CN105669858A - 一种从血浆Cohn法组分IV沉淀中提取抗凝血酶III和多种功能蛋白的方法 - Google Patents

一种从血浆Cohn法组分IV沉淀中提取抗凝血酶III和多种功能蛋白的方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种从Cohn法组分IV沉淀中提取抗凝血酶III的方法，该方法能提取出纯度近100％的AT-III，并且比活和收率与现有方法相比都显著提高。此外，本发明还提供一种从Cohn法组分IV沉淀中综合提取利用α1-抗胰蛋白酶、抗凝血酶III以及白蛋白的方法，在一条工艺路线上同时实现3种产品的分离提取，可有效降低α1-抗胰蛋白酶和抗凝血酶III的生产成本，并可实现大规模工业化生产。本发明的方法能显著提高血浆综合利用效率，具有较强的应用价值。

Description

一种从血浆Cohn法组分IV沉淀中提取抗凝血酶III和多种功能蛋白的方法
技术领域
本发明属于血液制品领域，涉及血浆的综合利用，尤其涉及从制备人血白蛋白的废弃物中回收制备抗凝血酶III以及多种功能蛋白的方法。
背景技术
血液蛋白制品由健康人的血液、血浆或特异免疫人血浆分离提纯制成的有明确临床应用意义的血浆蛋白组分或血细胞组分制品，如人血白蛋白、人免疫球蛋白、人凝血因子(天然或重组的)、红细胞浓缩物等，用于诊断、治疗或被动免疫预防，在临床上发挥着重要作用。
血浆蛋白的分离纯化，根据各种血浆蛋白的理化性质或生物特性的不同对其进行分离。目前采用的方法有低温乙醇法、层析法、盐析法、利凡诺沉淀法、聚乙二醇沉淀法和热乙醇法等等。其中低温乙醇法又称Cohn法，是由E.J.Cohn等发明的采用冷乙醇分离人血浆蛋白的方法，包括一系列改进。这些方法目前仍被国内外血液制品企业广泛采用。例如，美国、日本主要是用Cohn6+9法(Cohn-Oncley法)，而西欧国家则使用Nitschmann和Kistler法(简称N-K法)。我国的生产单位根据各自情况分别采用这两种方法。
Cohn法采用一系列不同浓度的乙醇对人血浆进行分级沉淀，富集和分离目标产品。以经典的N-K法为例，可把血浆蛋白分级为I–V的组分，其中分别制备成人血白蛋白(组分V)、凝血因子(组分I)和人免疫球蛋白(组分II+III)，组分IV则被当成废弃物。
表1.N-K法分离血浆蛋白的组分
Cohn组分IV沉淀(CohnFIV)作为低温乙醇法中的废弃组分，其中含有多种具有药用价值的血浆蛋白。沉淀中的主要蛋白成分(见表1)为白蛋白和一些血浆中含量较少的微量蛋白，如运铁蛋白、AT-III(抗凝血酶III)、α1-AT(α1-抗胰蛋白酶)和结合珠蛋白等。这些蛋白中间，目前具有实际临床应用价值的蛋白主要是AT-III和α1-AT，其他几种微量蛋白在成药性方面目前还处于研究阶段。国外已有多种AT-III和α1-AT制品上市，而国内目前还没有AT-III和α1-AT制品进入市场，特别是在现在血浆蛋白产品市场供应短缺的情况下，从Cohn法组分IV沉淀中回收这些功能蛋白具有重要意义。
目前已有大量从Cohn法组分IV沉淀中回收单一功能蛋白的报道。例如，吴强等公开了一种从Cohn法组分IV沉淀中制备AT-III的方法，采用PEG沉淀加两步肝素亲和层析，获得的AT-III比活为6.9IU/mg，参见专利201210544111.X。采用这种方式制备AT-III在规模化生产时需要大量的PEG和肝素亲和凝胶，其最大的缺点就是制备成本较高。胡吉军等人公开了采用一步肝素亲和层析法从Cohn法组分IV沉淀中制备AT-III的专利，参见专利200310030446.4。这种方法虽然成本较小，但是制备的AT-III比活度不高，纯度也难达到100％。从组分IV沉淀中回收各种功能蛋白，在投浆量较小的情况下，如何既能有效的降低投入产出比，又能得到质量属性相对较高的产品是目前国内血液制品行业面临的一个难题，现有制备AT-III的主流工艺基本都采用PEG沉淀加肝素亲和层析或两步肝素亲和层析，且都是一种单一制品的制备模式，这些方式要么成本较高，要么质量标准不高。
