CN104364648B - 用于生产葡萄糖聚合物和葡萄糖聚合物的水解产物的净化回路的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种通过使用采用细胞系的炎症应答体外试验,用于确定生产步骤或纯化步骤对葡萄糖聚合物或葡萄糖聚合物的水解产物中促炎污染分子的存在或性质的影响的方法。本发明进一步涉及一种生产或纯化葡萄糖聚合物或葡萄糖聚合物的水解产物的优化方法,包括分析葡萄糖聚合物或葡萄糖聚合物的水解产物中的促炎污染分子以及选择相对于促炎污染分子的存在或性质被优化的生产或纯化步骤。
Description
本发明涉及用于生产或纯化葡萄糖聚合物,更具体地是目的在于食品行业(富含纤维的健康成分)和医学领域(腹膜透析)的那些,或葡萄糖聚合物的水解产物,更具体地是目的在于医学领域(可注射的非热原性葡萄糖)的那些的净化回路的方法。
发明的技术背景
本申请公司已经选择在如下领域研发其发明,该领域因微生物来源的污染物能够在用于生产葡萄糖聚合物的回路中、或在用于生产其水解产物的那些回路中发展的风险而众所周知,所述污染物可能导致以下各项:
-食物中毒,
-对人类健康危害很大的炎症反应。
因此在食品安全方法的背景下,如在健康安全方法的背景下,重要地是通过所有适当的技术手段,特别是通过以下各项来确保不存在处于活细胞形式和处于细胞碎片形式两者的微生物来源的污染物:
-通过设置适当的纯化装置和技术限定安全生产回路,
-用于有效鉴别和测定污染物的方法的限定。
例如,在腹膜透析的情况下,必需在严格的净度条件下制备一定量的成分。
腹膜透析事实上是一种类型的透析,它的目的是除去肾不能成功地或者不再能成功地从血浆纯化的废物,例如脲、肌酸酐、过量的钾或过剩水。这种医学处理适用于终末期慢性肾衰竭的情况。
最常使用的透析液由在酸性pH(5.2-5.5)或生理pH(7.4)下的缓冲溶液(乳酸盐缓冲溶液或碳酸氢盐缓冲溶液)构成,向其中添加电解质(钠、钙、镁、氯)并且尤其是渗透剂(葡萄糖或葡萄糖聚合物,例如存在于由巴克斯特公司(Baxter)销售的流动腹膜透析液中的“艾考糊精(icodextrin)”)。
作为渗透剂,葡萄糖聚合物,如上文提到的艾考糊精,相对于葡萄糖是优选的,原因在于快速跨过腹膜的葡萄糖因其小尺寸而导致在2至4小时的输注中渗透梯度的丧失。
在将葡萄糖聚合物用于连续流动式腹膜透析的更具体领域中,非常快地变得明显的是,这些淀粉水解物(葡萄糖的混合物和葡萄糖低聚物和聚合物的混合物)不能够按照原样使用。
欧洲专利申请EP 207 676传授在水中形成10%浓度的清澈和无色溶液的葡萄糖聚合物是优选的,所述葡萄糖聚合物具有5000至100 000道尔顿的重均分子量(Mw)和小于8000道尔顿的数均分子量(Mn)。
这类葡萄糖聚合物还优选地包含其分子量在5000和50 000道尔顿之间的至少80%葡萄糖聚合物,很少或没有葡萄糖或葡萄糖聚合物,其中DP小于或等于3(分子量504)以及很少或没有葡萄糖聚合物,其中分子量大于100 000(DP约600)。
换言之,优选的葡萄糖聚合物是具有低多分散性指数(通过计算Mw/Mn比率所获得的值)的葡萄糖聚合物。
在所述专利申请EP 207 676中建议的用于从淀粉水解物获得这些具有低多分散性指数的葡萄糖聚合物的方法在于:
-用水混溶性溶剂进行麦芽糊精的分级沉淀,
-或者通过拥有适当的截留或排除阈值的不同膜对相同麦芽糊精进行分子过滤。
在这两种情况中,这些方法目的在于移除非常高分子量的聚合物以及低分子量单体或寡聚物两者。
然而,就它们的实现方式而言并且就它们使可能获得的产品的产率和质量而言,这些方法并不令人满意。
在有兴趣发展一种用于产生具有优选小于2.5的低多分散性指数、优选具有小于8000道尔顿的Mn、并且具有在12 000和20 000道尔顿之间的Mw的完全水溶性葡萄糖聚合物的方法中,所述方法没有现有技术的缺点,本申请公司在它的专利EP 667 356中努力解决此问题,通过从水解淀粉而非麦芽糊精开始。
通过色谱分级所获得的葡萄糖聚合物则优选含有少于3%的葡萄糖和少于3%的具有小于或等于3的DP的葡萄糖聚合物,以及少于0.5%的具有大于600的DP的葡萄糖聚合物。
这种葡萄糖聚合最终由腹膜透析领域的专家接受,在于因其渗透能力使用的这些葡萄糖聚合物是完全令人满意的。
然而,微生物污染意在用于腹膜透析的这些制品的风险是令人痛惜的。
事实上已知用于葡萄糖聚合物的生产回路可能受微生物或所述微生物中所含的促炎物质污染。
例如淀粉工业中描述了玉米或小麦淀粉受酵母、霉菌以及细菌型微生物,并且更具体地受酸热脂环酸芽孢杆菌(Alicyclobacillus acidocaldarius)型的嗜酸热细菌(在回路的热区域以及酸性区域生长的嗜极性细菌)污染。
接受这些污染产品的患者的主要风险则是腹膜炎。
腹膜炎的这些发作是通过腹膜内细菌感染引起的,并且通过阳性透析液培养通常易于建立诊断。
“无菌性腹膜炎”,其被描述为无菌、化学或培养物阴性腹膜炎,就其本身来说一般由化学刺激物或异物引起。
自从引入艾考糊精用于制备腹膜透析液以来,已经报告了无菌性腹膜炎的孤立病例,这些病例可能与不同原因相关,并且特别由可能存在的促炎物质诱导。
无菌炎性发作因此是注射透析液后所观察到的主要并发症。
虽然这些炎性发作的某些与化学性质关联(意外注射化学污染物或某些化合物的不正确剂量),但是大部分病例与用来制备透析液的溶液中出现的微生物源污染物存在直接相连。
脂多糖(LPS)和肽聚糖(PGN)是甚至以痕量存在时导致引发炎症的高风险的主要微生物源污染物。
此外,本申请公司的荣誉在于也已经考虑到存在这样的分子,这些分子能够加重这些污染物,例如PGN解聚产物(其仍有生物活性的最少结构是胞壁酰二肽(MDP))引起的炎症应答。
单独考虑时,这些衍生物在体外不是非常有炎性的并且针对大于1μg/ml的值给出显著应答。
除PGN解聚产物之外,甲酰化微生物肽,其原型是f-MLP(甲酰基-Met-Leu-Phe三肽),也具有实质性的协同活性。最初,这些肽因它们对白细胞的趋化剂活性而鉴定,尽管它们不能诱导细胞因子反应本身。
因此重要的不是忽略这些“小分子”,因为它们可以通过加重痕量PGN和/或LPS的作用间接地引起无菌炎性发作。
药典提出了如下一连串的用于检测热原性物质的测试:
-用于检测是革兰氏阴性细菌的主要组分的细菌内毒素(LAL测试),
-兔热原测试。
虽然总体上是可靠的,但是这两种测试具有它们的局限。兔热原测试是基于热原性物质的间接检测,通过测量注射含有这些物质的产品的兔的体温升高(发热反应)。
如果不希望的物质具有太弱的生物活性或者浓度太低而不能诱导全身生热反应,此测试会产生假阴性。
此外,此物质可能具有足以产生局部炎性反应的生物活性或浓度。
LAL测试,就其本身而言,只检测细菌内毒素(LPS)以及还有β-葡聚糖,它们是真菌菌群的壁组分。未检测其他生物杂质(DNA、肽聚糖等)。
因此对于某些情况,用含有艾考糊精的腹膜透析液观察到的无菌性腹膜炎的表现证明了一些物质可以逃过在药典中描述的测试并且可能造成不希望的临床效果的方式。
为纠正此情况,BAXTER公司已经建议进行检测革兰氏阳性微生物污染物的努力。
特别是,在它的专利EP 1 720 999中,BAXTER公司提出特别是在用于制备腹膜透析液的葡萄糖聚合物中发展基于检测肽聚糖的方法,肽聚糖是革兰氏阳性菌细胞膜的主要组分。
换言之,为防止出现这些无菌腹膜炎发作,BAXTER公司针对腹膜透析液的产生以及使用建议了一个将检测腹膜透析液中的肽聚糖的方案。
此外,虽然在这一专利EP 1 720 999中提到葡萄糖聚合物的上游处理,这一处理仅借助能够这样截留肽聚糖的亲和性树脂。
因此没有预想以这样一种方式修饰用于生产葡萄糖聚合物的方法,该方式使最终产物不含有酸热环状脂肪酸芽孢杆菌型嗜酸热细菌的或这些具体细菌的细胞膜碎片的污染。
