，本发明提供一种从人血浆低温乙醇沉淀组分I中去除纤溶酶原的方法，包括如下步骤：
(1)将人血浆低温乙醇沉淀组分I溶解于提取液中，得到组分I溶液；
(2)对步骤(1)得到的组分I溶液进行S/D灭活；
(3)将赖氨酸亲和层析介质用平衡液平衡，然后对步骤(2)得到的溶液进行柱层析，收集穿透峰。
优选地，所述去除纤溶酶原的方法还包括步骤(4)：将阳离子交换层析介质用平衡液平衡，然后对步骤(3)得到的穿透峰进行柱层析，层析结束后用淋洗液淋洗层析柱，最后用洗脱液洗脱，收集洗脱峰，得到人纤维蛋白原溶液。
上述步骤(1)中所述人血浆低温乙醇沉淀组分I是指用低温乙醇对人血浆进行一次沉淀的产物，具体的操作步骤如下：
将人血浆冻融，在10000rpm的转速下离心30min，用8层纱布过滤，上清液用冰水浴降温至0-1℃，然后用0.5M柠檬酸调节pH值至6.8-7.2，最后加-20℃以下的50％酒精至终浓度为8％，控制温度在-1～-3℃，离心得沉淀组分I。
上述步骤(3)中的穿透峰为在层析过程中开始出现目标蛋白至目标蛋白消失阶段流出的穿透液，可以通过监测穿透液在280nm处的紫外吸收来判断是否有蛋白流出，当穿透液在280nm处的紫外吸收降回基线水平时停止收集。
作为本发明的优选技术方案，步骤(1)中所述提取液为包含10-20g/L(例如10g/L、12g/L、13g/L、15g/L、16g/L、18g/L或20g/L等)柠檬酸三钠、10-20g/L(例如10g/L、12g/L、13g/L、15g/L、16g/L、18g/L或20g/L等)蔗糖、1.0-2.0g/L(例如1.0g/L、1.2g/L、1.3g/L、1.5g/L、1.6g/L、1.8g/L或2.0g/L等)三羟甲基氨基甲烷(Tris)、5-10g/L(例如5g/L、6g/L、7g/L、8g/L、9g/L或10g/L等)氯化钠以及盐酸的水溶液，pH为6.5-7.5(例如6.5、6.8、7.0、7.2、7.4或7.5等)。
优选地，所述组分I与提取液的质量体积比为3.5-10g/L；例如可以是3.5g/L、4g/L、4.5g/L、5g/L、6g/L、7g/L、8g/L、9g/L或10g/L等。
作为本发明的优选技术方案，步骤(1)中所述溶解的温度为20-25℃；例如可以是20℃、21℃、22℃、23℃、24℃或25℃。
优选地，步骤(1)中所述溶解是在搅拌下进行。
优选地，所述搅拌的时间为1-1.5h；例如可以是1h、1.1h、1.2h、1.3h、1.4h或1.5h等。
作为本发明的优选技术方案，步骤(2)中所述S/D灭活的操作为：将步骤(1)得到的组分I溶液与S/D溶液混合，在24-26℃(例如24℃、24.5℃、25℃、25.5℃或26℃等)下搅拌4-6h(例如4h、4.5h、5h、5.5h或6h等)。
优选地，所述S/D溶液为包含90-120g/L(例如90g/L、95g/L、100g/L、105g/L、110g/L、115g/L或120g/L等)聚山梨酯80和30-35g/L(例如30g/L、31g/L、32g/L、33g/L、34g/L或35g/L等)磷酸三丁酯的水溶液。
优选地，所述组分I溶液与S/D溶液的体积比为1:8-12；例如可以是1:8、1:9、1:10、1:11或1:12等。
作为本发明的优选技术方案，步骤(3)中所述赖氨酸亲和层析介质是以赖氨酸为配基的凝胶，优选为以赖氨酸为配基的琼脂糖凝胶。
优选地，步骤(3)中所述平衡液为磷酸盐缓冲液。
优选地，所述磷酸盐缓冲液的浓度为20-50mM(例如20mM、25mM、30mM、35mM、40mM、45mM或50mM等)，pH＝6.5-7.5(例如6.5、6.8、7.0、7.2、7.4或7.5等)。
作为本发明的优选技术方案，步骤(3)还包括如下操作：在收集穿透峰之后，用淋洗液淋洗层析柱，然后用洗脱液洗脱，收集洗脱峰(纤溶酶原溶液)。