另外，叶生亮等公开了一种从Cohn法组分IV沉淀中分离纯化α1-AT制剂的工艺，分别采用阳离子交换层析CMSepharoseFF和阴离子交换层析QSepharoseFF获得α1-AT，比活为0.94PU/mg，纯度达95％以上，活性回收率为38.2％，参见《中国输血杂志》，2012(S1):65-66，但是采取这种方法却无法有效的将白蛋白和α1-抗胰蛋白酶进行分离。
近年来也有一些Cohn法组分IV沉淀综合利用，同时回收多种功能蛋白的报道。例如，白高英等报道对Cohn法组分IV沉淀预处理液首先进行疏水层析，分成三个组分：第一组分采用离子交换层析得到运铁蛋白；第二组分采用离子交换层析得到α1-AT；第三组分采用肝素亲和层析分别得到AT-III和白蛋白，获得的AT-III、α1-AT收率分别为70％和65％，参见2010年兰州大学硕士学位论文《Cohn组分IV沉淀中血浆蛋白的分离工艺及过程自动化研究》。苏志国、李岩等公开了一种综合利用Cohn法组分IV沉淀的方法，作者采用不同pH的溶液对沉淀进行分步溶解，将不同的蛋白富集在不同的pH缓冲液中，再将溶出液用离子交换层析进行处理，最后得到了AT-III、α1-AT、铜蓝蛋白以及白蛋白等蛋白，参见专利CN201210438973.4。以上两种Cohn法组分IV沉淀的综合利用方法只是实验室规模的试验，未涉及到各功能蛋白的病毒灭活和活性检测，一些有关收率、比活等方面的关键质量指标都没有公开，从放大至规模化生产的角度来看还缺乏足够的数据支持，而本领域迫切需要可用于大规模生产的Cohn法组分IV沉淀综合利用方法。
发明内容
本发明提供一种从Cohn法组分IV沉淀中提取抗凝血酶III的方法，该方法能提取出纯度为99.5％以上的AT-III，并且比活和收率与现有方法相比都显著提高。
此外，本发明还提供一种从Cohn法组分IV沉淀中综合提取α1-抗胰蛋白酶、抗凝血酶III以及白蛋白的方法，在一条工艺路线上同时实现3种产品的分离，可有效降低α1-抗胰蛋白酶和抗凝血酶III的生产成本，并可实现大规模工业化生产。
一方面，本发明提供一种从血浆Cohn法组分IV沉淀中提取抗凝血酶III(AT-III)的方法，所述方法包括：将血浆Cohn法组分IV沉淀依次进行阴离子交换层析、肝素亲和层析、疏水层析，并收集疏水层析之后的穿流液，得到抗凝血酶III(AT-III)。
优选的，所述提取抗凝血酶III(AT-III)的方法在层析步骤之前还包括病毒灭活的预处理步骤，更优选的，所述病毒灭活的预处理步骤是通过S/D法进行或巴氏灭活法进行。
更优选的，本发明提供一种从血浆Cohn法组分IV沉淀中提取抗凝血酶III(AT-III)的方法，所述方法包括以下步骤：
(1)S/D病毒灭活：采用终浓度为1％Tween-80/0.3％TNBP，对血浆Cohn法组份IV沉淀溶液进行病毒灭活，24±1℃条件下搅拌孵育6h，用HCl调至pH6.00～7.50；
(2)阴离子交换层析去除杂蛋白：用pH6.00～7.50的PB缓冲液平衡DEAE阴离子交换层析柱3～6个柱体积后上样，用pH6.00～8.5的缓冲液洗柱2～5个柱体积，用pH6.00～8.5的高盐缓冲液进行洗脱，收集洗脱液；
