CN106496302A - 一种用离子交换层析纯化蛋白质的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用离子交换填料纯化蛋白质的方法，更具体地，在一定pH条件下将混合蛋白吸附离子交换填料上，使用不同pH和/或浓度的Tris缓冲液分别洗脱酸性异构体、目标单体、碱性异构体，从而达到分离的作用。本发明的方法能有效去除酸碱性异构体的同时，兼能去除聚集体和小分子，具有广泛的工业应用前景。

Description

一种用离子交换层析纯化蛋白质的方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种用离子交换层析纯化蛋白质的方法。

背景技术

随着生物技术的不断发展，抗体类药物以其高特异性、有效性和安全性正在成为药品市场上的一大类新型诊断和治疗剂，并涌现出大批具有良好靶向治疗效果的抗体。

单克隆抗体是复杂的四聚体糖蛋白，常呈现微观不均一性，即“异质性”，包括电荷、疏水、形态等相关的构造体(Liu H,Gaza-Bulseco G,Falad D,et al.Heterogeneity of monoclonal antibodies.J Pharm Sci,2008,97(7):2426-2447)。这些异构体可能来自于抗体分子复杂的生物合成途径，如细胞系及培养工艺(Karra S,Sager B,Karim MN.Multi-Scale modeling of heterogeneities in mammalian cellculture processes.Ind Eng Chem Res,2010,49(17):7990-8006)，也可能来自于纯化、制剂等制造过程及储存过程的任何阶段。其中抗体分子所带的电荷差异造成异质性称为“电荷异构”，一般分为酸性异构体和碱性异构体，这些异构体带有无数酸性和碱性侧链氨基酸官能团，这些官能团的范围主要是羧酸类(天冬氨酸和谷氨酸)；酚类(酪氨酸)；胺类(赖氨酸，组氨酸)；胍类(精氨酸)。

基因泰克公司曾对于上市的抗体及临床前抗体药物关于电荷变化产生的药效和药代等方面的影响做过一个总结，结果表明：1、当电荷变异超过一个pH单位时，会影响药物的组织分布及药代动力学；2、增加正电荷，会提高药物的组织停滞，降低血清清除；3、降低正电荷，会减少药物的组织停滞，提高药物全身的清除(Boswell CA,Tesar DB,Mukhyala K.Effects of charge on antibodytissue distribution and pharmacokinetics.Bioconj Chem,2010,21(12):2153-2163)。这些异构体与主要种类的抗体具有至少70％的同源性，优选80％的同源性，而且更优选至少约90％同源。因此分离电荷异构体，得到均一性质的抗体是一个关键的挑战。

在众多的分离手段中，离子交换层析在分离电荷异构体方面被认为是最有前景的方法(程洪杰等.单克隆抗体电荷异构体分离方法优化,中国医药生物技术,2014,9(5):385-388)。在离子交换层析分离的过程中，通过控制带电分子与相反电荷的离子交换填料之间的可逆相互作用来实现特定电荷蛋白的结合和分离，从而达到电荷差异蛋白的分离。处于与等电点相同pH值环境中的蛋白质表面净电荷为零，不会和带电的填料发生相互作用。而当所处的环境pH低于其等电点时，蛋白质会同带有负电荷的填料，也就是阳离子交换填料结合。当所处的环境的pH高于等电点时，蛋白质不会同阳离子交换填料结合，从而分离出蛋白。

因此，寻找出一种既能很好地分离蛋白质样品中的酸碱性异构体，又能很好地去除聚集体和小分子的分离方法，这是我们将要面临的一个严峻的挑战。

发明内容

本申请的发明人经过大量研究，发现了一种用阳离子交换层析分离蛋白样品中酸碱性异构体的方法，同时兼顾去除聚集体和小分子。具体地说，使用上样缓冲液将蛋白结合在离子交换填料上，并处于该缓冲液环境中；使用第一pH和/或浓度的Tris缓冲液洗涤酸性异构体和小分子，并回收；再使用第二pH和/或浓度的Tris缓冲液洗脱目标蛋白质，并回收；最后使用第三pH和/或浓度的Tris缓冲液再生碱性异构体和聚集体，并回收，从而达到精纯蛋白，去除酸碱性异构体、聚集体和小分子等杂质的目的。