优选地，所述淋洗液为含0.5-1M(例如0.5M、0.6M、0.7M、0.8M、0.9M或1M等)氯化钠的磷酸盐缓冲液。
优选地，所述淋洗液的用量为3-5倍柱体积。
优选地，所述洗脱液为含0.1-0.3M(例如0.1M、0.15M、0.2M、0.25M或0.3M等)氨基己酸的磷酸盐缓冲液；
优选地，所述洗脱液的用量为2-4倍柱体积。
作为本发明的优选技术方案，步骤(4)中所述阳离子交换层析介质的孔径为15-80nm(例如15nm、20nm、30nm、40nm、50nm、60nm、70nm或80nm等)，间隔臂为包含3-12个(例如3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个或12个等)碳原子的烷基链。
本发明通过选择发现孔径为15-80nm且间隔臂为包含3-12个碳原子的烷基链的阳离子交换层析介质对人纤维蛋白原具有较强的吸附力，可以实现对人纤维蛋白原的高效分离。其他阳离子交换层析介质则会因吸附力不足，导致得到的人纤维蛋白原纯度较低，甚至难以分离。
优选地，所述阳离子交换层析介质为磺丙基琼脂糖快流速介质(SP SepharoseFast Flow)、羧酸基琼脂糖快流速介质(CM Sepharose Fast Flow)、磺丙基琼脂糖高载量介质(SP Sepharose XL)或磺酸基触角型介质( EMD SO3 -)。
作为本发明的优选技术方案，步骤(4)中所述平衡液和淋洗液为磷酸盐缓冲液；
优选地，所述磷酸盐缓冲液的浓度为20-50mM(例如20mM、25mM、30mM、35mM、40mM、45mM或50mM等)，pH＝6.5-7.5(例如6.5、6.8、7.0、7.2、7.4或7.5等)。
优选地，步骤(4)中所述淋洗液的用量为3-5倍柱体积。
优选地，步骤(4)中所述洗脱液为含0.1-0.5M(例如0.5M、0.6M、0.7M、0.8M、0.9M或1M等)氯化钠的磷酸盐缓冲液。
优选地，步骤(4)中所述洗脱液的用量为2-5倍柱体积。
作为本发明的优选技术方案，步骤(4)中，在收集洗脱峰之后还进行如下操作：将所述洗脱峰超滤浓缩，使蛋白浓度达到10-30g/L(例如10g/L、12g/L、15g/L、18g/L、20g/L、22g/L、25g/L、28g/L或30g/L等)。
优选地，在步骤(4)之后还进行如下操作：将人纤维蛋白原溶液除菌分装、冻干和干热灭活。
优选地，所述干热灭活的温度为100-110℃，例如可以是100℃、101℃、102℃、103℃、104℃、105℃、106℃、107℃、108℃、109℃或110℃等；时间为20-40min，例如可以是20min、22min、23min、25min、26min、28min、30min、32min、33min、35min、36min、38min或40min等。
作为本发明的优选技术方案，所述制备方法包括如下步骤：
(1)按质量体积比为3.5-10g/L，将人血浆低温乙醇沉淀组分I加入提取液中，在20-25℃下搅拌溶解1-1.5h，得到组分I溶液；
(2)将步骤(1)得到的组分I溶液与S/D溶液按体积比1:10混合，在24-26℃下搅拌4-6h；
(3)将赖氨酸亲和层析介质用磷酸盐缓冲液平衡，对步骤(2)得到的溶液进行柱层析，收集穿透峰；然后用3-5倍柱体积的含0.5-1M氯化钠的磷酸盐缓冲液淋洗层析柱，之后用2-4倍柱体积的含0.1-0.3M氨基己酸的磷酸盐缓冲液洗脱，收集洗脱峰；
(4)将阳离子交换层析介质用磷酸盐缓冲液平衡，对步骤(3)得到的穿透峰进行柱层析，层析结束后用3-5倍柱体积的磷酸盐缓冲液淋洗层析柱，然后用2-5倍柱体积的含0.1-0.5M氯化钠的磷酸盐缓冲液洗脱，收集洗脱峰，经超滤浓缩，使蛋白浓度达到10-30g/L，得到人纤维蛋白原溶液；
(5)将步骤(4)得到的人纤维蛋白原溶液除菌分装、冻干，然后在100-110℃下干热灭活20-40min。