(3)肝素亲和层析吸附目的蛋白：将肝素亲和柱用含0.1～0.5MNaCl的pH6.0～8.5的缓冲液平衡层析柱2～6个柱体积，将步骤(2)的洗脱液上样层析柱，用pH6.0～8.5并含有10～500mmol/L柠檬酸和0.5～2mol/LNaCl的缓冲液进行洗脱，收集洗脱液；
(4)疏水层析进行精纯：将疏水层析柱用pH6.0～8.5并含有10～500mmol/L柠檬酸和0.5～2mol/LNaCl的缓冲液平衡2～6个柱体积后，上样步骤(3)的洗脱液，收集上样后的流穿液；
(5)将步骤(4)的流穿液脱盐、浓缩、膜过滤除病毒、除菌分装、冻干，得到抗凝血酶III制品。
另一方面，本发明提供一种从血浆Cohn法组分IV沉淀中同时提取多种功能蛋白的方法，所述方法包括：通过上述方法收集抗凝血酶III(AT-III)，并通过AATSelect亲和层析收集α1-抗胰蛋白酶(α1-AT)。
其中所述AATSelect亲和层析可以在阴离子交换层析和肝素亲和层析之间进行，也可以在肝素亲和层析之后进行。并且，所述肝素亲和层析和AATSelect亲和层析还可以采用串联的形式，从而实现一次上样，样品流经两种层析柱，分离串联的层析柱，分别洗脱。也可以不经串联单独使用，即上样一根层析柱后收集流穿液，流穿液继续上样于第二根层析柱，分别洗脱。
在一个优选的方案中，血浆Cohn法组分IV沉淀料液通过AATSelect亲和层析之后，还进一步通过分子排阻层析柱纯化，得到α1-抗胰蛋白酶(α1-AT)。
在另一个优选的方案中，本发明在将血浆Cohn法组分IV沉淀料液通过AATSelect亲和层析和肝素亲和层析之后，进一步将样品流穿液通过阳离子交换层析、分子排阻层析，得到白蛋白。
以下是本发明方法的详细步骤，参见附图2：
(a)沉淀溶解及预处理：取Cohn法组份IV沉淀溶解于5～12倍体积的pH6.00～pH8.50的缓冲液中，搅拌10～60min，板框压滤，滤过液再经中空纤维柱澄清过滤，得到滤过液。
(b)S/D病毒灭活：采用终浓度为1％Tween-80/0.3％TNBP进行病毒灭活，24±1℃条件下搅拌孵育6h，用HCl调至pH6.00～7.50，。
(c)阴离子交换层析去除杂蛋白：用pH6.00～7.50的PB缓冲液平衡DEAE阴离子交换层析柱3～6个柱体积后上样，用pH6.00～8.5的缓冲液洗柱2～5个柱体积，用pH6.00～8.5的高盐缓冲液进行洗脱，收集洗脱液。
(d)亲和层析吸附目的蛋白：将AATSelect亲和柱和肝素亲和柱进行串联连接，用含0.1～0.5MNaCl的pH6.0～8.5的缓冲液平衡层析柱2～6个柱体积；将步骤(c)的洗脱液上样于串联的层析柱，用含有0.1～0.5MNaCl的pH6.0～8.5的缓冲液洗柱2～5个柱体积，收集串联层析柱的流穿液。
将两根串联的层析柱分离。
(e)抗凝血酶III产品制备：步骤(d)的中的肝素亲和柱用pH6.0～8.5并含有10～500mmol/L柠檬酸和0.5～2mol/LNaCl的缓冲液进行洗脱，洗脱液即为抗凝血酶III(AT-III)洗脱液。
用pH6.0～8.5含10～500mmol/L柠檬酸和0.5～2mol/LNaCl的缓冲液平衡疏水层析柱2～6个柱体积后上样抗凝血酶III洗脱液，收集上样后的流穿液。
用pH6.0～7.5的缓冲液将疏水层析后的抗凝血酶流穿液进行G25Sephadex脱盐，或者用超滤浓缩的方式进行液体转换并浓缩。
采用15～20nm膜过滤除病毒。
除菌分装，冻干即为抗凝血酶(AT-III)制品。
(f)α1-抗胰蛋白酶产品制备：将步骤(d)中的AATSelect亲和柱用pH6.0～8.5含1.0～2.0mol/LMgCl2缓冲液进行洗脱，收集洗脱液，洗脱液即为α1-抗胰蛋白酶洗脱液。