另一方面,在其国际专利申请WO 2010/125315中,借助制备和纯化安全方法,本申请公司提供用于具有更好的品质的腹膜透析的物质,在这种情况下是葡萄糖聚合物,用来确保这些物质有效地不含有污染物质。
本申请公司已经实施一种值得注意的纯化方法,结合一定数量的以适合预防任何污染的方式组织的用活性炭/颗粒状炭黑处理、过滤(微量过滤和超滤)、以及热处理的步骤。
然而,可以对这一方法进行改进,并且本申请公司已经致力于研发比现有技术中可得的那些更加有效的检测和测定方法,以更好地限定为了确保生产线(特别是葡萄糖聚合物)的最佳安全性而有待实施的关键方法步骤。
在上述所有中,借助制备和纯化安全方法,仍然存在对于提供用于具有更好的品质的治疗应用的物质的未满足的需求,在这种情况下是葡萄糖聚合物及其水解产物,用来确保这些物质有效地不含有污染物质。
因此本申请公司已经发现通过实施适当的纯化步骤可以满足这一需求,借助于用于检测和测定污染物的完全特异的方法,可以测量这些纯化步骤的效力。
经过过去数年,已经开发了使用原代细胞的许多试验,以便替代炎症应答试验中的动物模型。
然而,这些体外模型遭受巨大的个体间变异性,这可能是实验偏倚的原因。
相反,单核细胞细胞系给出恒定反应,由此解释了目前正在开发的试验为何日益使用培养的这种类型细胞。然而,这些试验具有对溶液中作为混合物存在的全部污染物给出总体炎症应答的缺点,并且因此导致不可能表征污染物的性质。
还重要地指出,对于炎症急性期细胞因子(例如TNF-α(肿瘤坏死因子α))、IL-1β(白介素1β)和趋化因子(例如CCL5(趋化因子(C-C单元)配体5))/RANTES(激活时受调节,正常T-细胞表达和分泌),加重的炎症应答是可见到的,但是对于IL-6(白介素6),不是或几乎不是可见的。
因此,基于后者产生的方法(US 2009/0239819和US2007/0184496)不适合检测溶液中作为混合物的污染物。
本申请公司已经得出以下结论:
(i)难以检测生物溶液中以痕量存在的细菌性污染物,
(ii)重要地是不限于检测PGN和LPS,原因在于协同作用,
(iii)需要开发灵敏和可重复的新检测方法,并且
(iv)有利地是使用能够表征污染物性质的灵敏和可重复的检测方法。
因此本申请公司的荣誉在于已经开发了用于检测具有促炎作用的微生物污染物的灵敏且有效方法,低于目前使用和/或文献中描述的程序的灵敏度阈值,并且随后在于鉴定了源自生产回路的批次中以痕量存在的促炎分子的家族或甚至其性质。
发明概述
本发明涉及一种用于试验一个生产步骤或多个生产步骤对葡萄糖聚合物或其水解产物中促炎分子的存在或其性质的影响或一个纯化步骤或多个纯化步骤对葡萄糖聚合物或其水解产物中促炎分子的存在或其性质的效力的方法,该方法包括:
a)提供葡萄糖聚合物或其水解产物;
b)任选地,检测或测定步骤a)中提供的葡萄糖聚合物或其水解产物中的促炎分子;
c)对步骤a)中提供的葡萄糖聚合物或其水解产物进行该一个或多个生产或纯化步骤;
d)检测或测定步骤c)后获得的葡萄糖聚合物或其水解产物中的促炎分子;
e)确定步骤c)对促炎分子的存在或性质的效力或效果;
其中用于检测或测定这些葡萄糖聚合物或其水解产物中的促炎分子的步骤包括使用细胞系进行的体外炎症应答试验,该细胞系是巨噬细胞或巨噬细胞-分化的细胞系,或是表达一种或多种TLR(Toll样受体)或NOD(含有核苷酸结合性寡聚结构域的蛋白)受体,例如,TLR2、TLR4或NOD2的细胞,并且使得检测该一个或多个受体、或其组合的应答成为可能。
本发明还涉及一种用于生产或纯化葡萄糖聚合物或其水解产物的优化方法,该优化方法包括:
a)提供葡萄糖聚合物或其水解产物;
b)检测或测定步骤a)中提供的葡萄糖聚合物或其水解产物中的促炎分子;
c)选择用于生产或纯化这些葡萄糖聚合物或其水解产物的一个或多个步骤,这个或这些步骤适用于葡萄糖聚合物或其水解产物中存在的促炎分子;
d)任选地,对步骤a)中提供的葡萄糖聚合物或其水解产物进行该一个或多个选择的生产或纯化步骤;并且
e)任选地,检测或测定步骤d)后获得的葡萄糖聚合物或其水解产物中的促炎分子;
其中用于检测或测定这些葡萄糖聚合物或其水解产物中的促炎分子的步骤包括使用细胞系进行的体外炎症应答试验,该细胞系是巨噬细胞或巨噬细胞-分化的细胞系,或是表达一种或多种TLR(Toll样受体)或NOD(含有核苷酸结合性寡聚结构域的蛋白)受体,例如,TLR2、TLR4或NOD2的细胞,并且使得检测该一个或多个受体、或其组合的应答成为可能。
在一个第一方面,该体外炎症应答试验可以包括使得这些葡萄糖聚合物或其水解产物与MDP-或LPS-敏化的、巨噬细胞-分化的THP-1细胞系相接触,通过测量由该细胞系产生的RANTES或TNF-α的量来检测或测定这些促炎分子。
在一个第二方面,该体外炎症应答试验可以包括使得这些葡萄糖聚合物或其水解产物与用报告基因转染的巨噬细胞系相接触,该报告基因的转录是在炎症信号通路的直接控制下,例如Raw-BlueTM系,通过测量该报告基因的活性或信号来检测或测定这些促炎分子。
在一个第三方面,该体外炎症应答试验可以包括使得这些葡萄糖聚合物或其水解产物与表达TLR2受体和报告基因的细胞系相接触,该报告基因的转录是在TLR2信号通路的直接控制下,例如HEK-BlueTM hTLR2系,通过测量该报告基因的活性或信号来检测或测定这些促炎分子。
在一个第四方面,该体外炎症应答试验可以包括使得这些葡萄糖聚合物或其水解产物与表达NOD2受体和报告基因的细胞系相接触,该报告基因的转录是在NOD2信号通路的直接控制下,例如HEK-BlueTM hNOD2系,通过测量该报告基因的活性或信号来检测或测定这些促炎分子。
在一个第五方面,该体外炎症应答试验可以包括使得这些葡萄糖聚合物或其水解产物与表达TLR4受体和报告基因的细胞系相接触,该报告基因的转录是在TLR4信号通路的直接控制下,例如HEK-BlueTM hTLR4系,通过测量该报告基因的活性或信号来检测或测定这些促炎分子。
在一个第六方面,该体外炎症应答试验可以包括使得这些葡萄糖聚合物或其水解产物与以下各项相接触:
a.MDP-或LPS-敏化的、巨噬细胞-分化的THP-1细胞系,通过测量由该细胞系产生的RANTES或TNF-α的量来检测或测定这些促炎分子;和/或
b.用报告基因转染的巨噬细胞系,该报告基因的转录是在炎症信号通路的直接控制下,例如Raw-BlueTM系,通过测量该报告基因的活性或信号来检测或测定这些促炎分子;和/或
c.表达TLR2受体和报告基因的细胞系,该报告基因的转录是在TLR2信号通路的直接控制下,例如HEK-BlueTM hTLR2系,通过测量该报告基因的活性或信号来检测或测定这些促炎分子;和/或
d.表达NOD2受体和报告基因的细胞系,该报告基因的转录是在NOD2信号通路的直接控制下,例如HEK-BlueTM hNOD2系,通过测量该报告基因的活性或信号来检测或测定这些促炎分子;和/或
e.表达TLR4受体和报告基因的细胞系,该报告基因的转录是在TLR4信号通路的直接控制下,例如HEK-BlueTM hTLR4系,通过测量该报告基因的活性或信号来检测或测定这些促炎分子;和/或
f.未经免疫受体转染的对照系。
在一个第七方面,该体外炎症应答试验可以包括使得这些葡萄糖聚合物或其水解产物与以下各项相接触:
a.用报告基因转染的巨噬细胞系,该报告基因的转录是在炎症信号通路的直接控制下,例如Raw-BlueTM系,通过测量该报告基因的活性或信号来检测或测定这些促炎分子;
b.表达TLR2受体和报告基因的细胞系,该报告基因的转录是在TLR2信号通路的直接控制下,例如HEK-BlueTM hTLR2系,通过测量该报告基因的活性或信号来检测或测定这些促炎分子;和/或