因此，本发明的目的在于提供一种用离子交换层析纯化蛋白质的方法。

为了实现上述目的，本发明提供了如下技术方案：

一种用离子交换层析纯化蛋白质的方法，包括以下步骤：

(A)用上样缓冲液将蛋白质结合在离子交换填料上，并处于该缓冲液环境中；

(B)使用第一pH和/或浓度的Tirs缓冲液洗涤酸性异构体和小分子；

(C)再使用第二pH和/或浓度的Tirs缓冲液洗脱目标蛋白质。

进一步的，还包括步骤(D)：在步骤(C)之后使用第三pH和/或浓度的Tirs缓冲液或高盐再生碱性异构体和聚集体。

进一步的，所述离子交换填料为阳离子交换树脂，所述第二Tirs缓冲液的pH和/或浓度大于第一Tirs缓冲液的pH和/或浓度，所述第三Tirs缓冲液的pH和/或浓度大于第二Tirs缓冲液的pH和/或浓度。

进一步的，所述阳离子交换树脂选自：Poros XS，Nuvia HRS，Capto MMCImpres或ESHMUNO CPX。

进一步的，所述Tirs缓冲液是用Tris和酸溶液相互调节而得到，所述酸溶液包括：盐酸、柠檬酸或磷酸等，优选为盐酸。

进一步的，所述蛋白质为抗体。

更进一步的，所述抗体为单克隆抗体。

更进一步的，所述单克隆抗体包括鼠源抗体、嵌合抗体、人源化抗体、全人抗体。

更进一步的，所述单克隆抗体为贝伐单抗或曲妥珠单抗。

进一步的，所述蛋白质为哺乳动物细胞表达或真核细胞表达。

本发明的有益效果：

磷酸盐(PB)缓冲液具有稳定性好的优点，是离子交换层析中常规的洗脱缓冲液，然而，本发明的发明人发现使用PB缓冲液不能有效地分离酸碱异构体和目标蛋白，在进一步的长期研究过程中，本发明的发明人发现使用Tris缓冲液先洗涤酸性异构体和小分子，再洗脱目标蛋白的方法能够有效地去除蛋白质样品中的酸碱性异构体、聚集体和小分子，纯化后的目标蛋白纯度高，具有广泛的工业应用前景。

附图说明

图1为贝伐单抗的PB洗脱方式终产物的离子交换层析图谱。

图2为贝伐单抗的PB洗脱方式终产物的SEC-HPLC检测色谱叠加图。

图3为贝伐单抗的PB洗脱方式终产物的CEX-HPLC检测色谱叠加图。

图4为贝伐单抗的Tris洗脱方式终产物的离子交换层析图谱。

图5为贝伐单抗的Tris洗脱方式终产物的SEC-HPLC检测色谱叠加图。

图6为贝伐单抗的Tris洗脱方式终产物的CEX-HPLC检测色谱叠加图。

图7为曲妥珠单抗的Tris洗脱方式终产物的离子交换层析图谱。

图8为曲妥珠单抗的Tris洗脱方式终产物的SEC-HPLC检测色谱叠加图。

图9为曲妥珠单抗的Tris洗脱方式终产物的CEX-HPLC检测色谱叠加图。

具体实施方式

本发明中，使用一定pH的上样缓冲液的目的是将蛋白吸附于离子交换填料上，上样缓冲液可以使用柠檬酸和柠檬酸三钠相互配制或使用柠檬酸和Tris相互配制，更优选柠檬酸和Tris相互配制，pH为4-8，更优选pH为5-6。上样后的平衡要保证相应的pH和电导和平衡缓冲液基本一致后，方能进行下一步。

本发明中，使用第一pH和/或浓度的Tris缓冲液的目的是洗脱酸性异构体和小分子，使用第二pH和/或浓度的Tris缓冲液的目的是洗脱目标蛋白质，使用第三pH和/或浓度的Tris缓冲液的目的是洗脱碱性异构体和聚集体。

本发明中使用的填料优选为阳离子交换填料，例如Poros XS、Nuvia HRS、Capto MMC Impres，ESHMUNO CPX等，优选为Poros XS。

对于阳离子交换树脂，所述第二Tirs缓冲液的pH和/或浓度大于第一Tirs缓冲液的pH和/或浓度，所述第三Tirs缓冲液的pH和/或浓度大于第二Tirs缓冲液的pH和/或浓度或为高盐。

