CN105273041A - 一种蛋白质亲和层析洗脱方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种蛋白质亲和层析洗脱方法，更具体地，公开了一种蛋白质亲和层析洗脱方法，其特征在于，在蛋白A亲和层析蛋白质中，使用低pH(例如3.5-4.0)的柠檬酸和精氨酸缓冲液，洗脱蛋白质主峰并回收。该方法能有效去除聚集体和小分子、降低HCP残留、同时避免抗体亲和洗脱浑浊或沉淀现象产生。本方法不仅仅适用于实验室规模，更可以工艺放大，作为生产工艺。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体地说涉及一种蛋白质的亲和层析洗脱方法。
背景技术
治疗性蛋白，尤其是单克隆抗体的出现给免疫预防和治疗带来突破性的进展，抗体以其具有理化性状高度均一、生物活性单一、便于工艺放大及质量保证，以及能与抗原良好的特异性结合，而具有良好的靶向作用等特点，备受亲睐。
亲和层析(affinitychromatographygraphy，AC)是抗体纯化的一种重要的方法，具有很高的选择性、分离性能以及较高的载量，它通常只需要一步处理即可将某种待分离的蛋白质从复杂的蛋白质混合物中分离出来，是分离纯化蛋白质的有力工具。亲和层析技术是基于某种蛋白质所具有的生物学特异性，即蛋白质可与另一种称作配体的大分子能发生特异的可逆结合。所谓的配体是指能被蛋白质所识别并与之结合的原子、原子团或分子。亲和层析的基本原理是：把待纯化的某种蛋白质的特异配体，通过化学反应共价连接到载体表面的功能基上构成配基。载体的性能方面允许蛋白质自由通过，当含有目的蛋白的混合样品加到该配基上时，目的蛋白即和其特异性配体结合而吸附在配体载体的表面，而其他杂质则被洗出。被特异地结合在配基上的目的蛋白质可通过改变缓冲液的条件使之解吸附，并进一步收集。(沈同,王镜岩.生物化学第二版[M]1990,223)
StaphyrococcalProtein(以下简称蛋白A)，来源于微生物的FC受体，其对抗体的FC区域具有极高的结合能力，并且是可逆的。蛋白A亲和层析常常是抗体药物纯化的第一步，它是将蛋白A作为配基固定于载体上，能特异性吸附抗体，而不吸附其他杂质，通过此特点来纯化抗体。
亲和层析虽然能达到很好地捕获抗体的目的，但是在吸附抗体的同时，其它可以和蛋白A结合的杂质同样也和抗体一样结合在蛋白A上，最终和抗体一起解离下来，从而带入纯化的抗体中，从而影响抗体的纯度。随着抗体纯化规模的发展，三步纯化，甚至两步纯化的要求越来越迫切。这就迫切需要一种新的亲和层析洗脱方法，以便进一步提高抗体的纯度。
为了更好对蛋白质进行纯化，某些抗体在纯化过程中，需在极低pH条件下洗脱，例如pH3.0-5.0，但这很容易改变抗体的高级结构，进而导致频繁发生抗体互相结合和聚集。酸性条件下抗体的高级结构的改变，已被Biochemistry等人的研究所证实(Renner,H.Lilie,etal.,Alternativelyfoldedstatesofanimmunoglobulin,Biochemistry30(1991)6922–6929.、或者A.W.P.Vermeer,W.Norde,Thethermalstabilityofimmunoglob-ulin:unfoldingandaggregationofamulti-domainprotein,Bio-phys.J.78(2000)394–404.、或者K.WelXe,R.Misselwitz,G.Hausdorf,W.Hohne,H.WelXe,Con-formation,pH-inducedconformationalchange,andthermalunfoldingofanti-p24(HIV-1)monoclonalantibodyCB4-1anditsFabandFcfragments,Biochim.Biophys.Acta1431(1999)120–131.)