c.表达TLR4受体和报告基因的细胞系,该报告基因的转录是在TLR4信号通路的直接控制下,例如HEK-BlueTM hTLR4系,通过测量该报告基因的活性或信号来检测或测定这些促炎分子;和/或
d.表达NOD2受体和报告基因的细胞系,该报告基因的转录是在NOD2信号通路的直接控制下,例如HEK-BlueTM hNOD2系,通过测量该报告基因的活性或信号来检测或测定这些促炎分子;和
e.未经免疫受体转染的对照系,例如HEK-BlueTM Null2系。
优选地,这些促炎分子是细菌来源的分子,优选地选自PGN、LPS、脂肽、PGN解聚产物,特别是MDP、甲酰化微生物肽例如f-MLP、以及β-葡聚糖。
优选地,该一个或多个生产或纯化步骤选自以下步骤:热处理、酸化、穿过活性炭、穿过吸附树脂、超滤、过滤、或化学或酶水解。
优选地,这些葡萄糖聚合物选自艾考糊精和麦芽糊精,特别是分枝的或未分枝的麦芽糊精,并且这些葡萄糖聚合物水解产物是完全水解的产物,例如,一水右旋糖。
预过滤葡萄糖聚合物或其水解产物的样品,特别是用30kDa的截取阈值,并且使得该滤液与本试验中使用的细胞系相接触。
发明详细说明
本发明因此涉及一种用于试验一个生产步骤或多个生产步骤对葡萄糖聚合物或其水解产物中促炎分子的存在或其性质的效果或影响或一个纯化步骤或多个纯化步骤对葡萄糖聚合物或其水解产物中促炎分子的存在或其性质的效力的方法,该方法包括:
a)提供葡萄糖聚合物或其水解产物;
b)任选地,检测或测定步骤a)中提供的葡萄糖聚合物或其水解产物中的促炎分子;
c)对步骤a)中提供的葡萄糖聚合物或其水解产物进行该一个或多个生产或纯化步骤;
d)检测或测定步骤c)后获得的葡萄糖聚合物或其水解产物中的促炎分子;
e)确定步骤c)对促炎分子的存在或性质的效力或效果;
其中用于检测或测定这些葡萄糖聚合物或其水解产物中的促炎分子的步骤包括使用细胞系进行的体外炎症应答试验,该细胞系是巨噬细胞或巨噬细胞-分化的细胞系,或是表达一种或多种TLR(Toll样受体)或NOD(含有核苷酸结合性寡聚结构域的蛋白)受体,例如,TLR2、TLR4或NOD2的一种细胞,并且使得检测该一个或多个受体、或其组合的应答成为可能。
该方法可以包括,特别是在步骤e)背景下,步骤b)和d)中检测或测定的、这些葡萄糖聚合物或其水解产物中的促炎分子的比较。因此,促炎分子或这些分子中的一些的量的减少指示生产或纯化步骤对这些葡萄糖聚合物或其水解产物净化的效力。促炎分子的量和性质将由下文详细描述的方法确定。
具体地,本发明的目标是研发一种优化方法,用于净化葡萄糖聚合物或其水解产物,特别是用于制备腹膜透析液的葡萄糖聚合物,该方法优选地包括通过体外炎症应答试验来检测或测定促炎分子。
具体地,一旦已经表征这些纯化或生产步骤对促炎分子的效果或效力,特别是根据其存在及其性质,考虑到存在于这些葡萄糖聚合物或其水解产物中的促炎分子,本领域的普通技术人员能够选择最适合的步骤。因此,该优化方法包括:
a)提供葡萄糖聚合物或其水解产物;
b)检测或测定步骤a)中提供的葡萄糖聚合物或其水解产物中的促炎分子;
c)选择用于生产或纯化这些葡萄糖聚合物或其水解产物的一个或多个步骤,这个或这些步骤适用于葡萄糖聚合物或其水解产物中存在的促炎分子;
d)任选地,对步骤a)中提供的葡萄糖聚合物或其水解产物进行该一个或多个选择的生产或纯化步骤;并且
e)任选地,检测或测定步骤d)后获得的葡萄糖聚合物或其水解产物中的促炎分子;
其中用于检测或测定这些葡萄糖聚合物或其水解产物中的促炎分子的步骤包括使用细胞系进行的体外炎症应答试验,该细胞系是巨噬细胞或巨噬细胞-分化的细胞系,或是表达一种或多种TLR(Toll样受体)或NOD(含有核苷酸结合性寡聚结构域的蛋白)受体,例如,TLR2、TLR4或NOD2的细胞,并且使得检测该一个或多个受体、或其组合的应答成为可能。
这些葡萄糖聚合物或其水解产物可以用于腹膜透析、肠内及肠胃外给食和新生婴儿给食。
在一个优选实施例中,将在本发明背景下制备的葡萄糖聚合物是艾考糊精或麦芽糊精(分枝或不分枝的,如将在下文描述的)。
在此提及的葡萄糖聚合物水解产物具体地被认为是完全水解的产物,例如,在本申请公司的商标PF下销售的非热原性的一水右旋糖。
它们可以在其制备的一个或多个阶段,并且特别是在原料水平、在其制备方法中的任何步骤和/或在该方法的成品水平被净化。
因此,在根据本发明的方法中提供的葡萄糖聚合物或其水解产物对应于原料、对应于在制备方法中的任何水平的产物或对应于成品。
这些促炎污染物尤其是细菌来源的分子。它们具体可以是PGN、LPS、脂肽、PGN解聚产物,特别是MDP、甲酰化微生物肽例如f-MLP、β-葡聚糖,等。
为了监控用于制备于人类中用作治疗性用途的葡萄糖聚合物(例如,腹膜透析液)的方法的净化步骤的效力,在本发明背景下使用的、用于体外测量炎症应答的方法基于细胞试验(“生物测定”),使用单核细胞/巨噬细胞型细胞系(THP-1、和/或Raw-BlueTM)以及表达天然免疫的特异性受体的、经转染的细胞系(HEK-BlueTM)。
THP-1系(88081201,ECACC)是人幼单核细胞系。对于促炎应答试验,这些细胞在佛波醇酯(PMA)存在下持续3日分化成单核细胞/巨噬细胞。
对于根据本发明进行的这些试验,巨噬细胞或巨噬细胞分化的细胞,特别是巨噬细胞分化的THP-1细胞在MDP,特别是金黄色葡萄球菌(S.aureus)MDP存在下被敏化。这是因为MDP是一种弱炎症性诱导物,但是已知其与其他炎症性分子协同作用。这种特性基于以下事实:这些分子经由干预除MDP,尤其是TLR之外的受体发挥作用。因此,MDP的存在将加剧由葡萄糖聚合物或其水解产物溶液中存在的污染物诱导的炎症应答,由此使得可能检测低剂量的污染物。优选地,将MDP以多于1μg/ml的浓度、优选地以1和100μg/ml之间的浓度添加至样品。在一个相当特别优选的实施例中,将MDP以10μg/ml的浓度添加至样品。
可替代地,巨噬细胞或巨噬细胞分化的细胞,特别是巨噬细胞分化的THP-1细胞,可以在除MDP之外的分子的存在下被敏化。事实上,还可以使用LPS,特别是来自大肠杆菌的LPS。可以将其以至少10pg/ml的浓度,例如以25pg/ml的浓度添加至样品。
在一个优选实施例中,将巨噬细胞或巨噬细胞分化的细胞、特别是巨噬细胞分化的THP-1细胞以0.5和1×106个细胞/ml培养基之间、优选地0.7和0.8×106个细胞/ml之间和甚至更优选地约0.75×106个细胞/ml的密度使用。
该体外炎症应答试验基于由THP-1细胞敏化的RANTES生产的测量。这是因为先前研究表明这种趋化因子的测定适合用于检测葡萄糖聚合物溶液中的低剂量的污染物,特别是内毒素。可替代地,该体外炎症应答试验还可以基于由敏化的THP-1细胞生产的TNF-α的测量。这些细胞因子的测定可以通过本领域普通技术人员熟知的任何手段并且特别是通过ELISA实施。在一个优选实施例中,该试验包括在刺激8小时后测量TNF-α的产生。在另一个优选实施例中,该试验包括在刺激20h后,特别是借助ELISA测定法测量RANTES的产生。
这个第一试验使得可能去检测葡萄糖聚合物或其水解产物被PGN和/或LPS、优选地被PGN(中等大小(特别是约120kDa))和/或LPS、甚至更具体地被LPS污染。
该Raw-BlueTM系是用报告基因转染的小鼠巨噬细胞系,该报告基因产生一种分泌形式的碱性磷酸酶(SEAP:分泌型胚性碱性磷酸酶),其转录处于炎症性信号通路的直接控制下。这个系的优点是它天然地表达几乎全部天然免疫受体,包括TLR2、TLR4和NOD2受体。因此,这些细胞将响应于大多数炎症性污染物,并且该响应将通过测量产生的SEAP的酶活性来监控。优选地,这个系以约0.5×106个细胞/孔的细胞密度在本试验中使用。这使得葡萄糖聚合物或其水解产物的制剂与这些细胞接触持续约16至24h。