本发明中所述的Tris为三羟甲基氨基甲烷，用酸溶液调节pH配制成需要的缓冲液，所述酸溶液包括：盐酸、柠檬酸，磷酸等，优选为盐酸(HCl)。由于Tris作为生物缓冲液，pH值随温度变化比较大。一般来说，温度每升高一度，pH值下降0.03，所以使用中要保持溶液和系统温度恒定或温度差变化不大的条件下进行。

本发明中所述的蛋白质，只要有电荷差异的蛋白质都可以适用。例如，全人抗体、人源化抗体、嵌合抗体、鼠源抗体等，包括但不限于曲妥珠单抗、贝伐单抗等。所述蛋白质为哺乳动物细胞表达或真核细胞表达。

以下实施例仅对本发明进行进一步的说明，不应理解为对本发明的任何限制。

以下实施例中使用的检测方法说明如下：

1、SEC-HPLC液相检测：

液相色谱系统Thermo UItimate 3000

色谱柱TOSOK G300 SWXL

流动相：200mmol/L PB缓冲液 pH：6.8

流速：0.5mL/min。

2、CEX-HPLC液相检测：

液相色谱系统Agilent 1260

色谱柱Thermo ProPac WCX-104-250mm

流动相：MPA(流动相A)20mmol/L PB pH：6.5

MPB(流动相B)20mmol/L PB+200mmol/L NaCl pH：6.5

流速：1mL/min。

3、紫外检测：

岛津UV-1800

对照溶液：Q水。

以下实施例中所述酸性异构体去除率、碱性异构体去除率、目标蛋白回收率和得率的计算方法具体如下：

酸性异构体去除率(以CEX-HPLC检测结果计)＝(洗涤峰和再生峰中的酸性异构体总量之和)/上样中的酸性异构体的总和

碱性异构体去除率(以CEX-HPLC检测结果计)＝(洗涤峰和再生峰中的碱性异构体总量之和)/上样中的碱性异构体的总和

目标蛋白回收率(以CEX-HPLC检测结果计)＝目标峰中的目标蛋白总量/上样中的目标蛋白的总量

得率＝目标峰的蛋白总量/上样的蛋白总量。

实施例1

1.1、

本实施例以贝伐单抗为纯化目标蛋白，样品使用Poros XS填料进行PB的pH线性梯度(线性梯度：使用洗涤液和洗脱液，在保留时间为5min条件下，进行线性梯度15cv，共75min)层析。

实验条件说明如下：

层析柱：XK16/20(通用电气公司GE)

填料：Poros XS(Life Technologies)1cv＝35mL H＝17.4cm载量：20mg/mL

保留时间：5min

层析系统：AKTA Purifier

操作系统：unicorn系统(通用电气公司GE)

样品来源：发酵上清通过蛋白A亲和层析制备主峰(来源自上海中信国健药业股份有限公司)，调节亲和层析制备主峰的pH为5.51

溶液：

平衡液：10mmol/L Tris-柠檬酸缓冲液 pH：5.5

洗涤液：10mmol/L PB缓冲液 pH：7.0

洗脱液：10mmol/L PB缓冲液 pH：9.34

再生液：2mol/L NaCl

消毒液：0.5mol/L NaOH

保存液：20％乙醇

实验操作流程：平衡6cv→上样→平衡5cv→洗涤4cv→(洗涤-洗脱)15cv→洗脱3cv→再生3cv→消毒→水3cv→保存2cv

相关主峰收集：以UV280nm为判断标准，依次收集峰1-峰6。峰1-峰6的离子交换层析图谱如图1所示。

收集峰1-峰6的各个中间体使用岛津UV-1800设备检测各个主峰的浓度，并使用各个主峰总蛋白量＝主峰浓度*主峰体积，计算出各个主峰的总蛋白量，如表1所示。将各个主峰使用液相检测SEC-HPLC和CEX-HPLC，检测结果如表1所示。各个中间体的SEC-HPLC色谱叠加图谱如图2所示。各个中间体的CEX-HPLC色谱叠加图谱如图3所示。

表1 中间体检测结果

如表1所示，根据收集的峰1-峰6的检测SEC-HPLC和CEX-HPLC结果可以看出只有峰3的目标蛋白的纯度比较好(CEX-HPLC≥81％和SEC-HPLC≥98％)，相应的得率为21.3％，目标蛋白的回收率为26％。PB洗脱为离子交换层析常规的洗脱方式，然而通过以上实验发现采用常规的PB缓冲液依次洗脱酸性异构体和小分子以及目标蛋白时，纯化得到的目标蛋白的纯度较低，并且不能很好地实现去除酸碱异构体、聚集体和小分子等杂质的目的，不能满足工业化应用需要。

1.2、

本实施例以贝伐单抗为纯化目标蛋白，样品使用Poros XS填料进行Tris-HCl洗脱条件的层析。

层析柱：XK16/20(通用电气公司GE)

填料：Poros XS(Life Technologies)1cv＝25mL H＝12.4cm 载量：30mg/mL

保留时间：5min

层析系统：AKTA Purifier

操作系统：unicorn系统(通用电气公司GE)

样品来源：发酵上清通过蛋白A亲和层析制备主峰(来源中信国健药业股份有限公司)，调节亲和层析制备主峰的pH为5.5

溶液：

平衡液：10mmol/L Tris-柠檬酸缓冲液 pH：5.5

洗涤液：10mmol/L Tris-HCl缓冲液 pH：7.8

洗脱液：50mmol/L Tris-HCl缓冲液 pH：8.2

再生液：2mol/L NaCl

消毒液：0.5mol/L NaOH

保存液：20％乙醇

实验操作流程：平衡6cv→上样→平衡5cv→洗涤4cv→洗脱4cv→再生3cv→消毒→水3cv→保存2cv

相关主峰收集：以UV280nm为判断标准，分别收集洗涤峰、主峰和再生峰。

离子交换层析图谱如图4所示。

收集各个中间体使用岛津UV-1800设备检测各个主峰的浓度，并使用各个主峰总蛋白量＝主峰浓度*主峰体积，计算出各个主峰的总蛋白量，如表2所示。将各个主峰使用液相检测SEC-HPLC和CEX-HPLC，检测结果如表2所示。各个中间体的SEC-HPLC色谱叠加图谱如图5所示。各个中间体的CEX-HPLC色谱叠加图谱如图6所示。

表2 中间体检测结果

如表2所示，当采用Tris缓冲液依次洗脱酸性异构体和小分子以及目标蛋白时，通过液相色谱SEC-HPLC检测结果分析，洗涤峰中含有大量的小分子，再生峰中含有大量的聚集体，主峰中目标蛋白的SEC-HPLC纯度为99.67％。从实验的离子交换层析图谱4和各个中间体SEC-HPLC检测色谱叠加图5能很好地说明本发明的方法在去除蛋白质样品中的聚集体和小分子方面优势明显。

通过离子交换层析结果和液相色谱CEX-HPLC检测结果综合分析，主峰中目标蛋白的CEX-HPLC纯度为91.34％，使用本发明的方法的酸性异构体去除率为87.8％，碱性异构体去除率为75.8％，目标蛋白的回收率为85.4％。从实验的离子交换层析图谱4和各个中间体CEX-HPLC检测色谱叠加图6也能很好地说明本发明的方法在去除蛋白质样品中的酸碱性异构体方面优势明显。

将实施例1.1的PB洗脱方式和实施例1.2的Tris缓冲液洗脱方式进行对比，结果如表3所示。

表3 PB和Tris缓冲液洗脱方式结果对比表

如表3所示，在得率方面，采用Tris缓冲液洗脱方式的主峰得率和目标蛋白回收率分别为采用PB缓冲液洗脱方式的主峰得率和目标蛋白回收率的2.8倍和3.3倍。在纯度方面，采用Tris缓冲液洗脱方式的主峰的目标蛋白的CEX-HPLC纯度91.34％显著高于采用PB缓冲液洗脱方式的主峰的目标蛋白的CEX-HPLC纯度81.68％。

综上所述，采用本发明的方法在贝伐单抗分离酸碱性异构体、聚集体和小分子方面有明显优势，目标蛋白的回收率和纯度高，能够很好地满足工业应用需要，具有广泛的工业应用前景。

实施例2、

本实施例以曲妥珠单抗为纯化目标蛋白，使用Poros XS填料进行Tris-HCl洗脱条件的层析

层析柱：XK16/20(通用电气公司GE)