第三方面，本发明提供一种人纤维蛋白原在制备治疗先天性或获得性纤维蛋白原缺乏症、肝硬化、止血和伤口愈合药物中的应用。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明采用组合柱层析技术从人血浆低温乙醇沉淀组分I中纯化制备人纤维蛋白原，同时获得高纯度的纤溶酶原，提高了组分I的利用率。赖氨酸亲和层析可以特异性吸附纤溶酶原，实验结果表明，赖氨酸亲和层析洗脱峰采用电泳检测为单一条带，且分子量与纤溶酶原标准品一致，同时利用纤溶酶原试剂盒检测得到该洗脱峰中纤溶酶原纯度>95％。而且去除纤溶酶原可以进一步保证人纤维蛋白原制品的凝胶稳定性，避免纤溶酶抑制剂的使用。阳离子交换层析在提高人纤维蛋白原纯度的同时完成缓冲液置换，可有效去除S/D试剂。
利用本发明提供的方法制备的人纤维蛋白原的pH为6.5-6.6，纯度为85-90％，凝固活力30-40s，磷酸三丁酯的残留量2.5-5.0μg/mL，聚山梨酯80残留量10-20μg/mL，符合《中国药典》2015版的相关要求。
附图说明
图1为本发明实施例中制备人纤维蛋白原的工艺流程图。
图2为实施例1中赖氨酸亲和层析洗脱峰与纤溶酶原标准品的聚丙烯酰胺凝胶电泳图；
其中，A为赖氨酸亲和层析洗脱峰的电泳条带，B为纤溶酶原标准品的电泳条带。
图3为实施例1中阳离子交换层析洗脱峰的高效凝胶过滤色谱图。
图4为人纤维蛋白原标准品的高效凝胶过滤色谱图。
具体实施方式
下面结合附图并通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述具体实施方式仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。
下述实施例1-4和对比例1中所用层析介质来源如下：
赖氨酸亲和层析介质：GE公司的Lysine Sepharose 4B；
阳离子交换层析介质：GE(通用电气)公司的SP Sepharose Fast Flow(粒径90μm，孔径18nm，间隔臂为3个碳原子的烷基链)、GE公司的CM Sepharose Fast Flow(粒径90μm，孔径18nm，间隔臂为3个碳原子的烷基链)、GE公司的SP Sepharose XL(粒径90μm，孔径20nm，间隔臂为6个碳原子的烷基链)、GE公司的Capto S(粒径90μm，孔径7nm，间隔臂含1个碳原子)和Merck(默克)公司的 EMD SO3 -(粒径40-90μm，孔径80nm，间隔臂为3个碳原子的烷基链)。
实施例1
一种人纤维蛋白原的制备方法，包括如下步骤：
(1)组分I溶解：将人血浆低温乙醇沉淀组分I粉碎，以质量体积比10g/L加入提取液中，在20℃下搅拌溶解1.5h，得到组分I溶液；
其中提取液为：含17.8g/L柠檬酸三钠、11g/L蔗糖、1.3g/L Tris、8.5g/L NaCl的注射用水溶液，且用HCl调整pH为7.5；
(2)S/D灭活：将步骤(1)得到的组分I溶液与S/D溶液按体积比1:10混合，在25℃下搅拌6h；
其中S/D溶液包含110g/L的聚山梨酯80与33g/L的磷酸三丁酯；
(3)赖氨酸亲和层析：将赖氨酸亲和层析介质Lysine Sepharose 4B凝胶用20mM，pH7.5的磷酸盐缓冲液平衡，再将步骤(2)中得到的溶液上柱进行层析，收集穿透液直至280nm处的紫外吸收降回基线水平(穿透峰)，然后用3倍柱体积的含0.5M NaCl的磷酸盐缓冲液淋洗层析柱，之后用3倍柱体积的含0.2M氨基己酸的磷酸盐缓冲液洗脱，收集洗脱峰(纤溶酶原溶液)；
对赖氨酸亲和层析洗脱峰和纤溶酶原标准品进行聚丙烯酰胺凝胶电泳测试，结果如图2所示，结果显示二者的迁移距离基本相同，证实步骤(3)得到的洗脱峰为纤溶酶原溶液；用纤溶酶原试剂盒检测得到其纯度为96％；