这些细胞系,特别是HEK-BlueTM(InvivoGen公司),是通过用编码天然免疫受体(特别是人(h)受体)的载体稳定转染来修饰的。它们还与报告基因,特别是产生SEAP的报告基因共转染,其合成处于与过表达的受体相关的信号通路的直接控制下。优选地,这种报道基因编码有色蛋白或荧光蛋白或编码可以在底物存在或不存在下测量其活性的蛋白。这种报告基因的信号的活性的检测表明该样品含有能够激活一种或多种天然免疫受体和能够触发炎症性反应的污染物。这类系的使用使得可能根据表达的受体靶向微生物源分子的某些家族。优选地,使用表达hTLR2或hTLR4或hNOD2的细胞系。此外,还使用不表达天然免疫受体的对照系。该对照系的使用对于验证葡萄糖聚合物或其水解产物溶液不经由寄生机制,例如,毒性机制诱导报告基因产生是有用的。
对于根据本发明的试验,优选使用四个系:
-HEK-BlueTM hTLR2系:这个系表达特异性响应于TLR2激动剂的hTLR2受体(尤其是PGN和脂肽)。它的使用因此使得可能知道这些污染物在触发炎症应答中的水平,
-HEK-BlueTM hTLR4系:这个系表达特异性响应于LPS的hTLR4受体。它的使用因此使得可能知道这些污染物在触发炎症应答中的水平,
-HEK-BlueTM hNOD2系:这个系表达特异性响应于NOD2激动剂的hNOD2受体。它的使用因此使得可能知道MDP和相关分子在触发炎症应答中的水平,
-HEK-BlueTM Null2系:它是未经免疫受体转染的对照系。它的使用是必须的,以验证葡萄糖聚合物或其水解产物溶液不经由毒性机制诱导SEAP产生。
然而,应当指出本领域技术人员也可以使用其他可商业获得系(Imgenex公司)或他们可以制备这些系。
在一个优选的实施例中,这些细胞系以0.5和1×106个细胞/ml培养基的密度使用,并且使得葡萄糖聚合物或其水解产物的制剂与这些细胞接触持续约16至24h。
可以通过剂量-应答曲线实施对这些污染物的定量。这种剂量-应答曲线可以特别是用相同的细胞在相同条件下伴以递增剂量的污染物时产生。这些剂量-应答曲线具体地用LPS、PGN、脂肽、β-葡聚糖和MDP标准品产生。优选地,这种剂量-应答曲线可以针对以下各项而生成:表达TLR4的细胞(例如,THP-1、HEK-BlueTM hTLR4和Raw-BlueTM),具有递增剂量的LPS产生;针对表达TLR2(例如,THP-1、HEK-BlueTM hTLR2和Raw-BlueTM),具有递增剂量的PGN产生;并且针对经由NOD2反应的细胞(例如,HEK-BlueTM hNOD2),具有递增剂量的MDP产生。
在具体实施例中,该THP-1、Raw-BlueTM和HEK-BlueTM系用递增浓度的标准品孵育,并且通过针对THP-1系通过ELISA定量RANTES产生以及针对Raw-BlueTM和HEK-BlueTM系,通过报告基因,特别是SEAP酶活性的测量,来测量细胞应答。
根据本发明的试验使得可能辨别能够触发炎症反应的一种或多种污染物。因此,表达NOD2,特别是HEK-BlueTM hNOD2的系使得可能相当具体地检测PGN解聚产物和MDP污染、优选地MDP污染。表达TLR2,特别是HEK-BlueTM hTLR2和/或Raw-BlueTM的系使得可能相当具体地检测PGN污染。另外,巨噬细胞、特别是THP-1巨噬细胞,以及表达TLR4,特别是HEK-BlueTM hTLR4的系使得可能相当具体地检测LPS污染。
在一个优选的实施例中,该体外炎症应答试验包括使用以下细胞系的试验:
-巨噬细胞,特别是THP-1巨噬细胞;使得可能检测TLR2受体活性的细胞系,特别是HEK-BlueTM hTLR2系;使得可能检测TLR4受体活性的细胞系,特别是HEK-BlueTM hTLR4系;使得可能检测NOD2受体活性的细胞系,特别是HEK-BlueTM hNOD2系;以及可任选地,但是优选地,对照系,特别是HEK-BlueTM Null2系;或
-用报告基因转染的巨噬细胞的细胞系,特别是Raw-BlueTM系;使得可能检测TLR2受体活性的细胞系,特别是HEK-BlueTM hTLR2系;使得可能检测TLR4受体活性的细胞系,特别是HEK-BlueTM hTLR4系;使得可能检测NOD2受体活性的细胞系,特别是HEK-BlueTM hNOD2系;以及可任选地,但是优选地,对照系,特别是HEK-BlueTM Null2系。
在该优选实施例中,使用上述五种细胞类型对不同样品中污染物的存在进行试验,以使得知道常规炎症应答,还有针对某些污染物的特异性应答:
-MDP-敏化的THP-1系:对于LPS具有强反应性的任何污染物,
-Raw-BlueTM系:对于PGN具有强反应性的任何污染物,
-HEK-BlueTM hTLR2系:PGN和其他TLR2配体(脂肽等),
-HEK-BlueTM hTLR4系:LPS,
-HEK-BlueTM hNOD2系:MDP和PGN解聚产物,
-HEK-BlueTM Null2系:阴性对照。
在根据本发明的方法中,该一个或多个生产或纯化步骤可以选自以下步骤:热处理、酸化、穿过活性炭、穿过吸附树脂、超滤、过滤、或化学或酶水解、或其组合。针对每一步骤,可以试验不同参数,使得可能选择最有效的那些。例如,在穿过活性炭的情况下,可以试验不同品质的活性炭及其组合。在超滤的情况下,将可能试验不同截取阈值和/或组合它们。在热处理的情况下,将可能改变处理温度及时间。在酶处理的情况下,将可能改变所使用的一种或多种酶,它们的浓度及其处理条件。
在一个非常具体的实施例中,对以在非热原性水(例如,注射剂)中32%(重量/体积)而制备的样品进行这些处理,并且然后将这些溶液通过0.22μm过滤。对于这些细胞试验,将这些样品稀释为在细胞培养基中的1/10(最终浓度:3.2%(w/v))。
在进行试验以检测或测定促炎分子之前,葡萄糖聚合物或其水解产物的样品可以另外经受酶或化学处理或经受过滤步骤。任选地,可以对这些处理或过滤步骤之前以及之后获得的结果进行比较。
由此,葡萄糖聚合物或其水解产物的样品在该试验之前可以用变溶菌素进行处理。这种酶,借助其胞壁酸酶活性,能够使PGN解聚。例如,可以在样品存在下,放置浓度约2500U/ml的该酶,任选地进行稀释,从而具有7.5%至37.5%(重量/体积)的葡萄糖聚合物浓度,持续6至16h,优选地约16h。如此处理的样品然后将经历根据本发明的用一种或多种细胞系进行的试验。
可替代地,葡萄糖聚合物或其水解产物制剂的样品可以在该试验之前进行过滤。这种过滤的目的基本上旨在移除高分子量分子,如高分子量PGN,并且旨在对滤液实施试验以便相当具体地分析小尺寸污染物。过滤的截留阈值可以,例如,在30kD和150kD之间,优选地在30kD和100kD之间或在30kD和50kD之间,并且特别是约30kD。在一个优选实施例中,这些细胞试验在通过过滤获得的部分上进行,特别是具有30和100kDa的截取阈值。优选地,通过超滤实施过滤。它也可以通过本领域技术人员已知的任何手段实施。因此,如此过滤样品,滤液将经历根据本发明的细胞试验。不过滤或过滤之前获得的这些结果的比较将使得可能推导小尺寸分子的具体炎性贡献。此外,这使得可能证实生产或纯化步骤是否改变污染物的大小(水解与聚集相比较)、和/或未去除限定大小的某些污染物。
此外,用溶菌酶和/或β-葡聚糖酶处理样品使得可能消除PGN和/或β-葡聚糖,并且因此可以已知可能在污染批次中存在的其他TLR2激动剂(糖脂和脂肽)的意义。
在根据本发明方法的一个优选实施例中,在未过滤的样品上进行一个第一系列的细胞试验,从而测量应答(不考虑这些分子的大小)并预防这些分子之间可能的协同效应。然后,在一个第二系列中,对通过超滤(截取阈值:30和100kDa)获得的部分进行这些细胞试验,从而证实这些处理是否改变污染物的大小(水解与聚集相比较)、和/或未去除限定大小的某些污染物。
