CN114113450A - 一种基于等度洗脱的新型电荷异质体快速分离方法 - Google Patents
一种基于等度洗脱的新型电荷异质体快速分离方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN114113450A CN114113450A CN202010896233.XA CN202010896233A CN114113450A CN 114113450 A CN114113450 A CN 114113450A CN 202010896233 A CN202010896233 A CN 202010896233A CN 114113450 A CN114113450 A CN 114113450A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- ion exchange
- exchange chromatography
- isocratic elution
- elution
- protein
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 238000010829 isocratic elution Methods 0.000 title claims abstract description 31
- 238000000926 separation method Methods 0.000 title abstract description 19
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 claims abstract description 30
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 28
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 28
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 27
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 16
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims description 6
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 claims description 5
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 claims description 5
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 claims description 4
- 229960004641 rituximab Drugs 0.000 claims description 4
- 238000005341 cation exchange Methods 0.000 claims description 3
- 229910000402 monopotassium phosphate Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 239000007836 KH2PO4 Substances 0.000 claims description 2
- 125000002843 carboxylic acid group Chemical group 0.000 claims description 2
- 229960000575 trastuzumab Drugs 0.000 claims description 2
- 238000002347 injection Methods 0.000 claims 2
- 239000007924 injection Substances 0.000 claims 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 abstract description 23
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 abstract description 6
- 230000008901 benefit Effects 0.000 abstract description 4
- 239000000463 material Substances 0.000 abstract description 3
- 102100040678 Programmed cell death protein 1 Human genes 0.000 description 14
- 101710089372 Programmed cell death protein 1 Proteins 0.000 description 14
- 239000000047 product Substances 0.000 description 12
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 7
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 6
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 4
- 230000008859 change Effects 0.000 description 3
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 2
- 229940022353 herceptin Drugs 0.000 description 2
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 2
- 230000005526 G1 to G0 transition Effects 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000006978 adaptation Effects 0.000 description 1
- 230000008827 biological function Effects 0.000 description 1
- 238000005277 cation exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 239000012470 diluted sample Substances 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 description 1