用Superdex200对α1-抗胰蛋白酶洗脱液进行纯化，缓冲液pH6.5～7.8，收集α1-抗胰蛋白酶单体峰。
浓缩、分装、冻干。
对冻干制品进行80℃、72h干热病毒灭活，得到α1-抗胰蛋白酶制品。
(g)白蛋白产品制备：步骤(d)中的流穿液经G25脱盐后转换于pH3.0～5.5的缓冲液中，然后上样CM阳离子交换层析，其流穿液再上样Superdex200层析柱，收集白蛋白组分，浓缩、巴氏灭活、分装，得到白蛋白制品。
本发明的有益效果主要有以下几个方面：
本发明采用肝素亲和层析加疏水层析的层析组合方法制备抗凝血酶III，可使抗凝血酶III的质量标准显著提高，HPLC纯度可达99.5％以上，近100％，比活达到9IU/mg以上，远高于欧洲药典规定的3IU/mg的纯度，回收率可达40％以上，与同类产品相比，具有更高的质量属性。
另外，国内目前关于在Cohn法组分IV沉淀中提取α1-抗胰蛋白酶、抗凝血酶III的专利都公开的是单一制品的制备方法，而本发明所涉及的是一种综合利用的方法，即在一条工艺路线上同时实现3种产品的分离提取，将肝素亲和层析和AATSelect亲和层析串联还能同时制备抗凝血酶III、α1-抗胰蛋白酶，流穿液可以继续用来回收白蛋白。本发明的方法可有效降低α1-抗胰蛋白酶和抗凝血酶III的生产成本，显著提高血浆综合利用效率，具有巨大的经济和社会效益。同时，本发明所示方法也不会影响到白蛋白和丙球等其他血液制剂的生产工艺，具有较强的可操作性。
本发明对Cohn法组分IV沉淀溶解液进行S/D病毒灭活之后采用阴离子交换层析进行目标蛋白的捕获，采用这种方法不仅可以有效去除病毒灭活试剂和含量最高的杂蛋白转铁蛋白，还可以高效捕获抗凝血酶III、α1-抗胰蛋白酶和白蛋白。
采用本发明所述方法，制备的α1-抗胰蛋白酶比活达到1.5PU/mg以上，纯度可达99.5％以上，回收率达到50％以上，质量标准达到最好之列。
附图说明
图1:N-K法生产白蛋白的工艺流程见附图。
图2:本发明工艺流程图。
图3:SDS-PAGE检测结果
1：组分IV沉淀；
2、3：DEAE流穿；
4：α1-抗胰蛋白酶；
5：抗凝血酶；
6：Marker
图4：α1-抗胰蛋白酶HPLC纯度检测结果。
图5:抗凝血酶HPLC纯度检测结果。
具体实施方式
人抗凝血酶
人抗凝血酶(HumanAntithrombin-III，AT-III)是一种肝脏合成的由432个氨基酸构成的丝氨酸蛋白酶抑制剂，分子量约为58KD，分子结构中含有3个二硫键和4个寡糖侧链，还含有两个重要的结构功能区，即肝素结合区与凝血酶结合区，肝素的结合可以使AT-III的抗凝作用提高数千倍。AT-III在正常人血浆中的含量约为0.12mg/mL，是血浆中最重要的凝血酶抑制物，AT-III缺乏可导致血液的抗凝血活性降低，易形成或反复形成血栓栓塞性疾病，如DIC、深静脉血栓和动脉血栓以及肺栓塞等疾病。AT-III缺乏分为遗传性缺乏与获得性缺乏，遗传性AT-III缺乏是一种常染色体显性遗传性疾病，患病率约1/5000，发病多在10～25岁之间，而获得性AT-III缺乏主要是由各种肝脏疾病引起的，如肝硬化、重症肝炎以及肝癌晚期等。因此，AT-III浓缩制剂在临床上主要用于替代治疗因AT-III缺乏引起的DIC和血栓栓塞性疾病。
抗凝血酶活性测定
底物显色法，用样品稀释液将样品、AT-III标准品稀释至试验所需浓度，取70μL/孔加入酶标板孔中，依次加入FⅩa溶液50μL/孔，混匀后37℃孵育2min，加入80μL/孔S2765溶液(0.5mmol/L)，于37℃孵育5min，立即加入20μL50％(v/v)醋酸终止反应；于酶标仪(OD405)读值，求得回归曲线，在回归曲线上算出供试品中抗凝血酶的活性。