为了示例本发明的方法,针对多种不同的葡萄糖聚合物基质和一个批次的葡萄糖聚合物水解产物进行不同净化步骤:
-葡萄糖聚合物,艾考糊精原料(在根据发明EP 667 356的传授进行层析分离之前),
-一个批次的艾考糊精,
-一个批次的分枝麦芽糊精,由本申请公司在商标名FB06下销售,
-一个批次的制备的一水右旋糖,从而在注射溶液中进行调制,由本申请公司在商标名PF下销售,
-一个批次的高度分枝的可溶性葡萄糖聚合物,根据本申请公司是所有人的国际专利申请WO 2007/099212的传授进行制备,
-一种商业麦芽糊精。
保留的处理是:
-热处理,例如:
o 70℃和/或
o 120℃,
-酸化,
-穿过不同品质的活性炭,例如:
o SX+,来自诺芮特公司(NORIT)
o SX2,来自诺芮特公司(NORIT),
o C EXTRA USP,来自诺芮特公司,
o A SUPRA EUR,来自诺芮特公司,
o ENO-PC,来自CECA公司,
o L4S,来自CECA公司,
o L3S,来自CECA公司,
o CSA,来自CECA公司,
-穿过吸附树脂,
o Amberlite XAD-4,来自罗门哈斯公司(Rohm&Haas),
o Amberlite XAD-761,来自罗门哈斯公司(Rohm&Haas),
o Amberlite XAD-1600,来自罗门哈斯公司(Rohm&Haas),
o Amberlite XAD-16HP(=FPX66),来自陶氏公司(Dow),
o Dowex SD2,来自陶氏公司(Dow),
o Macronet MN-100,来自漂莱特公司(Purolite),
o Macronet MN-150,来自漂莱特公司(Purolite),
-具有不同截取阈值的超滤,例如
-5kDa;
-30kDa;
-使用特异性酶进行的酶水解,例如:
oβ-1,3-葡聚糖酶,
o蛋白酶,
o具有甘露聚糖酶活性的酶制剂(例如,由诺维信公司(NOVOZYMES)销售,用于其洗涤和澄清特性),
o具有内切-β-葡聚糖酶活性的酶制剂(例如,Tl,由专业酶和生物技术公司(Specialty Enzymes and Biotechnologies Co.)生产并且由先进酶技术有限公司(Advanced Enzyme Technologies Ltd.)销售),
o具有酸蛋白酶活性的酶制剂(例如,FL100,由专业酶和生物技术公司生产并且由先进酶技术有限公司销售)。
本发明将借助以下实例更清晰地理解,这些实例意在是示意性的而非限制性的。
附图简要说明
图1:Raw-BlueTM细胞对标准品激动剂的应答。
图2:HEK-BlueTM TLR2细胞对标准品激动剂的应答。
图3:HEK-BlueTM TLR4细胞对标准品激动剂的应答。
图4:HEK-BlueTM NOD2细胞对标准品激动剂的应答。
图5:HEK-BlueTM裸细胞对标准品激动剂的应答。
图6:由非过滤的基质并且在穿过100kDa和30kDa过滤器之后诱导的Raw-BlueTM细胞应答。
图7:由非过滤的基质并且在穿过100kDa和30kDa过滤器之后诱导的HEK-BlueTMTLR2细胞应答。
图8:由非过滤的基质并且在穿过100kDa和30kDa过滤器之后诱导的HEK-BlueTMTLR4细胞应答。
图9:由非过滤的基质并且在穿过100kDa和30kDa过滤器之后诱导的HEK-BlueTMNOD2细胞应答。
图10:由这些基质诱导的HEK-BlueTM裸细胞应答。
图11:不同基质的炎症性活性的评估
图12:由穿过炭SX+之后的基质诱导的细胞应答。
图13:由穿过不同炭之后的E3063基质诱导的细胞应答。
图14:由穿过不同炭之后的E1565基质诱导的细胞应答。
图15:由穿过不同炭之后的E1242基质诱导的细胞应答。
图16:由穿过不同炭之后的Lab3943基质诱导的细胞应答。
图17:通过5kDa超滤处理之后,由E1565基质诱导的细胞应答。
图18:通过5kDa超滤处理之后,由Lab3943基质诱导的细胞应答。
图19:处理之后,由E3063和E5250基质诱导的细胞应答。
图20:TL处理之后,由E5250基质诱导的细胞应答。
图21:FL100处理之后,由E3063基质诱导的细胞应答。
图22:工业树脂处理之后,由E1565基质诱导的细胞应答。
实例
实例1:剂量-应答曲线的建立
使用以下标准品激动剂分子产生剂量-应答曲线:LPS、PGN、LTA、酵母聚糖和MDP。使用递增浓度的激动剂孵育Raw-BlueTM和HEK-BlueTM TLR2、TLR4、NOD2以及裸系并且通过定量SEAP活性(图1-5)测量细胞应答。TNF-α用作所有细胞激活的阳性对照:
-Raw-BlueTM系:这些细胞应答于可能存在于葡萄糖聚合物基质以及衍生物中的大多数炎症性分子(PGN、LPS、酵母聚糖、LTA);特别地,相对于PGN,它们具有强反应性,但是不响应于其解聚产物(MDP)。
-HEK-BlueTM hTLR2系:相对于PGN具有强反应性;这些细胞对其他TLR2配体(LTA、酵母聚糖)的响应更加弱并且相对于LPS和MDP不显示反应性。
-HEK-BlueTM hTLR4系:相对于LPS具有强反应性;这些细胞对酵母聚糖的响应非常弱并且相对于PGN、LTA和MDP不显示反应性。
-HEK-BlueTM hNOD2系:相对于MDP具有强反应性。
-HEK-BlueTM Null2系:缺乏细胞毒性的对照。
实例2:多种不同的葡萄糖聚合物基质的制备和一个批次的葡萄糖聚合物水解产物的制备
如上指出的,这些基质如下:
-5种葡萄糖聚合物,艾考糊精原料(在根据发明EP 667 356的传授进行层析分离之前),在此称作E1565、E3063、E1242、E5248和E5250。
根据专利申请WO 2012/059685的传授进行这五种聚合物的制备;
-一个污染批次的艾考糊精(在此称作E209J)以及一个“标准”批次的艾考糊精,即用于这些细胞试验中的非污染物对照(在此称作P11-11)。根据专利EP 667 356的传授制备这些批次,详细描述于专利申请WO 2010/125315的实例1中;
-一个批次的分枝麦芽糊精,由本申请公司在商标名FB06下销售;
-一个批次的一水右旋糖,进行制备从而在注射溶液中进行调制,由本申请公司在商标名PF下销售;
-一个批次的高度分枝的可溶性葡萄糖聚合物,用于腹膜透析,在此称作LAB3943。
根据专利申请WO 2007/099212中的实例2,通过使用分枝酶和淀粉葡糖苷酶的双酶处理,制备这个批次。
-一种商业麦芽糊精(嘉吉麦芽糊精(Cargill maltodextrin),C*Dry MD 01915,批号02044770),在此称作嘉吉(Cargill)。
实例3:由未处理的或穿过100kDa或30kDa过滤器后的样品诱导的细胞应答的分析
这些试验的目标是确定存在于这些葡萄糖聚合物基质和该批次的葡萄糖聚合物水解产物中的污染物的促炎反应性以及性质。
在非热原性水(例如,注射剂)中以32%(重量/体积)制备根据实例2的这些样品。
在使用SLP-HS和LAL测定进行的细胞试验之前,进行LPS和PGN水平的测定(数据示于下文):
对于这些细胞试验,将这些样品稀释为在细胞培养基中的1/10(最终浓度:3.2%(w/v))。
对以下各项进行分析:
-Raw-BlueTM系:对于PGN具有高反应性的任何污染物,
-HEK-BlueTM hTLR2系:对于PGN具有高反应性,
-HEK-BlueTM hTLR4系:对于LPS具有高反应性,
-HEK-BlueTM hNOD2系:MDP和PGN解聚产物,