(4)阳离子交换层析：将阳离子交换层析介质CM Sepharose Fast Flow用20mM，pH7.5的磷酸盐缓冲液平衡，再将步骤(3)得到的穿透峰上柱进行层析，层析结束后用5倍柱体积的20mM，pH7.5的磷酸盐缓冲液淋洗层析柱，然后用4倍柱体积的含0.25M NaCl的磷酸盐缓冲液洗脱，收集洗脱峰；
(5)浓缩：将步骤(4)得到的洗脱峰超滤浓缩，使最终蛋白浓度为25g/L；
用高效凝胶过滤色谱对阳离子交换层析洗脱峰和人纤维蛋白原标准品进行检测，结果分别如图3和图4所示，结果显示二者的色谱图基本相同，证实步骤(4)得到的洗脱峰为人纤维蛋白原的溶液；
(6)除菌分装、冻干：将步骤(5)得到的人纤维蛋白原溶液除菌分装于50mL玻璃瓶中，25mL/瓶，而后冻干；
(7)干热灭活：将步骤(6)中得到的冻干后制品置于沸水浴中，100℃保温30min，进行干热灭活。
实施例2
一种人纤维蛋白原的制备方法，包括如下步骤：
(1)组分I溶解：将人血浆低温乙醇沉淀组分I粉碎，以质量体积比6g/L加入提取液中，在24℃下搅拌溶解1h，得到组分I溶液；
其中提取液为：含15g/L柠檬酸三钠、15g/L蔗糖、1.5g/L Tris、8g/L NaCl的注射用水溶液，且用HCl调整pH为7.5；
(2)S/D灭活：将步骤(1)得到的组分I溶液与S/D溶液按体积比1:8混合，在24℃下搅拌5h；
其中S/D溶液包含110g/L的聚山梨酯80与33g/L的磷酸三丁酯；
(3)赖氨酸亲和层析：将赖氨酸亲和层析介质Lysine Sepharose 4B凝胶用50mM，pH7.2的磷酸盐缓冲液平衡，再将步骤(2)中得到的溶液上柱进行层析，收集穿透液直至280nm处的紫外吸收降回基线水平(穿透峰)，然后用3倍柱体积的含0.8M NaCl的磷酸盐缓冲液淋洗层析柱，之后用4倍柱体积的含0.1M氨基己酸的磷酸盐缓冲液洗脱，收集洗脱峰(纤溶酶原溶液，纯度96％)；
(4)阳离子交换层析：将阳离子交换层析介质SP Sepharose Fast Flow用50mM，pH7.2的磷酸盐缓冲液平衡，再将步骤(3)得到的穿透峰上柱进行层析，层析结束后用3倍柱体积的50mM，pH7.2的磷酸盐缓冲液淋洗层析柱，然后用5倍柱体积的含0.2M NaCl的磷酸盐缓冲液洗脱，收集洗脱峰；
(5)浓缩：将步骤(4)得到的洗脱峰超滤浓缩，使最终蛋白浓度为25g/L；
(6)除菌分装、冻干：将步骤(5)得到的人纤维蛋白原溶液除菌分装于50mL玻璃瓶中，25mL/瓶，然后冻干；
(7)干热灭活：将步骤(6)中得到的冻干后制品置于沸水浴中，110℃保温20min，进行干热灭活。
实施例3
一种人纤维蛋白原的制备方法，包括如下步骤：
(1)组分I溶解：将人血浆低温乙醇沉淀组分I粉碎，以质量体积比3.5g/L加入提取液中，在25℃下搅拌溶解1.5h，得到组分I溶液；
其中提取液为：含20g/L柠檬酸三钠、10g/L蔗糖、2g/L Tris、5g/L NaCl的注射用水溶液，且用HCl调整pH为6.9；
(2)S/D灭活：将步骤(1)得到的组分I溶液与S/D溶液按体积比1:9混合，在26℃下搅拌4h；
其中S/D溶液包含110g/L的聚山梨酯80与33g/L的磷酸三丁酯；
(3)赖氨酸亲和层析：将赖氨酸亲和层析介质Lysine Sepharose 4B凝胶用50mM，pH6.5的磷酸盐缓冲液平衡，再将步骤(2)中得到的溶液上柱进行层析，收集穿透液直至280nm处的紫外吸收降回基线水平(穿透峰)，然后用3倍柱体积的含1M NaCl的磷酸盐缓冲液淋洗层析柱，之后用2倍柱体积的含0.3M氨基己酸的磷酸盐缓冲液洗脱，收集洗脱峰(纤溶酶原溶液，纯度97％)；
(4)阳离子交换层析：将阳离子交换层析介质 EMD SO3 -用50mM，pH6.5的磷酸盐缓冲液平衡，再将步骤(3)得到的穿透峰上柱进行层析，层析结束后用5倍柱体积的50mM，pH6.5的磷酸盐缓冲液淋洗层析柱，然后用3倍柱体积的含0.2M NaCl的磷酸盐缓冲液洗脱，收集洗脱峰；