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 239000012514 monoclonal antibody product Substances 0.000 description 1
- 235000019796 monopotassium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- PJNZPQUBCPKICU-UHFFFAOYSA-N phosphoric acid;potassium Chemical compound [K].OP(O)(O)=O PJNZPQUBCPKICU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 238000004451 qualitative analysis Methods 0.000 description 1
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 229910021642 ultra pure water Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000012498 ultrapure water Substances 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
- G01N30/96—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation using ion-exchange
Abstract
本发明公开了一种新型蛋白制品电荷异质体的快速分离方法。该方法是使用等度洗脱的离子交换色谱法对蛋白制品中的电荷异质体进行分离，即用简单便捷的等度洗脱替代普遍应用的梯度洗脱，其优势有：显著加快分离速度，提高分析效率；简化实验流程，降低人力、物力成本；适用性广，同一方法可用于多种类似蛋白制品电荷异质体的分离分析。
Description
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，尤其涉及蛋白制品电荷异质体的分离分析，具体是指一种基于等度洗脱的离子交换色谱法快速分离蛋白制品的电荷异质体。
背景技术
重组蛋白制品在其生产(包括细胞培养、纯化、制剂生产等环节)、存储、运输及使用过程中，各种因素使其蛋白表面会发生修饰、降解等，造成表面电荷的差异，使蛋白具有电荷异质性；另外，宿主细胞自身产生的及生产过程中引入的杂质，也会造成蛋白的异质性。然而，重组蛋白类药物的结构及药性会受到电荷异质体不同程度上的影响。因此，控制电荷异质体是评价重组蛋白制品生产工艺及其质量的重要因素。
离子交换色谱(IEC)是一种分离分析电荷异质体的有效且应用广泛的方法，同时，该色谱法也可以对蛋白质的特征进行定量及定性分析。研究人员利用离子交换色谱法对PD-1单克隆抗体的电荷异质体进行检测并收集，并结合其他表征手段研究抗PD-1的结构及生物学功能。离子交换色谱法多采用梯度洗脱，包括盐梯度和pH梯度；然而，无论是盐梯度还是pH梯度，梯度洗脱的方式均需要工作者探究梯度变化的条件，比如梯度变化时间、比例等，继而不断优化以达到良好的分离效果，这势必耗费大量的人力、物力及财力，尤其对于开发多个不同项目的企业或机构都是不利的。因此，对离子交换色谱检测方法的改进、优化势在必行。
发明内容
本发明的目的在于提供一种基于等度洗脱的新型电荷异质体的分离方法及其应用。分离蛋白制品电荷异质体的离子交换色谱法是依据带电荷的蛋白与带相反电荷固定相之间结合力的不同，从而达到分离的目的。基于等度洗脱的离子交换色谱法操作简便、分离效率高、重复性好、准确度高且适用性广。
本发明所提供的基于等度洗脱对蛋白质制品电荷异质体的分离方法，包括下述步骤：使用等度洗脱的离子交换色谱法对蛋白质制品中的电荷异质体进行分离。
所述蛋白质制品可为重组蛋白制品，所述重组蛋白制品包括PD-1抗体，所述PD-1抗体可为PD-1单克隆抗体或PD-1多克隆抗体，所述PD-1单克隆抗体具体可选自下述任一种：HL02及HL03。
所述HL02为Roche生产的曲妥珠单抗，商品名称为Herceptin；所述HL03为Roche生产的利妥昔单抗，商品名称为MabThera。
所述蛋白质制品可为蛋白质或蛋白质加工品。
所述蛋白质可为活性蛋白质或灭活蛋白质。
所述蛋白质可为天然蛋白质或人工蛋白质。
作为本发明的优选技术方案，所用流动相为90-110mM KH2PO4溶液，具体值为100mM。
优选地，使用NaOH调节所述流动相的pH值为6.00-6.20，具体值为6.10。
优选地，所述流动相的流速为0.45-0.55mL/min，具体值为0.5mL/min。
作为本发明的优选技术方案，所述离子交换色谱法中使用的离子交换色谱柱为带羧酸基团的阳离子交换色谱柱，具体的所述阳离子交换色谱柱可为BioLC ProPac WCX-10,4×250mm,10μm。
作为本发明的优选技术方案，所述离子交换色谱法采用的检测器为紫外检测器，检测波长为200-300nm，具体值为280nm。
优选地，所述离子交换色谱法中采用的色谱柱的温度为30-40℃，具体值为35℃。
优选地，所述离子交换色谱法中样品的进样体积为25-35uL，具体值为30uL。
优选地，所述离子交换色谱法中样品的进样浓度为2mg/mL。
本发明采用等度洗脱的方式进行离子交换，以分离蛋白制品的电荷异质体。与梯度洗脱相比，本发明具有以下优势：
(1)分离速度快，出峰时间显著缩短；
(2)分离效果好，与梯度洗脱具有相当的分离结果；
(3)适用范围广，同时适用于其它PD-1产品的电荷异质体分离检测。
本发明采用一种新思路对单克隆抗体进行离子交换色谱检测，即以等度洗脱的方式代替传统的IEC梯度洗脱，这一方法显著地缩短了检测时间，提高了工作效率。与梯度洗脱相比，使用等度洗脱的方式不仅可以达到与之相当的分离效果，而且可使出峰时间缩短一倍；与此同时，也精简了实验准备过程，节省下一定的配置资源。另外，该法同时适用于其它PD-1产品项目的电荷异质体分离，这意味着等度洗脱的离子交换色谱法具有广泛应用的潜力。
附图说明
图1为PD-1蛋白制品(HL03)经等度洗脱后的色谱图；
图2为PD-1蛋白制品(HL03)经梯度洗脱后的色谱图；
图3为PD-1蛋白制品(HL02)经等度洗脱后的色谱图；
图4为PD-1蛋白制品(HL02)经梯度洗脱后的色谱图。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中使用的PD-1蛋白制品HL02产自Roche公司，商品名称为Herceptin，生产批号N7282B06；HL03产自Roche公司，商品名称为MabThera，生产批号H0191B10。