-HEK-BlueTM Null2系:缺乏细胞毒性的对照。
基于细胞类型的结果呈现于图6至10中。
Raw细胞应答(图6):
除嘉吉基质(给出相当于在非污染物对照P11-11的存在下观察到的响应)例外,所有其他样品一旦接触巨噬细胞系都触发炎症应答。最具反应性的基质是E-3063(细胞应答的饱和度),然后是E-1242和E-1565。
这些污染物本质上是高分子量的(例如,PGN、酵母聚糖)或能够形成聚集体(例如,LPS、LTA)的分子。确实,在100kDa下进行的过滤大大降低了由这些样品诱导的应答,指示这种处理在一定程度上去除它们。仅E-1242和E-5250基质仍然具有显著高于P11-11的活性,指示它们包含具有尺寸<100kDa的污染物,这很可能来源于较大污染物的降解。在30kDa下进行的过滤甚至更加有效,因为在处理之后,这些不同样品事实上丧失了其全部促炎活性。
HEK-TLR2细胞应答(图7):
用这些HEK-TLR2细胞获得的结果证实了前述结果。
该E-3063基质诱导饱和应答,由此指示非常高的TLR2诱导剂污染水平。E-1242、E-1565、Lab3943和Ico-E209J基质还给出了高应答,其高于Raw细胞中观察到的那些。这一差异由以下事实解释:它们负荷有TLR2的强诱导物(PGN或脂肽)。
在100kDa和在30kDa下的这些过滤中和了由这些样品诱导的炎症应答,指示这些污染物主要是高分子量的PGN。然而,E-3063和E-1565基质在过滤后仍然展示显著活性。这些数据表明这些化合物包含PGN降解产物和/或脂肽。的确,与PGN相反,TLR2的其他强诱导物具有<30kDa的重量并且因此在过滤后将仍然给出细胞应答。
E-5250和E-5248基质以及给出弱应答,强度相当于用Raw细胞观察到的那样,表明这三种样品包含TLR2的弱诱导物(例如,酵母聚糖、β-葡聚糖或LTA)。
如前述所,嘉吉基质以及不触发应答,指示不存在TLR2-诱导污染物。
HEK-TLR4细胞应答(图8):
E1565、E3063、Lab3943、嘉吉和基质在HEK-TLR4细胞中触发中等强度的应答,由此确认LPS的存在。过滤部分地降低这些细胞的应答,这可以由以下事实解释:LPS可以形成聚集体,只能去除非聚集的分子。
E1242、IcoE209J、E5248、E5250和基质不触发显著应答,指示LPS水平低于能够触发炎症应答的阈值。前两种基质在Raw细胞中给出炎症应答,这与HEK-TLR2细胞中的强反应性相关。这些数据指示这两种基质实质上被PGN污染。E5248和E5250基质以及还触发Raw细胞中的炎症应答。然而,相对于TLR2,它们仅仅是几乎无或完全无活性,由此显示这三种样品中除PGN和LPS之外的污染物的存在。
HEK-NOD2细胞应答(图9):
HEK-NOD2细胞对所有样品发生应答,但是仅E-1565、Lab3943和嘉吉基质强负荷有NOD2的诱导物。这些受体与PGN解聚(MDP)的最终产物发生反应,但是也与其低分子量降解产物发生反应。因此,观察到的应答的强度指示这些样品被和/或曾经被或多或少经历了高级降解过程的PGN污染。如所预期的,在100和30kDa下的过滤对这些细胞的应答不具有显著影响,因为所讨论的化合物(MDP和降解的PGN)是小尺寸的。
HEK-裸细胞应答(图10):
最终,HEK-裸细胞在不同样品存在下不给出显著应答,证明在其他细胞中观察到的反应性与毒性效应不相关,但确实与炎症性类型的应答相关。
通过样品进行的评估(图11):
-E1242:中等强度的炎症性活性,与具有略微降解的PGN的强污染相关。
-E1565:中等强度的炎症性活性,与具有部分降解的PGN的强污染以及LPS的存在相关。
-E3063:高强度的炎症性活性,与具有略微降解的PGN的极强污染以及痕量LPS相关。
-E5248:低强度的炎症性活性,与PGN的弱污染并且与除PGN和LPS之外的炎症性分子的存在相关。
-E5250:低强度的炎症性活性,与PGN的弱污染并且与除PGN和LPS之外的炎症性分子的存在相关。
-Lab3943:中等强度的炎症性活性,与部分降解的PGN和LPS的中等污染相关。
-IcoE209J:中等强度的炎症性活性,与具有略微降解的PGN的强污染相关。
-嘉吉:不存在可检出的炎症性活性,但是存在PGN降解产物。
-中等强度的炎症性活性,与痕量的部分降解的PGN并且与LPS的中等污染相关。
-低强度的炎症性活性,与PGN降解产物的弱污染并且与除PGN和LPS之外的炎症性分子的存在相关。
实例4:穿过活性炭进行处理的效果。
在一个第一系列的实验中,将所有的样品经受用相同的炭的两个连续的处理(1%的NORIT SX+炭,在80℃,持续1h)。
图12展示由这些细胞系获得的结果。
该第一次炭处理大幅度的降低了E1242、E-565、E3063和IcoE209J样品触发Raw和HEK-TLR2细胞中的炎症应答的能力。在任何事件中,该第二处理进一步改善负责炎症应答的分子的去除。该处理对E5248、E5250、和Lab3943样品以及的效果的显著性少得多。这些数据指示使用SX+炭处理对于以下将是有效的:去除几乎未降解的PGN,由此降低基质(对于其这些污染物是主要的)的炎症性活性。
对于HEK-TLR4细胞,针对E1565、Lab3943和基质(最主要是被LPS污染),该应答降低很大。然而,该效果不像对于归因于PGN的应答那样显著,显示特异性针对LPS的动力学。
使用SX+炭处理对于HEK-NOD2细胞的应答具有很少影响,由此指示PGN降解产物未被正确去除。最终,HEK-裸细胞相对于经处理的样品不是反应性的,排除与该炭相关联的任何毒性效应。
通过穿过活性炭进行处理之后观察到的差异是预期的,因为先前试验显示这些样品包含不同分子性质的污染物。由这个实验提供的一条重要的信息是证明了根据这些污染物的尺寸,效力存在差异。因此,使用SX+炭处理将对某类污染物的去除,特别是高分子量PGN具有更加显著的效果。
为了证实这一假设,针对若干种具有不同孔隙度的炭在对E3063、E1565、E1242和Lab3943基质去污染中的效力,对它们进行了试验。
与主要被大尺寸PGN(强TLR2应答)污染的E3063和E1242基质相反,E1565和Lab3943基质包含部分降解的PGN(TLR2和NOD2应答)以及LPS(TLR4应答)。
优化处理条件如下:处于0.5%的炭,调节pH至4.5,在80℃孵育1h。处理之后,将这些样品通过0.22μm过滤器过滤并且然后用于这些细胞试验。
E3063基质的结果呈现于图13中。
HEK-裸细胞应答的缺失证实所有这些炭都不展示细胞毒性。
所试验的所有炭都有效于大幅度降低Raw和HEK-TLR2细胞应答,由此证实了它们对于去除大PGN(这一基质中的主要污染物)的效力。
应指出,新炭等效于SX+或比其更加有效。
因此,使用L4S、L3S、ENO-PC、C-extra USP以及SX2处理的样品诱导与HEK-TLR2细胞背景噪声相近的细胞应答,由此表明这些炭更加有效于去除PGN。
关于较不有效的炭,经30kDa和100kDa的过滤降低了处理后的残余应答,这证明它们本质上归因于未去除的痕量PGN。
在Raw细胞中观察到了相同结果,似乎较不有效的L4S例外,并且相反地发现A-Supra-Eur比在HEK-TLR2细胞中更加有效。因此后者炭可以具有较宽的作用谱并且去除其他分子,例如LPS。
尽管这些炭显著降低了HEK-NOD2和HEK-TLR4细胞相对于E3063基质的反应性,但是由于在这两种细胞类型中由该基质诱导的应答的小尺寸,难以区分这些处理之间的效力差异。
E1565基质的结果呈现于图14中。
对于E3063基质,相同的炭有效于降低由E1565诱导的HEK-TLR2和Raw细胞应答。然而,可以注意到少量差异,这可能归因于尺寸差异以及因此产生的PGN性质的差异。