(5)浓缩：将步骤(4)得到的洗脱峰超滤浓缩，使最终蛋白浓度为25g/L；
(6)除菌分装、冻干：将步骤(5)得到的人纤维蛋白原溶液除菌分装于50mL玻璃瓶中，25mL/瓶，然后冻干；
(7)干热灭活：将步骤(6)中得到的冻干后制品置于沸水浴中，100℃保温40min，进行干热灭活。
实施例4
一种人纤维蛋白原的制备方法，包括如下步骤：
(1)组分I溶解：将人血浆低温乙醇沉淀组分I粉碎，以质量体积比5g/L加入提取液中，在23℃下搅拌溶解1.5h，得到组分I溶液；
其中提取液为：含13g/L柠檬酸三钠、18g/L蔗糖、1.6g/L Tris、10g/L NaCl的注射用水溶液，且用HCl调整pH为6.5；
(2)S/D灭活：将步骤(1)得到的组分I溶液与S/D溶液按体积比1:12混合，在25℃下搅拌4h；
其中S/D溶液包含110g/L的聚山梨酯80与33g/L的磷酸三丁酯；
(3)赖氨酸亲和层析：将赖氨酸亲和层析介质Lysine Sepharose 4B凝胶用20mM，pH7.4的磷酸盐缓冲液平衡，再将步骤(2)中得到的溶液上柱进行层析，收集穿透液直至280nm处的紫外吸收降回基线水平(穿透峰)，然后用5倍柱体积的含0.6M NaCl的磷酸盐缓冲液淋洗层析柱，之后用2倍柱体积的含0.3M氨基己酸的磷酸盐缓冲液洗脱，收集洗脱峰(纤溶酶原溶液，纯度97％)；
(4)阳离子交换层析：将阳离子交换层析介质SP Sepharose XL用20mM，pH7.4的磷酸盐缓冲液平衡，再将步骤(3)得到的穿透峰上柱进行层析，层析结束后用3倍柱体积的20mM，pH7.4的磷酸盐缓冲液淋洗层析柱，然后用5倍柱体积的含0.1M NaCl的磷酸盐缓冲液洗脱，收集洗脱峰；
(5)浓缩：将步骤(4)得到的洗脱峰超滤浓缩，使最终蛋白浓度为25g/L；
(6)除菌分装、冻干：将步骤(5)得到的人纤维蛋白原溶液除菌分装于50mL玻璃瓶中，25mL/瓶，然后冻干；
(7)干热灭活：将步骤(6)中得到的冻干后制品置于沸水浴中，100℃保温30min，进行干热灭活。
对比例1
一种人纤维蛋白原的制备方法，与实施例1的区别仅在于，阳离子交换层析介质是Capto S。
按照《中国药典》2015版，对上述实施例1-4和对比例1制备的人纤维蛋白原进行检测，结果如下表1所示。
表1
申请人声明，以上所述仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，所属技术领域的技术人员应该明了，任何属于本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

Claims (10)

1.一种人纤维蛋白原的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)将人血浆低温乙醇沉淀组分I溶解于提取液中，得到组分I溶液；
(2)对步骤(1)得到的组分I溶液进行S/D灭活；
(3)将赖氨酸亲和层析介质用平衡液平衡，然后对步骤(2)得到的溶液进行柱层析，收集穿透峰；
(4)将阳离子交换层析介质用平衡液平衡，然后对步骤(3)得到的穿透峰进行柱层析，层析结束后用淋洗液淋洗层析柱，最后用洗脱液洗脱，收集洗脱峰，得到人纤维蛋白原溶液。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中所述提取液为包含10-20g/L柠檬酸三钠、10-20g/L蔗糖、1.0-2.0g/L三羟甲基氨基甲烷、5-10g/L氯化钠以及盐酸的水溶液，pH为6.5-7.5；
优选地，所述组分I与提取液的质量体积比为3.5-10g/L。
3.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中所述溶解的温度为20-25℃；