实施例1：
(1)样品的制备：HL02、HL03均用超纯水稀释至2mg/mL。稀释后的样品经0.22um滤膜过滤，等待上机；
(2)流动相的配制：配制100mM KH2PO4溶液，并用NaOH精确调节该溶液的pH值至6.10，经0.22um滤膜过滤，加贴标签待用；
(3)使用步骤(2)中流动相，通过高效液相色谱仪对步骤(1)中的样品进行分离分析，色谱条件如下表所示：
表1 HPLC色谱参数——等度洗脱
| 高效液相系统 | Agilent 1260HPLC system |
| 色谱柱 | BioLC ProPac WCX-10,4×250mm,10μm |
| 流速 | 0.5mL/min |
| 紫外检测器波长 | 280nm |
| 进样体积 | 30μL |
| 柱温 | 35℃ |
| 样品盘温度 | 8-12℃ |
| 流动相 | 100mM磷酸二氢钾，pH＝6.10 |
| 洗脱方式 | 等度洗脱 |
| 洗脱时间 | 40min |
图1为HL03经等度洗脱后的色谱图。另外，表2给出了试样HL03梯度洗脱的色谱参数。图2为HL03经梯度洗脱后的色谱图，表3为HL03经两种洗脱方式的数据对比。
表2 HPLC色谱参数——梯度洗脱
表3 HL03经等度洗脱和梯度洗脱分离后的结果对比
从表3中我们可以看出，经两种洗脱方式得到的酸峰、主峰及碱峰的峰面积％基本相当(在阳离子交换色谱法中，主峰之前定义为酸峰，主峰之后定义为碱峰。)；另外，采用等度洗脱的方式可以显著地缩短出峰时间，由梯度洗脱的15.75min缩短至6.35min，这均说明等度洗脱这一方式不仅可以很好地分离电荷异质体，而且大大地降低了出峰时间，具有快速分离的优势。
与此同时，本发明的等度洗脱离子交换色谱法不单单适用于特定的蛋白制品。除HL03外，这一方法同样可以应用于HL02单抗产品的电荷异质体分离分析中。同样地，根据表1等度洗脱和表2梯度洗脱色谱参数分离分析HL02的电荷异质体。图3为HL02经等度洗脱后的色谱图，图4为HL02经梯度洗脱后的色谱图，表4为HL02经等度洗脱和梯度洗脱两种方式的结果对比。
表4 HL02经等度洗脱和梯度洗脱分离后的结果对比
显而易见，采用等度洗脱的离子交换色谱法同样可以用于HL02、HL03的电荷异质体检测分析。以上数据进一步证实相较于普遍的梯度洗脱，离子交换色谱采用等度洗脱这一新方式具有快速分离的特征，而这一点在生物医药分析技术中不容忽视；另外，本发明中给出的等度洗脱离子交换色谱法适用于多种PD-1产品电荷异质体的分离。
综上所述，本发明采用的离子交换色谱由普遍应用的梯度洗脱方式变为等度洗脱，具有简单高效、适用性广等优势。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。
Claims (10)
1.一种蛋白质制品的电荷异质体的分离方法，包括下述步骤：使用等度洗脱的离子交换色谱法对所述蛋白质制品中的电荷异质体进行分离。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述蛋白质制品为重组蛋白质制品，所述重组蛋白制品包括PD-1单克隆抗体；具体的，所述PD-1单克隆抗体选自曲妥珠单抗和/或利妥昔单抗。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述离子交换色谱法中使用的流动相为90-110mM KH2PO4溶液。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述流动相使用H3PO4调节其pH值为6.00-6.20。
5.根据权利要求3或4所述的方法，其特征在于：所述流动相的流速为0.45-0.55mL/min。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其特征在于：所述离子交换色谱法中采用的离子交换色谱柱为带羧酸基团的阳离子交换色谱柱。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的方法，其特征在于：所述离子交换色谱法中使用的离子交换色谱柱的柱温为30-40℃。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的方法，其特征在于：所述离子交换色谱法采用的检测器为紫外检测器，检测波长为200-300nm。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的方法，其特征在于：所述离子交换色谱法中样品的进样体积为25-35uL。
10.根据权利要求1-9中任一项所述的方法，其特征在于：所述离子交换色谱法中样品的进样浓度为2mg/mL。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202010896233.XA CN114113450A (zh) | 2020-08-31 | 2020-08-31 | 一种基于等度洗脱的新型电荷异质体快速分离方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202010896233.XA CN114113450A (zh) | 2020-08-31 | 2020-08-31 | 一种基于等度洗脱的新型电荷异质体快速分离方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN114113450A true CN114113450A (zh) | 2022-03-01 |
Family
ID=80359905
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202010896233.XA Pending CN114113450A (zh) | 2020-08-31 | 2020-08-31 | 一种基于等度洗脱的新型电荷异质体快速分离方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN114113450A (zh) |
Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20050161399A1 (en) * | 2004-01-23 | 2005-07-28 | Amgen Inc. | LC/MS method of analyzing high molecular weight proteins |
| CN105738493A (zh) * | 2014-12-10 | 2016-07-06 | 人福医药集团股份公司 | 二对甲苯磺酸拉帕替尼同分异构体杂质的分析方法 |