事实上整个HEK-NOD2细胞应答显然归因于PGN降解产物的存在,因为在30kDa下过滤仅保留非常小幅的或完全不保留这些污染物。另一方面,这些炭不是特别有效于降低这些细胞的应答。确实,由MDP类型污染物负荷的减少引起的应答降低不超过这些细胞的最大应答的50%。
最终,这些炭对TLR4应答具有中等影响。除非常有效于去除所有形式LPS的SX+例外,使用其他炭处理而引起的降低不超过未被处理的相同样品诱导的应答的50%。然而,可以注意到L4S和A-Supra-Eur炭以及在较低程度上C-extra USP和ENO-PC炭,更加有效于降低由尺寸<100kDa的分子诱导的应答,由此表明这些炭优先地作用于未聚集的LPS。
E1242基质的结果呈现于图15中。
所试验的所有炭都有效于降低由E1242基质在Raw和HEK-TLR2细胞中诱导的应答。所获得的接近或等于背景噪声的应答在30kDa和100kDa过滤之前和之后是相同的,这证明对应于PGN的大分子已经被去除。
E1242基质被LPS极弱地污染。然而,可以注意到针对降低HEK-TLR4细胞对背景噪声水平的应答,ENO-PC和A-Supra-Eur比其他炭更加有效。这一观察证实这两种炭具有一个宽作用谱并且有效于去除除PGN外的分子,例如LPS。
最终,这些炭不是有效于去除PGN降解产物,降低HEK-NOD2细胞应答约50%的ENO-PC和SX2例外。
Lab3943基质的结果呈现于图16中。
这一基质受不同分子的广谱污染。如所预期的,所有炭都降低了Raw细胞中诱导的应答,但效力不同。可以注意地是SX+、CSA、L4S,以及在较低程度上A-Supra-Eur,是最有效的,由此确认所有炭都具有一个广谱的作用。对于HEK-TLR2细胞,发现这些炭全部有效于去除PGN,但是过滤之前与过滤之后残余的应答仍然相同,指示PGN降解产物更加难以去除。
LPS去除中炭的行为也是可变的。因此,SX+、ENO-PC、L4S和A-Supra-Eur炭仍然最有效于降低HEK-TLR4细胞应答。最终,仅发现ENO-PC、C-Extra-USP和SX2炭对于强烈降低HEK-NOD2细胞应答是相对地具有活性的,这证明它们有效于去除该基质中存在的PGN降解产物。
-C-extra-USP和SX2:有效于去除PGN及其降解产物。
-A-Supra-Eur:广谱,对于高分子量分子(例如:聚集的LPS和PGN)具有较高效力。
-ENO-PC:广谱,对于具有分子量<100kDa的分子(例如:LPS和PGN降解产物)具有较高效力。
-其他炭:作用谱和效力至多与SX+炭的那些相等。
实例5:经5kDa超滤的处理的影响。
超滤处理的目的是降低或甚至去除小尺寸分子的污染,以抗击它们参与触发炎症应答,不论是通过直接影响或经由与其他污染分子的协同的现象。
在E1565和Lab3943基质上进行这些实验,这两种基质都被部分降解的PGN(TLR2和NOD2应答)和LPS(TLR4应答)污染。
经5kDa的过滤以25ml/min的平均流速进行。分别地,过滤流速对于E1565是55ml/h并且对于Lab3943是65ml/h。
为了证实超滤的效力,使用起源于渗余物和滤液部分(通过起始溶液之后恢复的)的样品首先测量细胞应答(100mL)。
然后在闭合回路中连续注射渗余物到该起始样品中来进行超滤。为了补偿去除滤液造成的液体损失,通过添加注射用水不断将该样品的体积调节至起始体积。在这种情况下,使用取自超滤1h、2h和3h后样品上的样本进行这些细胞试验。
E1565基质的结果呈现于图17中。
在这四个细胞试验中,由渗余物部分诱导的应答仍然类似于对于非过滤样品所观察到的那些。然而,响应于Raw和HEK-NOD2细胞中的滤液部分,观察到显著炎症应答。这些数据与该过滤器(5kDa)的截取阈值相容,这允许PGN解聚产物通过,但是不允许PGN和LPS通过,尤其是如果后者处于聚集体的形式时。另一个方面,渗余物中炎症应答降低的不存在指示通过该过滤器的单一通过对于降低基质的炎症性反应性是无效的。这是因为渗余物/滤液部分的商是25比1,这不足以去除小炎症性分子。
该连续超滤有效于降低HEK-NOD2细胞中诱导的应答,这是可预测的,但是还降低Raw和HEK-TLR2细胞中诱导的应答。在具有PGN和LPS的E1565的污染的情况下,后两种细胞类型中应答的降低当然与小炎症性分子的协同活性的降低相关。
Lab3943基质的结果呈现于图18中。
如所预期的,在滤液中发现了与MDP相关联的炎症性活性(HEK-NOD2)。还在HEK-TLR4细胞中观察到了显著应答。这一结果表明LPS处于比E1565基质中存在的更低聚集的结构构型,由此允许其穿过该过滤器。
至于E1565,连续过滤有效于降低PGN解聚产物负荷,通过HEK-NOD2细胞应答的清晰下降(直接影响)并且通过较小但是显著降低的Raw和HEK-TLR2细胞反应性(协同作用)这是可见的。
实例6:酶处理的影响。
这些试验的目标是测试工业酶降低葡萄糖聚合物基质中存在的污染物的促炎反应性的能力。
这些样品在32%(重量/体积)下制备并且在酶存在下根据在下文中描述的条件进行处理。处理之后,将这些酶通过加热去活化,并且将这些溶液通过无菌的0.22μm过滤器过滤并且然后用于这些细胞试验。
针对降低污染物负荷的能力,对三种工业酶制剂进行试验:
-以0.4%(体积/体积)孵育,pH 10,50℃,持续4h和24h。
-TL:以0.35mg/g基质进行孵育,50℃,pH 5,从30min至24h。
-FL100:以4%(体积/体积)孵育,pH 3,55℃,从1h和24h。
选择用于这些试验的两种基质是:E3063(具有被略微降解的PGN以及痕量LPS强污染)以及E5250(弱PGN污染并且存在除PGN和LPS之外的炎症性分子)。
使用对这两种基质进行处理的影响呈现于图19中。
向P-11.11基质(非污染对照)中添加酶溶液不诱导在RawHEK-TLR2或HEK-TLR4细胞中的炎症应答。在HEK-NOD2细胞中观察到了略微增加,表明PGN降解产物以痕量存在。然而,这些结果表明在这些实验条件下使用的酶不引入主要的促炎污染物。
在E3063基质上进行的这些试验表明酶对PGN可能具有弱裂解作用,因为在Raw和HEK-TLR2细胞中观察到了应答的降低。该处理引起HEK-NOD2细胞应答的增加,这与PGN的部分降解是相容的。另一方面,还观察到了HEK-TLR4细胞应答的增加。假定该酶制剂不引入任何污染,LPS的出现可能归因于这一污染物从该基质本身的释放。
在这四种细胞类型中,E5250基质的酶处理诱导炎症应答的增加。最初,这一基质触发弱炎症应答。随后,TLR2和TLR4应答的增加表明酶释放来自该基质的、PGN和LPS类型的污染物。
通常用作一种试剂,用于澄清食品加工产品。获得的结果表明该酶可能解离大复合体(细菌碎片),这些大复合体通常是通过经由0.22μm过滤器的一个过滤步骤去除的。通过溶解这些炎症性分子,该酶使得它们在这些细胞试验中易于诱导应答。
使用TL对E5250基质进行处理的影响呈现于图20中。
向P-11.11基质中添加酶溶液不诱导在这四种细胞类型中的炎症应答,这表明在这些实验条件下使用的酶不引入污染物。
在Raw和HEK-TLR2细胞中,E5250基质的处理诱导炎症应答的略微降低。本质上针对该酶的β-葡聚糖酶特性对其进行描述。然而,观察到的细胞应答的降低伴随着HEK-NOD2细胞应答的增加。这些数据指示该酶制剂还包含能够降解PGN的活性。
平行于PGN降解产物的出现,在酶的存在下(甚至后者不被污染)观察到TLR4应答的略微增加。如前所述,该酶能够释放炎症性污染物,但是在一个低于使用Mannaway观察到的
使用FL100对E3063基质进行处理的影响呈现于图21中。