α1-抗胰蛋白酶
α1抗胰蛋白酶(α1-antitrypsin，α1-AT，AAT)又称α1-蛋白酶抑制剂(α1-Proteinaseinhibitor,α1-PI)，是一种主要由肝细胞合成的重要血浆蛋白，具有丝氨酸蛋白酶抑制剂作用，能够抑制多种丝氨酸内肽酶的活性，如弹性蛋白酶、胰蛋白酶等。AAT是由位于第14号常染色体长臂的SERPINA1基因编码的单链糖蛋白，相对分子质量约为52000，在正常人血浆中的含量约为2g/L。α1-抗胰蛋白酶缺乏症(α1-AntitrypsinDeficiency,AATD)是由于编码AAT蛋白的基因发生突变，使得体内可循环的正常AAT蛋白浓度下降而引起的，AATD主要导致肺部及肝脏疾病，如肺气肿、新生儿肝炎以及肝硬化等。该疾病在欧洲和北美比较常见，发病率约为1:2000～5000，而在我国，由于缺乏流行病学的调查资料，目前患病人数未知。
α1-抗胰蛋白酶活性测定
采用底物显色法，用稀释液将供试品、AAT标准品稀释至试验所需浓度，取40μL/孔加入96孔酶标板孔中，依次加入胰蛋白酶溶液(20μg/mL)10μL/孔，混匀后37℃孵育30min，加入80μL/孔BAPNA(800μg/mL)，混匀后于37℃孵育40min，立即加入20μL50％(v/v)醋酸终止反应；于酶标仪(OD405)读值，求得回归曲线，在回归曲线上算出供试品中活性AAT的含量，比活为活性AAT含量与总蛋白含量的比值。
总蛋白浓度测定：使用紫外分光光度法检测。
纯度测定：采用常规SDS-PAGE电泳和HPLC方法。
收率计算：
材料及设备：
Cohn法组分IV沉淀：来自兰州生物制品研究所血液制剂室提供，来源于N-K法工艺中的组分IV沉淀，N-K法生产白蛋白的工艺流程见附图1。
本发明采用的层析柱和主要试剂如下：
DEAESepharoseFastFlow层析胶：购自GE公司
TOYOPEARLAF-HeparinHC-650M亲和胶：购自TOSOH公司
CaptoHeparin亲和胶(肝素亲和层析柱)：购自GE公司
Alpha-1AntitrypsinSelect亲和胶(AATSelect亲和层析柱)：购自GE公司
Superdex200层析胶：购自GE公司
PhenylSepharose6FF疏水层析胶:购自GE公司
AKTAavant150以及AKTAPilot层析系统：GE公司
MgCl2、柠檬酸以及Tris等试剂均为国药集团试剂
AAT、AT-III国际标准品均购自NIBSC
HC20nm除病毒膜：购自赛多利斯公司
实施例1、小规模制备工艺
1.沉淀溶解：1kg组分IV沉淀溶解于5LpH8.0、20mmol/LPB缓冲液中，4℃条件下搅拌60min，压滤后将滤过液用0.22μm中空纤维柱过滤澄清，得到滤过液。
2.S/D灭活：采用终浓度1％Tween-80/0.3％TNBP(磷酸三丁酯)进行病毒灭活，24℃条件下搅拌孵育6h，用0.1mo/L的HCl调至pH6.20。
3.阴离子交换层析：采用DEAESepharoseFF层析填料，层析柱为XK50/20，柱高10cm，用pH6.20的20mmol/LPB缓冲液平衡层析柱4个柱体积后上样500mL，用相同缓冲液洗柱2个柱体积后，再用含有30mmol/LNaCl、pH7.4的50mmol/LTris-HCl缓冲液进行洗脱。
4.串联亲和层析：采用CaptoHeparin肝素亲和柱串联AATSelect亲和柱，两根层析柱均为XK26/20，柱床高度均为10cm。用含0.15mol/LNaCl、pH7.4的50mmol/LTris-HCl缓冲液平衡4个柱体积；上样步骤3中的洗脱液；用相同缓冲液洗柱2个柱体积后分离肝素亲和柱和AATSelect亲和柱，同时收集流穿液。
