CN108059650A - 低pH病毒灭活工艺中的纯化方法 - Google Patents

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孙李靖
沈克强
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Abstract

本发明公开一种低pH病毒灭活工艺中的纯化方法，包括步骤：1)低pH病毒灭活：使用酸性溶液将ProteinA亲和层析纯化后的洗脱蛋白溶液调节pH至3.6，所述酸性溶液为磷酸；2)中和：用碱性溶液中和低pH处理后的蛋白溶液，调节pH至5.5；3)过滤：静置至少0.5h后用0.2μm滤膜过滤。采用本发明的纯化方法可以在低pH病毒灭活工艺中显著降低HCP和ResDNA等杂质，纯化效果明显，大大减轻后续纯化工艺的压力。

Description

低pH病毒灭活工艺中的纯化方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及单抗或Fc融合蛋白生产下游工艺的低pH病毒灭活工艺步骤中提升除杂效果的纯化方法。
背景技术
随着CHO细胞大规模培养技术的发展，细胞的蛋白表达水平得到了很大的提高，但伴随培养过程中外源营养物质的大量添加和细胞密度的呈数量级的增加，所以细胞培养产物中的成分越来越复杂，这些成分中的主要污染物包括HCP和ResDNA。宿主细胞蛋白(HostCell Protein，HCP)是指来源于宿主细胞的蛋白质成分，是制备抗体类药物(包括抗体及FC融合蛋白)过程中需要去除的杂质。由于HCP的主要成分是蛋白质，即使很小的剂量，都有可能引发机体产生过敏反应。此外，部分HCP本身具有蛋白酶活性，残留在抗体类药物中，可能导致蛋白药物降解，最终影响药效。如果残留的HCP与抗体类药物之间存在相互作用，有可能阻断抗体类药物的活性位点，也会导致药效降低。
因此，为了保证病人用药的安全性，这些过程相关的杂质需要被清除到一个低的水平，无论是在抗体类药物制备的小试还是在放大阶段都是需要特别注意的，建立有效的去除宿主蛋白HCP的下游工艺条件并且在每一步工艺后有效的监控宿主蛋白HCP的去除效率，最终使其含量符合标准也是非常必要的。
现阶段单克隆抗体下游工艺平台一般主要包括发酵液澄清、粗纯步骤、病毒灭活与过滤、精纯步骤、超滤浓缩。其中，去除HCP等杂质主要是通过发酵液澄清深层过滤、粗纯步骤的 Protein A亲和层析、精纯步骤中的离子层析(阴离子交换层析和阳离子交换层析)来达到去除目的。细胞表达产物有潜在的病毒安全性风险，因此要求纯化工艺中有病毒清除的能力，在单抗或Fc融合蛋白下游工艺平台中多采用低pH值孵育进行病毒灭活。低pH病毒灭活工艺一般是先将调节pH值至约3，维持至少1-2h，然后回调pH至蛋白稳定的pH值(比如pH 5.5)以实现低pH病毒灭活。现有技术中还见未报道利用低pH病毒灭活工艺作为主要的纯化步骤的技术方案。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于，利用单抗生产下游工艺的低pH病毒灭活工艺来实现对HCP和ResDNA等杂质的纯化，能够在完成低pH病毒灭的同时达到显著去除HCP和ResDNA 等杂质的效果。
为解决上述技术问题，本发明提供一种低pH病毒灭活工艺中的纯化方法，包括以下步骤：
1)低pH病毒灭活：使用酸性溶液将ProteinA亲和层析纯化后的洗脱蛋白溶液调节pH 至3.6，所述酸性溶液为磷酸；
2)中和：用碱性溶液中和低pH处理后的蛋白溶液，调节pH至5.5；
3)过滤：静置至少0.5h后用0.2μm滤膜过滤。
具体的，所述磷酸的浓度为0.5～2M；更优选为1～1.5M；最优选为1M。
具体的，所述碱性溶液包括现有低pH病毒灭活工艺中常用的中和酸性的碱性溶液；优选的，所述碱性溶液为1M Tris-HCl溶液；优选的，所述Tris-HCl溶液的pH为9.0。
具体的，所述滤膜为PES滤膜。
具体的，所述方法还包括在步骤2)和/或步骤3)中检测样品浊度、SEC-HPLC、HCP和ResDNA来评估除杂效果。
具体的，过滤前，至少静置1h；优选的，静置1～3h；更优选的，静置约2h。
具体的，所述酸性溶液可以选自0.3M盐酸、1M柠檬酸，也具有除杂效果。
经仔细研究发现，低pH病毒灭活的过程中蛋白的溶液环境的变化会导致蛋白溶液中出现不同程度的混浊现象，原因是溶液中的蛋白产生了一些不溶性杂质，这些不溶性杂质包括例如：HCP、DNA(ResDNA)、聚体、脂类蛋白等。现有的灭活工艺中并未重视这一现象，仅采取简单过滤操作后进行后续的精纯步骤和超滤浓缩，给后续的纯化工艺带来了很大的压力。
本申请深入研究低pH病毒灭活工艺条件，并检测低pH病毒灭活工艺中的样品浊度、 SEC-HPLC、HCP和ResDNA等参数变化，发现酸性溶液的选择对低pH病毒灭活工艺中纯化效果影响非常显著。经筛选发现，盐酸、柠檬酸及磷酸均具有导致浑浊的效果，其中使用盐酸、磷酸(比如0.3M盐酸、0.5～2M磷酸)效果更好一些，最优选是使用1M磷酸，能够在病毒灭活过程中使HCP、ResDNA等杂质析出，再通过0.2μm滤膜过滤可有效除去相关杂质，进而减轻后续工艺去除工艺相关杂质的压力。
具体实施方式
下面将对本发明的技术方案进行清楚、完整的描述，显然，所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1低pH病毒灭活中使用1M柠檬酸为酸性溶液
在低pH病毒灭活步骤中，现有的工艺条件为：将1M柠檬酸缓慢加入用ProteinA亲和层析纯化的洗脱蛋白溶液中，调节pH至3.6，然后再用碱性溶液1M Tris-HCl,pH9.0调节pH 至5.5，室温静置2小时后检测样品浊度，再将蛋白样品用0.2μm滤膜过滤后进行浊度测定，并送测SEC-HPLC、HCP和ResDNA以评估杂质去除能力。
实施例2低pH病毒灭活中使用0.3M盐酸为酸性溶液
在低pH病毒灭活步骤中，将0.3M盐酸缓慢加入同一种用ProteinA亲和层析纯化的洗脱蛋白溶液中，调节pH至3.6，然后再用碱性溶液1M Tris-HCl,pH9.0调节pH至5.5，室温静置2小时后检测样品浊度，再将蛋白样品用0.2μm滤膜过滤后进行浊度测定，并送测 SEC-HPLC、HCP和ResDNA以评估杂质去除能力。
实施例3低pH病毒灭活中使用1M磷酸为酸性溶液
在低pH病毒灭活步骤中，将1M磷酸缓慢加入同一种用ProteinA亲和层析纯化的洗脱蛋白溶液中，调节pH至3.6，然后再用碱性溶液1M Tris-HCl,pH9.0调节pH至5.5，室温静置2小时后检测样品浊度，再将蛋白样品用0.2μm滤膜过滤后进行浊度测定，并送测 SEC-HPLC、HCP和ResDNA以评估杂质去除能力。
空白对照：取同一种用ProteinA亲和层析纯化的洗脱蛋白溶液，直接测SEC-HPLC、HCP 和ResDNA。
比较实施例1-3和空白对照的检测结果，具体见表1。
表1.低pH病毒灭活中酸性溶液筛选结果
如表1所示，1M柠檬酸、0.3M盐酸和1M磷酸对杂质均有一定的去除能力。其中，0.3M盐酸对杂质的去除效果较好，主要体现在0.2μm滤膜过滤前浊度较高为98.6，0.2μm滤膜过滤后浊度最低为8.29，HCP和ResDNA下降幅度明显，分别为1964ppm和6.61pg/mg，相比空白对照分别下降了40.5％和95.7％。而1M磷酸处理后的蛋白样品在过滤前浊度为104，过滤后浊度为7.6，处理前后浊度下降幅度最大为13.7倍，HCP和ResDNA分别为1199ppm 和5.64pg/mg，相比空白对照分别下降了63.2％和96.4％，除杂效果更加明显，表明用1M磷酸处理得到的蛋白样品形成的不溶性沉淀最多，同时SEC-HPLC单体纯度最高，说明1M磷酸相对较温和，对蛋白的破坏程度最低。
综上所述，上述各实施例仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限定本发明的保护范围，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，皆应包含在本发明的保护范围内。