向P-11.11基质中添加酶制剂在HEK-TLR4细胞中诱导强炎症应答,并且还在Raw和HEK-TLR2细胞中诱导弱但显著的应答。这些数据指示该酶被LPS和痕量PGN污染。
向E3063基质中添加酶诱导TLR2应答的略微下降,这伴随着HEK-NOD2细胞应答的增加。这些数据指示FL100对PGN具有弱裂解作用。然而,其使用将必须需要一个在先的去污染步骤,以去除LPS。
实例7:穿过树脂进行处理的影响。
这些试验的目标是测试工业树脂保留存在于葡萄糖聚合物基质中的污染物的能力,并且因此降低这些基质的促炎反应性的能力。
使用E1565基质(在32%重量/体积下,溶解于无菌水中)进行这些试验,因为它已经被不同类型的促炎分子污染,这些分子可以发现于生产回路(TLR2、TLR4和NOD2应答)中。
对于这些实验,将有待于去污染的溶液经包含20ml的每种树脂(床体积)的柱进行连续洗脱。使用穿过该柱之前的溶液(污染对照),并且然后关于通过4个体积(通过5)和10个体积(通过11)的该溶液后回收的样品,针对炎症性反应性进行这些试验。这一程序使得可能验证葡萄糖聚合物的存在是否不会引起树脂饱和现象。
结果呈现于图22中。
溶液穿过不同树脂引起与Raw细胞接触的E1565基质的炎症性反应性的降低。除FPX66例外,对于其他树脂,应答降低达至少50%。穿过SD2树脂后,该降低甚至达70%,由此指示这种树脂最有效于去除包含在该E1565基质中的、具有促炎活性的污染分子。在任何情况下,通过5和11之间未观察到显著性差异,由此排除任何底物饱和现象。
在穿过不同树脂后,HEK-TLR2细胞相对于E5250基质的反应性未显著改变,由此指出这些处理无效于降低该污染的PGN负荷。
发现MN-100和XAD-1600树脂,就它们自身而言,相对于E1565基质,非常有效于降低HEK-TLR4应答。这些数据指示这两种树脂具有用于保留LPS类型分子的高能力。相反地,其他树脂很少、或甚至完全无效于保留这一污染物。
最终,相对于该基质,不同树脂适度降低HEK-NOD2细胞应答,完全无效的FPX66例外。然而,观察到的影响仍是弱的,证明这些树脂具有针对保留PGN降解产物的弱能力。
除存在痕量LPS之外,E1565基质被PGN并且被其降解产物强污染。后者本身具有极低炎症性反应性;另一方面,它们能够与和TLR相互作用的其他炎症性分子(例如PGN和LPS)协同作用,并且能够恶化整个免疫应答。
在这一实例中进行的这些试验显示在穿过多种树脂后Raw细胞的反应性显著降低。这种整个炎症应答的降低不是继PGN保留之后的,因为穿过树脂不改变TLR2应答。
七种树脂中只有两种(MN-100、XAD-1600)明确地有效于降低TLR4应答。因此可以从中推导出使该基质穿过这两种树脂之后,Raw细胞中观察到的炎症应答的降低至少部分地是继LPS保留之后。
除FPX66例外,所有的树脂适度保留PGN降解产物。考虑到这些小分子对恶化炎症应答的效果,这些结果指出这些树脂的主要影响是去除与这些小分子相关联的协同效应。
至于FPX66基质,其影响可能与除LPS和PGN及其降解产物之外炎症性分子的去除相关联。这一假设与以下事实是相容的:这一树脂对于降低整体炎症应答是最不有效的。
总的来说,这些数据指示使用某种明智而审慎地选择的工业树脂的基质的处理可以证明是有效于去除除PGN外的炎症性污染物,而且还降低这些分子之间观察到的协同效应。本研究实例4显示一些工业炭对于去除PGN是特别有效的。因此,组合这两种处理类型的程序将使得可能靶向多类污染物并且使得可能提供不具有炎症性反应性的基质。
Claims (14)
1.一种用于试验一个生产步骤或多个生产步骤对葡萄糖聚合物或其水解产物中促炎分子的存在或其性质的影响或一个纯化步骤或多个纯化步骤对葡萄糖聚合物或其水解产物中促炎分子的存在或其性质的效力的方法,该方法包括:
a)提供葡萄糖聚合物或其水解产物;
b)检测或测定步骤a)中提供的葡萄糖聚合物或其水解产物中的促炎分子;
c)对步骤a)中提供的葡萄糖聚合物或其水解产物进行该一个或多个生产或纯化步骤;
d)检测或测定步骤c)后获得的葡萄糖聚合物或其水解产物中的促炎分子;
e)通过比较步骤b)和d)中检测或测定的、所述葡萄糖聚合物或其水解产物中的促炎分子,确定步骤c)对这些促炎分子的存在或性质的效力,促炎分子或这些分子中的一些的量的减少指示步骤c)的效力;
其中用于检测或测定这些葡萄糖聚合物或其水解产物中的促炎分子的步骤包括使用细胞系进行的体外炎症应答试验,其中该体外炎症应答试验包括使得这些葡萄糖聚合物或其水解产物与以下各项相接触:
a.表达TLR2受体和报告基因的细胞系,该报告基因的转录是在TLR2信号通路的直接控制下,通过测量该报告基因的活性或信号来检测或测定这些促炎分子;和
b.表达NOD2受体和报告基因的细胞系,该报告基因的转录是在NOD2信号通路的直接控制下,通过测量该报告基因的活性或信号来检测或测定这些促炎分子,
其中所述促炎分子选自PGN(肽聚糖)、脂肽、PGN解聚产物和MDP(胞壁酰二肽)。
2.如权利要求1中所述的方法,其中该体外炎症应答试验还包括使得这些葡萄糖聚合物或其水解产物与未经受免疫受体转染的对照系相接触。
3.如权利要求1或2中所述的方法,其中该体外炎症应答试验还包括使得这些葡萄糖聚合物或其水解产物与MDP-或LPS-敏化的、巨噬细胞-分化的THP-1细胞系相接触,通过测量由该细胞系产生的RANTES或TNF-α的量来检测或测定这些促炎分子。
4.如权利要求1或2中所述的方法,其中该体外炎症应答试验还包括使得这些葡萄糖聚合物或其水解产物与用报告基因转染的巨噬细胞系相接触,该报告基因的转录是在炎症信号通路的直接控制下,通过测量该报告基因的活性或信号来检测或测定这些促炎分子。
5.如权利要求4中所述的方法,其中所述巨噬细胞系是Raw-BlueTM系。
6.如权利要求1或2中所述的方法,其中表达TLR2受体和报告基因的细胞系是HEK-BlueTM hTLR2系。
7.如权利要求1或2中所述的方法,其中该体外炎症应答试验还包括使得这些葡萄糖聚合物或其水解产物与表达TLR4受体和报告基因的细胞系相接触,该报告基因的转录是在TLR4信号通路的直接控制下,通过测量该报告基因的活性或信号来检测或测定这些促炎分子。
8.如权利要求7中所述的方法,其中所述细胞系是HEK-BlueTM hTLR4系。
9.如权利要求1或2中所述的方法,其中表达NOD2受体和报告基因的细胞系是HEK-BlueTM hNOD2系。
10.如权利要求2中所述的方法,其中所述对照系是HEK-BlueTM Null2系。
11.如权利要求1或2中所述的方法,其中该一个或多个生产或纯化步骤选自以下步骤:热处理、酸化、穿过活性炭、穿过吸附树脂、过滤、或化学或酶水解、或其组合。
12.如权利要求11中所述的方法,其中所述生产或纯化步骤是超滤。
13.如权利要求1或2中所述的方法,其中这些葡萄糖聚合物选自艾考糊精和麦芽糊精,并且这些葡萄糖聚合物水解产物是完全水解的产物。
14.如权利要求1或2中所述的方法,其中用30kDa的截取阈值预过滤葡萄糖聚合物或其水解产物的样品,并且使滤液与试验中使用的细胞系相接触。
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Legal Events
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C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
GR01 | Patent grant | ||
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