。而抗体的大量聚集情况发生，会使洗脱抗体时很容易产生浑浊或沉淀。而且抗体经过低pH后，即使马上调节回中性，高级结构的变化也不会恢复，即该聚集的发生是一个不可逆的过程。为解决这些问题，弓冈良辅等发明了一种通过调整pH至4.0～5.0同时使用含有精氨酸和/或精氨酸衍生物的微酸性缓冲液来防止抗体变性的精制抗体方法，洗脱抗体主峰表现出同pH3.5的柠檬酸缓冲液相同的回收率【专利文献：CN200510004669.6】。
因此，一种能有效去除聚集体和小分子、降低宿主细胞蛋白(Hostcellprotein,HCP)残留、同时避免抗体亲和洗脱浑浊或沉淀现象产生的一种抗体精制方法仍是目前所迫切需要的。
发明内容
本申请的发明人经过大量研究，发明了一种蛋白质亲和层析洗脱方法，其特征在于，在蛋白A亲和层析蛋白质中，使用低pH值(优选pH3.5-4.0)柠檬酸+精氨酸缓冲液，洗脱蛋白质主峰，并回收。从而提高亲和纯化的蛋白质纯度并解决某些蛋白质低pH洗脱出现浑浊和沉淀现象。具体地：
本发明提供了蛋白质亲和层析洗脱方法，蛋白质和蛋白A特异性结合，使用低pH值(优选pH3.5-4.0)的柠檬酸+精氨酸缓冲液作为洗脱液，解离结合在蛋白A上的蛋白质，从而达到纯化蛋白质的目的。本发明中使用的精氨酸优选L-型精氨酸，其水溶性呈强碱性，使用柠檬酸缓冲液调节洗脱液的pH值，优选pH值为3.5-4.0，更优选pH3.7-3.9，最优选pH3.8，这样洗脱溶液即具备了洗脱能力，又具有一定的缓冲能力，保持洗脱过程中抗体持续维持在此pH范围；柠檬酸缓冲液的浓度优选40mmol/L-50mmol/L，更优选45mmol/L-50mmol/L，最优选45mmol/L。精氨酸缓冲液的浓度优选50mmol/L—100mmol/L，更优选50mmol/L—70mmol/L，最优选50mmol/L、70mmol/L或100mmol/L，上述浓度下是兼具蛋白质洗脱能力和工艺放大的成本因素，具体可以根据实际需要适当调节精氨酸的浓度。本发明还提供了一种精纯蛋白质的方法，包括以下步骤：(1)使用中性磷酸盐缓冲液平衡蛋白A层析柱；(2)将含蛋白质的发酵上清液装载于含蛋白A载体的层析柱上；(3)使用中性磷酸盐缓冲液平衡层析柱；(4)使用低pH值(优选pH为3.5-4.0)的柠檬酸和精氨酸缓冲液洗脱蛋白质主峰并回收；(5)使用低pH的柠檬酸缓冲液洗脱再生峰。优选地，该方法步骤(4)中，柠檬酸缓冲液的浓度优选40mmol/L-50mmol/L，更优选45mmol/L-50mmol/L，最优选45mmol/L；精氨酸优选L-型精氨酸，精氨酸的浓度优选50mmol/L—100mmol/L，更优选50mmol/L—70mmol/L，最优选50mmol/L、70mmol/L或100mmol/L；pH值优选3.5-4.0，更优选pH3.7-3.9，最优选pH3.8；另外，优选地，步骤(2)所述载体为含蛋白A的亲和填料，步骤(5)所述pH为3.0以下，更优选pH3.0。
本发明中洗脱液使用的精氨酸主要是L-精氨酸，优选pH为3.5—4.0的酸性缓冲液，柠檬酸缓冲液作为缓冲体系，pH的调节主要使用柠檬酸和氢氧化钠。
本发明中使用的载体主要是含蛋白A亲和层析填料，如：GE的
rProteinA、MabselectSure填料，上海抗体药物国家工程研究中心的protein-A填料等。
本发明使用的蛋白质，只要适合于蛋白A亲和层析的蛋白质，例如抗体、结合FC区域的抗体关联蛋白都可以适用。例如，全人抗体、人源化抗体、嵌合抗体、鼠源抗体等，优选单克隆抗体，包括但不限于西妥昔单抗、贝伐单抗等等。