Claims (14)

1.一种低pH病毒灭活工艺中的纯化方法，其特征在于，包括步骤：
1)低pH病毒灭活：使用酸性溶液将ProteinA亲和层析纯化后的洗脱蛋白溶液调节pH至3.6，所述酸性溶液为磷酸；
2)中和：用碱性溶液中和低pH处理后的蛋白溶液，调节pH至5.5；
3)过滤：静置至少0.5h后用0.2μm滤膜过滤。
2.如权利要求1所述的纯化方法，其特征在于，所述步骤1)中，磷酸的浓度为0.5～2M。
3.如权利要求2所述的纯化方法，其特征在于，所述步骤1)中，磷酸的浓度为1～1.5M。
4.如权利要求3所述的纯化方法，其特征在于，所述步骤1)中，磷酸的浓度为1M。
5.如权利要求1所述的纯化方法，其特征在于，所述步骤2)中，碱性溶液包括现有低pH病毒灭活工艺中常用的中和酸性的碱性溶液。
6.如权利要求5所述的纯化方法，其特征在于，所述步骤2)中，碱性溶液为1M Tris-HCl溶液。
7.如权利要求6所述的纯化方法，其特征在于，所述Tris-HCl溶液的pH为9.0。
8.如权利要求1所述的纯化方法，其特征在于，所述步骤3)中，滤膜为PES滤膜。
9.如权利要求1所述的纯化方法，其特征在于，所述步骤3)中，过滤前至少静置1h。
10.如权利要求9所述的纯化方法，其特征在于，所述步骤3)中，过滤前静置1～3h。
11.如权利要求10所述的纯化方法，其特征在于，所述步骤3)中，过滤前静置2h。
12.如权利要求1所述的纯化方法，其特征在于，所述方法还包括检测样品浊度、SEC-HPLC、HCP和ResDNA来评估除杂效果。
13.如权利要求1所述的纯化方法，其特征在于，所述酸性溶液选自0.3M盐酸或1M柠檬酸。
14.一种蛋白或蛋白溶液，其特征在于，是通过权利要求1-13任一项所述的纯化方法所获得。
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