5.抗凝血酶的制备：
5.1用含10mmol/L柠檬酸、2mol/LNaCl、pH7.4的50mmol/LTris-HCl缓冲液对肝素亲和柱进行洗脱，收集洗脱液。
5.2疏水层析：采用PhenylSepharose6FF填料，直径2.6cm，高度10cm。用含10mmol/L柠檬酸、2mol/LNaCl、pH7.4的50mmol/LTris-HCl缓冲液平衡层析柱4个柱体积后进行上样步骤5.1中的洗脱液，收集流穿液。
5.3采用SephadexG25填料，柱高40cm，直径2.6cm，用含10mmol/L柠檬酸、150mmol/LNaCl、pH7.4的20mmol/LPB缓冲液平衡1.5个柱体积后上样步骤5.2中的流穿液进行脱盐。
5.4用10kd超滤膜浓缩至蛋白含量为50IU/ml。
5.5HC20nm膜过滤去除病毒。
5.6除菌、分装、冻干。
6.α1-抗胰蛋白酶的制备
6.1用含2mol/LMgCl2、pH7.4的50mmol/LTris-HCl缓冲液对步骤4中的AATSelect亲和柱进行洗脱，收集洗脱液。
6.2采用Superdex200进行纯化，层析柱直径2.6cm，柱床高度60cm。用含0.15mol/LNaCl、pH7.4的20mmol/LPB缓冲液平衡1.5个柱体积后上样步骤6.1中的洗脱液10ml，收集目标蛋白峰。
6.3用10kd超滤膜浓缩至AAT活性蛋白含量为50mg/ml。
6.4除菌、1ml/瓶分装、冻干。
6.5冻干制品在80℃、72h条件下进行病毒灭活。
7.白蛋白的制备
7.1步骤4中的流穿液经G25脱盐后蛋白转换至pH4.5的0.025mol/L醋酸缓冲液中。
7.2采用CMSepharoseFF进行纯化，柱直径1.6cm，柱高10cm，用pH4.5的0.025mol/L醋酸缓冲液平衡4个柱体积后上样200ml，收集流穿液。
7.3流穿液上样Superdex200层析柱，收集白蛋白组分。
7.4浓缩、巴氏灭活后分装。
8.检测：HPLC、SDS-PAGE检测纯度，AAT和AT-III的纯度均达到99％以上。各组分SDS-PAGE检测见图3，HPLC检测见图4(AAT)、图5(AT-III)。AAT、AT-III、白蛋白小规模制备的检测结果见表2。
表2.3批小规模制备样品数据
实施例2、大规模制备工艺
1.沉淀溶解：5kg组分IV沉淀溶解于50LpH8.0、20mmol/LPB缓冲液中，8℃条件下搅拌30min，压滤后将滤过液用0.22μm中空纤维柱过滤澄清，得到滤过液。
2.S/D灭活：采用终浓度1％Tween-80/0.3％TNBP进行病毒灭活，24℃条件下搅拌孵育6h，用0.1mo/L的HCl调至pH6.80。
3.阴离子交换层析：采用DEAESepharoseFF层析填料，层析柱为BPG140/50，柱高20cm，用pH6.8的20mmol/LPB缓冲液平衡层析柱4个柱体积后上样50L，洗柱2.5个柱体积后，用含20mmol/LNaCl、pH7.4的50mmol/LTris-HCl缓冲液进行洗脱。
4.串联亲和层析：采用TOYOPEARLAF-HeparinHC-650M肝素亲和柱串联AATSelect亲和柱，两根层析柱均为BPG100/50，柱高均为20cm。用含0.15mol/LNaCl、pH7.4的50mmol/LTris-HCl缓冲液平衡4个柱体积；上样离子交换层析后的洗脱液，用相同缓冲液洗柱2个柱体积后分离肝素亲和柱和AATSelect亲和柱，同时收集流穿液。
5.抗凝血酶的制备：
5.1用含10mmol/L柠檬酸、2mol/LNaCl、pH7.4的50mmol/LTris-HCl缓冲液进行对步骤4中分离后的肝素亲和柱进行洗脱，收集洗脱液。
5.2用PhenylSepharose6FF填料装INDEX70/50层析柱，柱高20cm，用含10mmol/L柠檬酸、2mol/LNaCl、pH6.8的20mmol/LPB缓冲液平衡4个柱体积后进行上样，收集上样后的流穿液。
5.3采用SephadexG25进行脱盐，层析柱为BPG100/50，柱高25cm，用含10mmol/L柠檬酸、150mmol/LNaCl、pH7.4的20mmol/LPB缓冲液平衡层析柱1.5个柱体积后进行脱盐，收集抗凝血酶蛋白液。
5.4将脱盐后的AT-III原液用10kd超滤膜包浓缩至100IU/ml。
5.5采用HC20nm膜过滤去除病毒。
5.60.22μm膜除菌、1000IU/瓶分装冻干。
6.α1-抗胰蛋白酶的制备
6.1用含2mol/LMgCl2、pH7.4的50mmol/LTris-HCl缓冲液对步骤4中的AATSelect亲和柱进行洗脱，收集洗脱液。
6.2采用Superdex200进行纯化，层析柱直径10cm，柱床高度80cm。用含0.15mol/LNaCl、pH7.4、20mmol/LPB缓冲液平衡1.5个柱体积后上样步骤6.1中的洗脱液10ml，收集目标蛋白峰。
6.3用10kd超滤膜浓缩至AAT活性蛋白含量为50mg/ml。
6.4除菌、10ml/瓶分装、冻干。
6.5冻干制品在80℃、72h条件下进行病毒灭活。
7.检测：AAT、AT-III连续三批活性检测结果见下表3：
表3.3批大规模制备样品数据

Claims (10)

1.一种从血浆Cohn法组分IV沉淀中提取抗凝血酶III(AT-III)的方法，其特征在于，所述方法包括：将血浆Cohn法组分IV沉淀依次进行阴离子交换层析、肝素亲和层析、疏水层析，并收集疏水层析之后的流穿液，得到抗凝血酶III(AT-III)。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在层析步骤之前还包括病毒灭活的预处理步骤。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述病毒灭活的预处理步骤是通过S/D法进行或巴氏灭活法进行。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)S/D病毒灭活：采用终浓度为1％Tween-80/0.3％TNBP，对血浆Cohn法组份IV沉淀溶液进行病毒灭活，24±1℃条件下搅拌孵育6h，用HCl调至pH6-7.5；
(2)阴离子交换层析去除杂蛋白：用pH6-7.5的PB缓冲液平衡DEAE阴离子交换层析柱3-6个柱体积后上样，用pH6-8.5的缓冲液洗柱2-5个柱体积，用pH6-8.5的高盐缓冲液进行洗脱，收集洗脱液；
(3)肝素亲和层析吸附目的蛋白：将肝素亲和柱用含0.1-0.5MNaCl的pH6-8.5的缓冲液平衡层析柱2-6个柱体积，将步骤(2)的洗脱液上样层析柱，用pH6-8.5并含有10-500mmol/L柠檬酸和0.5-2mol/LNaCl的缓冲液进行洗脱，收集洗脱液；
(4)疏水层析进行精纯：将疏水层析柱用pH6-8.5并含有10-500mmol/L柠檬酸和0.5-2mol/LNaCl的缓冲液平衡2-6个柱体积后，上样步骤(3)的洗脱液，收集上样后的流穿液；
(5)将步骤(4)的流穿液脱盐、浓缩、膜过滤除病毒、除菌分装、冻干，得到抗凝血酶III制品。