优选地，步骤(1)中所述溶解是在搅拌下进行；
优选地，所述搅拌的时间为1-1.5h。
4.根据权利要求1或3所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中所述S/D灭活的操作为：将步骤(1)得到的组分I溶液与S/D溶液混合，在24-26℃下搅拌4-6h；
优选地，所述S/D溶液为包含90-120g/L聚山梨酯80和30-35g/L磷酸三丁酯的水溶液；
优选地，所述组分I溶液与S/D溶液的体积比为1:8-12。
5.根据权利要求1-4任一项所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)中所述赖氨酸亲和层析介质是以赖氨酸为配基的凝胶，优选为以赖氨酸为配基的琼脂糖凝胶；
优选地，步骤(3)中所述平衡液为磷酸盐缓冲液；
优选地，所述磷酸盐缓冲液的浓度为20-50mM，pH＝6.5-7.5。
6.根据权利要求1-5任一项所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)还包括如下操作：在收集穿透峰之后，用淋洗液淋洗层析柱，然后用洗脱液洗脱，收集洗脱峰；
优选地，所述淋洗液为含0.5-1M氯化钠的磷酸盐缓冲液；
优选地，所述淋洗液的用量为3-5倍柱体积；
优选地，所述洗脱液为含0.1-0.3M氨基己酸的磷酸盐缓冲液；
优选地，所述洗脱液的用量为2-4倍柱体积。
7.根据权利要求1-6任一项所述的制备方法，其特征在于，步骤(4)中所述阳离子交换层析介质的孔径为15-80nm，间隔臂为包含3-12个碳原子的烷基链；
优选地，所述阳离子交换层析介质为磺丙基琼脂糖快流速介质、羧酸基琼脂糖快流速介质、磺丙基琼脂糖高载量介质或磺酸基触角型介质。
8.根据权利要求1-7任一项所述的制备方法，其特征在于，步骤(4)中所述平衡液和淋洗液为磷酸盐缓冲液；
优选地，所述磷酸盐缓冲液的浓度为20-50mM，pH＝6.5-7.5；
优选地，步骤(4)中所述淋洗液的用量为3-5倍柱体积；
优选地，步骤(4)中所述洗脱液为含0.1-0.5M氯化钠的磷酸盐缓冲液；
优选地，步骤(4)中所述洗脱液的用量为2-5倍柱体积。
9.根据权利要求1-8任一项所述的制备方法，其特征在于，步骤(4)中，在收集洗脱峰之后还进行如下操作：将所述洗脱峰超滤浓缩，使蛋白浓度达到10-30g/L；
优选地，在步骤(4)之后还进行如下操作：将人纤维蛋白原溶液除菌分装、冻干和干热灭活；
优选地，所述干热灭活的温度为100-110℃，时间为20-40min。
10.根据权利要求1-9任一项所述的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括如下步骤：
(1)按质量体积比为3.5-10g/L，将人血浆低温乙醇沉淀组分I加入提取液中，在20-25℃下搅拌溶解1-1.5h，得到组分I溶液；
(2)将步骤(1)得到的组分I溶液与S/D溶液按体积比1:10混合，在24-26℃下搅拌4-6h；
(3)将赖氨酸亲和层析介质用磷酸盐缓冲液平衡，对步骤(2)得到的溶液进行柱层析，收集穿透峰；然后用3-5倍柱体积的含0.5-1M氯化钠的磷酸盐缓冲液淋洗层析柱，之后用2-4倍柱体积的含0.1-0.3M氨基己酸的磷酸盐缓冲液洗脱，收集洗脱峰；
(4)将阳离子交换层析介质用磷酸盐缓冲液平衡，对步骤(3)得到的穿透峰进行柱层析，层析结束后用3-5倍柱体积的磷酸盐缓冲液淋洗层析柱，然后用2-5倍柱体积的含0.1-0.5M氯化钠的磷酸盐缓冲液洗脱，收集洗脱峰，经超滤浓缩，使蛋白浓度达到10-30g/L，得到人纤维蛋白原溶液；
(5)将步骤(4)得到的人纤维蛋白原溶液除菌分装、冻干，然后在100-110℃下干热灭活20-40min。
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