本发明方法虽然在蛋白质主峰的得率方面基本和柠檬酸洗脱方法的得率相差不大，但是在精纯蛋白质(同pH3.0柠檬酸洗脱相比)的纯度提高方面表现为能够更有效的去除聚集体、小分子，HCP残留、比浊度OD410，具体见本发明的具体实施例。
本发明的方法不仅仅适用于实验室规模，更可以工艺放大，作为生产工艺。
附图说明
图1.西妥昔单抗的精纯试验得到的终产物层析图谱(使用25mmol/L柠檬酸钠缓冲液洗脱抗体主峰)
图2.西妥昔单抗的精纯试验得到的终产物层析图谱(使用45mmol/L柠檬酸+50mmol/L精氨酸洗脱抗体主峰)
图3.西妥昔单抗的精纯试验得到的产物的SEC-HPLC色图谱
图4.西妥昔单抗的精纯试验得到的终产物层析图谱(使用40mmol/L柠檬酸+50mmol/L精氨酸洗脱抗体主峰)
图5.西妥昔单抗的精纯试验得到的终产物层析图谱(使用40mmol/L柠檬酸+70mmol/L精氨酸洗脱抗体主峰)
图6.西妥昔单抗的精纯试验得到的终产物层析图谱(使用40mmol/L柠檬酸+100mmol/L精氨酸洗脱抗体主峰)
图7.西妥昔单抗的精纯试验得到的终产物SEC-HPLC检测色谱图
(使用40mmol/L柠檬酸+50mmol/L精氨酸洗脱抗体主峰)
图8.西妥昔单抗的精纯试验得到的终产物SEC-HPLC检测色谱图
(使用40mmol/L柠檬酸+70mmol/L精氨酸洗脱抗体主峰)
图9.西妥昔单抗的精纯试验得到的终产物SEC-HPLC检测色谱图
(使用40mmol/L柠檬酸+100mmol/L精氨酸洗脱抗体主峰)
图10.贝伐单抗的精纯试验得到的终产物层析图谱(使用50mmol/L柠檬酸+100mmol/L精氨酸洗脱抗体主峰)
图11.贝伐单抗的精纯试验得到的终产物层析图谱(使用25mmol/L柠檬酸缓冲液洗脱抗体主峰)
图12.贝伐单抗的精纯试验得到的终产物SEC-HPLC检测色谱图(使用50mmol/L柠檬酸+100mmol/L精氨酸洗脱抗体主峰)
图13.贝伐单抗的精纯试验得到的终产物SEC-HPLC检测色谱图(使用25mmol/L柠檬酸缓冲液洗脱抗体主峰)
图14.西妥昔单抗中试规模精纯试验得到的终产物层析图谱(使用45mmol/L柠檬酸+100mmol/L精氨酸洗脱抗体主峰)
图15.西妥昔单抗中试规模精纯试验得到的终产物层析图谱(使用25mmol/L柠檬酸缓冲液洗脱抗体主峰)
图16.西妥昔单抗中试规模精纯试验得到的终产物SEC-HPLC检测色谱图
具体实施方式
以下实施例仅仅对本发明进行进一步的说明，不应理解为对本发明的任何限制。
本发明中使用的检测设备主要有：
SEC-HPLC液相检测设备：液相色谱系统DionedUItimate3000，色谱柱TSKG300SWXL，流动相：200mMoL/L磷酸缓冲液，pH：6.8，流速：0.5ml/min
比浊度：OD410检测使用紫外分光光度计Lambda350.5mL，以Q水作为背景
HCP残留检测：
试剂盒：GYGNUSTECHNOLOGIES公司CHO宿主蛋白含量酶联反应检测试剂盒，Lot：22713
设备：MolecularDevices公司spectraMAX190，
检测波长：405nm、492nm(参比)
实施例1西妥昔单抗的精纯
实验例1：使用25mmol/L柠檬酸缓冲液洗脱抗体主峰
层析柱：XK16/20(通用电气公司GE)
填料：rProteinA(通用电气公司GE)1cv＝31mLH＝15.4cmflow＝3.1ml/min
层析系统：AKTAPurifier
操作系统：unicorn系统(通用电气公司GE)
样品来源：中性含抗体(西妥昔单抗)的发酵上清液(来源苏州康宁杰瑞生物科技有限公司)
溶液：
平衡液：20mmol/LPB+150mmol/LNaCLpH：7.0
洗脱液：25mmol/L柠檬酸缓冲液pH：3.0
实验操作流程：平衡3cv—上样—平衡4cv—洗脱3cv—平衡3cv—消毒—平衡3cv—保存20％乙醇2cv
主峰收集如下：
抗体主峰：洗脱液开始洗脱后以UV280nm为判断标准，从UV吸收值在50mAu开始收集，当UV吸收值下降到50mAu停止收集。层析图谱见图1
实验例2：使用45mmol/L柠檬酸+50mmol/L精氨酸洗脱抗体主峰
层析柱：XK16/20(通用电气公司GE)
填料：rProteinA(通用电气公司GE)1cv＝31mLH＝15.4cmflow＝3.1ml/min
层析系统：AKTAPurifier，
操作系统：unicorn系统(通用电气公司GE)
样品来源：中性含抗体(西妥昔单抗)的发酵上清液(来源苏州康宁杰瑞生物科技有限公司)
溶液：
平衡液：20mmol/LPB+150mmol/LNaCLpH：7.0
洗脱液：45mmol/L柠檬酸+50mmol/L精氨酸pH：3.8
再生液：25mmol/L柠檬酸缓冲液pH：3.0
实验操作流程：平衡3cv—上样—平衡4cv—洗脱5cv—再生3cv—平衡3cv—消毒—平衡3cv—保存20％乙醇2cv
收集峰如下：
抗体主峰：洗脱液开始洗脱后以UV280nm为判断标准，从UV吸收值在50mAu开始收集，当UV吸收值下降到50mAu停止收集
再生峰：再生液开始洗脱后以UV280nm为判断标准，从UV吸收值在50mAu开始收集，当UV吸收值下降到50mAu停止收集。
层析图谱见图2。
实验例1和实验例2的洗脱主峰SEC-HPLC、比浊度检测结果见表1，
回收的抗体用凝胶色谱分析，分析结果见图3(其中，编号1为实验例1抗体，编号2为实验例2抗体)，可见精制抗体的色谱图出峰时间和天然抗体的峰完全一致。从表1的分子筛凝聚色谱分析(SEC-HPLC)检测结果来看，本发明方法洗脱的抗体在去除聚集体和小分子上明显优于柠檬酸洗脱；将实验例2再生时洗脱下的再生峰，通过凝胶色谱分析，可以明显发现有大量的聚集体和小分子，进一步证明本发明在去除聚集体和小分子方面有良好的效果；从比浊度的结果也能明显看出，精氨酸洗脱方法能有效降低亲和层析洗脱抗体主峰的比浊度。
实验例3：使用40mmol/L柠檬酸+50mmol/L或70mmol/L或100mmol/L精氨酸洗脱抗体主峰
层析柱：XK16/20(通用电气公司GE)
填料：rProteinA(通用电气公司GE)1cv＝22mLH＝10.94cmflow＝2.2ml/min
层析系统：AKTAPurifier，
操作系统：unicorn系统(通用电气公司GE)
样品来源：中性含抗体(西妥昔单抗)的发酵上清液(来源苏州康宁杰瑞生物科技有限公司)
溶液：
分别用洗脱液1、2、3进行实验：实验操作流程：平衡3cv—上样—平衡4cv—洗脱5cv—再生3cv—平衡3cv—消毒—平衡3cv—保存20％乙醇2cv
收集峰如下：
抗体主峰：洗脱液开始洗脱后以UV280nm为判断标准，从UV吸收值在50mAu开始收集，当UV吸收值下降到50mAu停止收集
再生峰：再生液开始洗脱后以UV280nm为判断标准，从UV吸收值在50mAu开始收集，当UV吸收值下降到50mAu停止收集。
洗脱液1、2、3的层析图谱分别见图4-6。洗脱液1、2、3洗脱下的抗体主峰分别以凝胶过滤层析色谱分析，SEC-HPLC检测图谱见图7-9，也可见以下表2。
从SEC-HPLC检测结果来看，洗脱液1、2、3洗脱抗体主峰的SEC-HPLC纯度基本保持在99％左右，柠檬酸+不同浓度精氨酸的洗脱液均能很好的保持SEC-HPLC纯度。
实施例2贝伐单抗的精纯
实验例4使用50mmol/L柠檬酸+100mmol/L精氨酸洗脱抗体主峰
层析柱：XK16/20(通用电气公司GE)
填料：rProteinA(通用电气公司GE)1cv＝7mLH：3.5cm