5.一种从血浆Cohn法组分IV沉淀中同时提取多种功能蛋白的方法，其特征在于，所述方法包括：通过权利要求1-4中任一项所述的方法收集抗凝血酶III(AT-III)，通过AATSelect亲和层析收集α1-抗胰蛋白酶(α1-AT)。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述AATSelect亲和层析是在阴离子交换层析和肝素亲和层析之间进行，或者是在肝素亲和层析之后进行。
7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述肝素亲和层析和AATSelect亲和层析为串联形式，一次上样，两柱分离后分别洗脱。
8.根据权利要求5-7中任一项所述的方法，其特征在于，在通过AATSelect亲和层析之后，进一步通过分子排阻层析纯化，得到α1-抗胰蛋白酶(α1-AT)。
9.一种从血浆Cohn法组分IV沉淀中同时提取多种功能蛋白的方法，其特征在于，所述方法包括：通过权利要求1-8中任一项所述的方法收集抗凝血酶III(AT-III)，通过权利要求5-8中任一项所述的方法收集α1-抗胰蛋白酶(α1-AT)，并且在将血浆Cohn法组分IV沉淀通过AATSelect亲和层析和肝素亲和层析之后，将样品流穿液进一步阳离子交换层析、分子排阻层析，得到白蛋白。
10.一种从血浆Cohn法组分IV沉淀中同时提取多种功能蛋白的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(a)沉淀溶解：取Cohn法组份IV沉淀溶解于5-12倍体积的pH6-8.5的缓冲液中，搅拌，过滤，得到滤过液；
(b)S/D病毒灭活：采用终浓度为1％Tween-80/0.3％TNBP进行病毒灭活，24±1℃条件下搅拌孵育6h，用HCl调至pH6-7.5；
(c)阴离子交换层析去除杂蛋白：用pH6-7.5的PB缓冲液平衡DEAE阴离子交换层析柱3-6个柱体积后上样，用pH6-8.5的缓冲液洗柱2-5个柱体积，用pH6-8.5的高盐缓冲液进行洗脱，收集洗脱液；
(d)亲和层析吸附目的蛋白：将AATSelect亲和柱和肝素亲和柱进行串联连接，用含0.1-0.5MNaCl的pH6-8.5的缓冲液平衡层析柱2-6个柱体积；将步骤(c)的洗脱液上样串联的层析柱，用含有0.1-0.5MNaCl的pH6-8.5的缓冲液洗柱2-5个柱体积，收集串联层析柱的流穿液；
将两根串联的层析柱分离；
(e)抗凝血酶III产品制备：
步骤(d)的中的肝素亲和柱用pH6-8.5并含有10-500mmol/L柠檬酸和0.5-2mol/LNaCl的缓冲液进行洗脱，收集洗脱液；
用pH6-8.5并含有10-500mmol/L柠檬酸和0.5-2mol/LNaCl的缓冲液平衡疏水层析柱2-6个柱体积后，上样肝素亲和柱洗脱液，收集上样后的流穿液；
将疏水层析柱的流穿液脱盐、浓缩、膜过滤除病毒、除菌分装、冻干，得到抗凝血酶III制品；
(f)α1-抗胰蛋白酶产品制备：
将步骤(d)的AATSelect亲和柱用pH6-8.5并含有1-2mol/LMgCl2的缓冲液进行洗脱，收集洗脱液；
用pH6.5-7.8的缓冲液平衡分子阻排层析柱后，上样AATSelect亲和柱洗脱液，收集α1-抗胰蛋白酶；
浓缩、分装、冻干，对冻干制品进行80℃、72小时干热病毒灭活，得到α1-抗胰蛋白酶制品；
(g)白蛋白制备：
步骤(d)中的流穿液经G25脱盐后转换于pH3-5.5的缓冲液中，然后上样CM阳离子交换层析柱，流穿液继续上样Superdex200层析柱，收集白蛋白组分，浓缩、巴氏灭活、分装，得到白蛋白制品。
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