填料：Poros XS(Life Technologies)1cv＝22mL H＝11cm

保留时间 5min 载量：10mg/mL

层析系统：AKTA Purifier

操作系统：unicorn系统(通用电气公司GE)

样品来源：发酵上清通过蛋白A亲和层析制备主峰(来源上海中信国健药业股份有限公司)，调节亲和层析制备主峰pH为5.5

溶液：

平衡液1：10mmol/L Tris-柠檬酸缓冲液 pH：5.5

平衡液2：20mmol/L Tris-HCl缓冲液 pH：8.5

洗涤液：90mmol/L Tris-HCl缓冲液 pH：8.5

洗脱液：130mmol/L Tris-HCl缓冲液 pH：8.5

再生液：2mol/L NaCl

消毒液：0.5mol/L NaOH

保存液：20％乙醇

实验操作流程：平衡1(6cv)→上样→平衡1(6cv)→平衡2(5cv)→洗涤4cv→洗脱4cv→再生3cv→消毒→水3cv→保存2cv

主峰收集如下：以UV280nm为判断标准，分别收集UV有吸收的洗涤峰、主峰和再生峰。离子交换层析图谱如图7所示。

收集各个中间体使用岛津UV-1800设备检测各个主峰的浓度，并使用各个主峰总蛋白量＝主峰浓度*主峰体积，计算出各个主峰的总蛋白量，如表4所示。将各个主峰使用液相检测SEC-HPLC和CEX-HPLC，检测结果如表4所示。各个中间体的SEC-HPLC色谱叠加图谱如图8所示。各个中间体的CEX-HPLC色谱叠加图谱如图9所示。

表4 中间体检测结果

如表4所示，通过SEC-HPLC检测结果分析，洗涤峰中含有大量的小分子，再生峰中含有大量的聚集体，主峰中目标蛋白的SEC-HPLC纯度为99.74％。从实验的离子交换层析图谱7和各个中间体SEC-HPLC检测色谱叠加图8能很好地说明本发明在去除蛋白质样品中的聚集体和小分子方面优势明显。

通过液相色谱CEX-HPLC检测结果分析，主峰中目标蛋白的CEX-HPLC纯度为80.07％。使用本发明的方法的酸性异构体去除率为92.44％，碱性异构体去除率为89.12％，目标蛋白的回收率为73.06％。从实验的离子交换层析图谱7和各个中间体CEX-HPLC检测色谱叠加图9也能很好地说明本发明的方法在去除酸碱性异构体方面优势明显。

综上所述，本发明的方法在曲妥珠单抗分离酸碱性异构体、聚集体和小分子方面有明显优势，目标蛋白的回收率和纯度高，能够很好地满足工业应用需要，具有广泛的工业应用前景。

Claims (10)

1.一种用离子交换层析纯化蛋白质的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(A)用上样缓冲液将蛋白质结合在离子交换填料上，并处于该缓冲液环境中；

(B)使用第一pH和/或浓度的Tirs缓冲液洗涤酸性异构体和小分子；

(C)再使用第二pH和/或浓度的Tirs缓冲液洗脱目标蛋白质。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，还包括步骤(D)：在步骤(C)之后使用第三pH和/或浓度的Tirs缓冲液或高盐再生碱性异构体和聚集体。

3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述离子交换填料为阳离子交换树脂，所述第二Tirs缓冲液的pH和/或浓度大于第一Tirs缓冲液的pH和/或浓度，所述第三Tirs缓冲液的pH和/或浓度大于第二Tirs缓冲液的pH和/或浓度。

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述阳离子交换树脂选自：PorosXS，Nuvia HRS，Capto MMC Impres或ESHMUNO CPX。

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述阳离子交换树脂为Poros XS。

6.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述Tirs缓冲液是用Tris和酸溶液相互调节而得到，所述酸溶液包括：盐酸、柠檬酸或磷酸。

7.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述蛋白质为抗体。

8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述抗体为单克隆抗体。

9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述单克隆抗体包括鼠源抗体、嵌合抗体、人源化抗体、全人抗体；所述单克隆抗体为贝伐单抗或曲妥珠单抗。

10.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述蛋白质为哺乳动物细胞表达或真核细胞表达。