flow＝0.7ml/min
层析系统：AKTAPurifier
操作系统：unicorn系统(通用电气公司GE)
样品来源：中性含抗体(贝伐单抗)的发酵上清液(来源苏州康宁杰瑞生物科技有限公司)
溶液：
平衡液：20mmol/LPB+150mmol/LNaCLpH：7.0
洗脱液：50mmol/L柠檬酸+100mmol/L精氨酸pH：4.0
再生液：25mmol/L柠檬酸缓冲液pH：3.0
实验操作流程：平衡3cv—上样—平衡4cv—洗脱6cv—再生3cv—
平衡3cv—消毒—平衡3cv—保存20％乙醇2cv
收集峰如下：
抗体主峰：洗脱液开始洗脱后以UV280nm为判断标准，从UV吸收值在50mAu开始收集，当UV吸收值下降到50mAu停止收集
再生峰：再生液开始洗脱后以UV280nm为判断标准，从UV吸收值在50mAu开始收集，当UV吸收值下降到50mAu停止收集
层析图谱见图10
实验例5使用25mmol/L柠檬酸缓冲液洗脱抗体主峰
层析柱：XK16/20(通用电气公司GE)
填料：rProteinA(通用电气公司GE)1cv＝7mLH：3.5cm
flow＝0.7ml/min
层析系统：AKTAPurifier
操作系统：unicorn系统(通用电气公司GE)
样品来源：中性含抗体(贝伐单抗)的发酵上清液(来源苏州康宁杰瑞生物科技有限公司)
溶液：
平衡液：20mmol/LPB+150mmol/LNaCLpH：7.0
洗脱液：25mmol/L柠檬酸缓冲液pH：3.0
实验操作流程：平衡3cv—上样—平衡4cv—洗脱3v—平衡3cv—消毒—平衡3cv—保存20％乙醇2cv
抗体主峰：洗脱液开始洗脱后以UV280nm为判断标准，从UV吸收值在50mAu开始收集，当UV吸收值下降到50mAu停止收集。
层析图谱见图11
实验例4和实验例5的SEC-HPLC和比浊度检测结果见表3，
实验例4和实验例5洗脱下的抗体主峰以凝胶过滤层析色谱分析，SEC-HPLC检测结果图谱如图12、图13。可以很明显的看出，本发明的洗脱方法，在去除聚集体方面有明显的优势，检测结果如表3，从SEC-HPLC的色谱图中也可以看出，柠檬酸+精氨酸洗脱的抗体主峰去除前端聚集体明显。
回收的抗体测试比浊度，从测试结果来看，实验例4洗脱的抗体主峰比浊度仅是实验例5洗脱抗体主峰的四分之一。在实验中肉眼也能明显观察到，实验例4洗脱的抗体主峰明显澄清于实验例5洗脱抗体主峰。
实施例3西妥昔单抗中试规模精纯
为进一步说明本发明的洗脱方法，具有良好的工艺放大可行性，可以适用于生产，进行300L发酵规模抗体(西妥昔单抗)中试纯化生产。
实验例6：使用45mmol/L柠檬酸+100mmol/L精氨酸洗脱抗体主峰
层析柱：BPG300/500(通用电气公司GE)
填料：MabselectSure(通用电气公司GE)1cv＝8LH：11.3cm
流速：0.8L/min
层析系统：AKTAProcess(通用电气公司GE)
操作系统：unicorn系统(通用电气公司GE)
样品来源：中性含抗体(西妥昔单抗)的发酵上清液(来源上海抗体药物国家工程研发中心有限公司)载量：20mg/mL
溶液：
平衡液：20mmol/LPB+150mmol/LNaCLpH：7.0
洗脱液：45mmol/L柠檬酸+50mmol/L精氨酸pH：3.5
再生液：25mmol/L柠檬酸缓冲液pH：3.0
实验操作流程：平衡3cv—上样—平衡4cv—洗脱6cv—再生3cv—
平衡3cv—消毒—平衡3cv—保存20％乙醇2cv
收集峰如下：
抗体主峰：洗脱液开始洗脱后以UV280nm为判断标准，从UV吸收值在50mAu开始收集，当UV吸收值下降到50mAu停止收集
再生峰：再生液开始洗脱后以UV280nm为判断标准，从UV吸收值在50mAu开始收集，当UV吸收值下降到50mAu停止收集，
层析图谱见图14
实验例7使用25mmol/L柠檬酸缓冲液洗脱抗体主峰
层析柱：XK16/20(通用电气公司GE)
填料：MabselectSure(通用电气公司GE)1cv＝22.5mL
流速：2.2mL/min
层析系统：AKTAPurifier(通用电气公司GE)
操作系统：unicorn系统(通用电气公司GE)
样品来源：中性含抗体(西妥昔单抗)的发酵上清液(来源上海抗体药物国家工程研发中心有限公司，样品来源和实验例5所用样品来源为同一批)
载量：20mg/mL
溶液：
平衡液：20mmol/LPB+150mmol/LNaCLpH：7.0
洗脱液：25mmol/L柠檬酸缓冲液pH：3.0
实验操作流程：平衡3cv—上样—平衡4cv—洗脱3v—平衡3cv—消毒—平衡3cv—保存20％乙醇2cv
抗体主峰：洗脱液开始洗脱后以UV280nm为判断标准，从UV吸收值在50mAu开始收集，当UV吸收值下降到50mAu停止收集
层析图谱见图15。
实验例6和实验例7的洗脱主峰SEC-HPLC、比浊度、HCP残留、得率结果见表4.
SEC-HPLC检测结果也可见图16(其中，编号1为实验例6抗体，编号2为实验例7抗体)。从检测结果来看，精氨酸洗脱的抗体主峰在纯度SEC-HPLC、主峰HCP残留，比浊度方面都优于柠檬酸洗脱抗体主峰，精氨酸洗脱方式的得率和柠檬酸的相差不大。本发明的洗脱方法是一种适合工艺放大，应用于生产规模的发明。
Claims (10)
1.一种蛋白质亲和层析洗脱方法，其特征在于，在蛋白A亲和层析蛋白质中，使用低pH值的柠檬酸和精氨酸缓冲液，洗脱蛋白质主峰并回收。
2.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述pH值为3.5-4.0。
3.根据权利要求1或2所述方法，其特征在于，所述精氨酸缓冲液的浓度为50mmol/L-100mmol/L。
4.根据权利要求3所述方法，其特征在于，所述柠檬酸缓冲液的浓度为40mmol/L-50mmol/L。
5.根据权利要求4所述方法，其特征在于，所述柠檬酸缓冲液浓度为45mmol/L，所述精氨酸缓冲液的浓度为50mmol/L—100mmol/L。
6.根据权利要求5所述方法，其特征在于，所述柠檬酸缓冲液浓度为45mmol/L，所述精氨酸缓冲液的浓度为50mmol/L、70mmol/L或100mmol/L，所述pH值为3.8。
7.一种精纯蛋白质的方法，包括以下步骤：
(1)使用中性磷酸盐缓冲液平衡蛋白A层析柱；
(2)将含蛋白质的发酵上清液装载于含蛋白A载体的层析柱上；
(3)使用中性磷酸盐缓冲液平衡层析柱；
(4)使用pH值为3.5-4.0的柠檬酸和精氨酸缓冲液洗脱蛋白质主峰并回收；
(5)使用低PH的柠檬酸缓冲液洗脱再生峰。
8.根据权利要求7所述方法，其特征在于，步骤(4)所述的精氨酸缓冲液的浓度为50mmol/L-100mmol/L。
9.根据权利要求8所述方法，其特征在于，步骤(4)所述的柠檬酸缓冲液的浓度为40mmol/L-50mmol/L，步骤(2)所述载体为含蛋白A的亲和填料，步骤(5)所述PH值为3.0以下。
10.上述1-9任一所述方法，其特征在于，所述蛋白质是抗体，是鼠源抗体、嵌合抗体、人源化抗体、全人抗体，是单克隆抗体，是西妥昔单抗、贝伐单抗。
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201410322501.1A CN105273041A (zh) | 2014-07-08 | 2014-07-08 | 一种蛋白质亲和层析洗脱方法 |
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