| CN106380519A (zh) * | 2016-10-17 | 2017-02-08 | 深圳万乐药业有限公司 | 一种单克隆抗体的纯化方法 |
| CN106399432A (zh) * | 2015-07-31 | 2017-02-15 | 中国科学院大连化学物理研究所 | 一种从单克隆抗体中制备n-连接糖肽的方法及n-连接糖肽 |
| CN106496302A (zh) * | 2015-09-08 | 2017-03-15 | 三生国健药业（上海）股份有限公司 | 一种用离子交换层析纯化蛋白质的方法 |
| CN108101987A (zh) * | 2017-11-17 | 2018-06-01 | 安徽未名生物医药有限公司 | 一种重组抗TNF-α全人源单克隆抗体的纯化方法 |
-
2020
- 2020-08-31 CN CN202010896233.XA patent/CN114113450A/zh active Pending
Patent Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20050161399A1 (en) * | 2004-01-23 | 2005-07-28 | Amgen Inc. | LC/MS method of analyzing high molecular weight proteins |
| CN105738493A (zh) * | 2014-12-10 | 2016-07-06 | 人福医药集团股份公司 | 二对甲苯磺酸拉帕替尼同分异构体杂质的分析方法 |
| CN106399432A (zh) * | 2015-07-31 | 2017-02-15 | 中国科学院大连化学物理研究所 | 一种从单克隆抗体中制备n-连接糖肽的方法及n-连接糖肽 |
| CN106496302A (zh) * | 2015-09-08 | 2017-03-15 | 三生国健药业（上海）股份有限公司 | 一种用离子交换层析纯化蛋白质的方法 |
| CN106380519A (zh) * | 2016-10-17 | 2017-02-08 | 深圳万乐药业有限公司 | 一种单克隆抗体的纯化方法 |
| CN108101987A (zh) * | 2017-11-17 | 2018-06-01 | 安徽未名生物医药有限公司 | 一种重组抗TNF-α全人源单克隆抗体的纯化方法 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Yuk et al. | More similar than different: Host cell protein production using three null CHO cell lines | |
| US11498941B2 (en) | Chromatography | |
| Zhang et al. | Comprehensive analysis of low‐abundance proteins in human urinary exosomes using peptide ligand library technology, peptide OFFGEL fractionation and nanoHPLC‐chip‐MS/MS | |
| CN109946410A (zh) | 一种分析单克隆抗体电荷异质性的离子交换色谱检测方法 | |
| CN114113450A (zh) | 一种基于等度洗脱的新型电荷异质体快速分离方法 | |
| CN111153993A (zh) | 抗TNF-α单克隆抗体的制备方法 | |
| Hock | Bioresponse-linked instrumental analysis | |
| van der Burg et al. | Recent capillary electrophoresis applications for upstream and downstream biopharmaceutical process monitoring | |
| WO2020211584A1 (zh) | 组合物中泊洛沙姆188的检测方法 | |
| CN110923366A (zh) | 在线监控目标蛋白的产量和质量的方法 | |
| CN108072717B (zh) | 一种精氨酸溶液的检测方法 | |
| CN108333264A (zh) | 检测蛋白电荷变异体的方法及确定生物制品生产工艺的方法 | |
| US20070161120A1 (en) | Ceruloplasmin Assay | |
| Alwael et al. | Liquid chromatographic profiling of monosaccharide concentrations in complex cell-culture media and fermentation broths | |
| CN212375283U (zh) | 在线监控目标蛋白的产量和质量的系统 | |
| US20210215647A1 (en) | Liquid chromatography reagent kit | |
| CN114910577A (zh) | 基于树突状细胞判断水产过敏原作用的联合型代谢标志物及其应用和检测试剂盒 | |
| CN110806447B (zh) | 百日咳杆菌气管细胞毒素的筛查方法和含量测定方法 | |
| CN114755321A (zh) | 血清中脂溶性维生素的检测方法 | |
| Kumar et al. | High‐throughput capillary electrophoresis analysis of biopharmaceuticals utilizing sequential injections | |
| CN111298109A (zh) | 利用多模式层析介质Capto adhere去除乙脑疫苗制品中残留宿主DNA的方法 | |
| Hong et al. | Impact of next-generation high productivity perfusion cell culture process on host cell protein profile and a comparison with fed-batch cultures. | |
| CN111983043A (zh) | 注射用重组人尿激酶原原料中泊洛沙姆残留量的检测方法 | |
| CN111366643A (zh) | 一种oled材料中间体的检测方法 | |
| US20240109935A1 (en) | Process for the purification of monoclonal antibodies |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination |