MX2014014551A - Metodos para descontaminar circuitos para producir polimeros de glucosa e hidrolizados de polimeros de glucosa. - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a un método para determinar el impacto de un paso de producción o un paso de purificación sobre la presencia o la naturaleza de moléculas contaminantes proinflamatorias en polímeros de glucosa o hidrolizados de estos utilizando una prueba de respuesta inflamatoria in vitro que emplea líneas celulares. También se refiere a un método optimizado para producir o purificar polímeros de glucosa o hidrolizados de estos que comprende un análisis de las moléculas contaminantes proinflamatorias en los polímeros de glucosa o los hidrolizados de estos y la selección de pasos de producción o purificación optimizados respecto a la presencia y la naturaleza de las moléculas contaminantes proinflamatorias.

Description

MÉTODOS PARA DESCONTAMINAR CIRCUITOS PARA PRODUCIR POLÍMEROS DE GLUCOSA E HIDROLIZADOS DE POLÍMEROS DE GLUCOSA Campo de la Invención La presente invención se refiere a métodos para descontaminar circuitos para producir o purificar polímeros de glucosa, más particularmente aquellos diseñados para los sectores alimentarios (ingredientes sanos ricos en fibra) y los campos médicos (diálisis peritoneal), o hidrolizados de polímeros de glucosa, más particularmente aquellos diseñados para los campos médicos (glucosa inyectable no pirógena).

Antecedentes de la Invención La empresa solicitante ha decidido desarrollar su invención en un campo que es conocido por la peligrosidad de los contaminantes de origen microbiano que se pueden desarrollar en los circuitos para producir polímeros de glucosa o en aquellos para producir hidrolizados de estos, siendo responsables dichos contaminantes de posibles: intoxicaciones alimentarias, reacciones inflamatorias muy nocivas para la salud humana.

En el contexto de una estrategia de seguridad alimentaria, así como también en el de una estrategia de seguridad sanitaria, es importante, por consiguiente, garantizar la ausencia de contaminantes de origen microbiano, tanto en forma de células vivas como en forma de residuos celulares, mediante todos los medios téenicos adecuados, en particular: la definición de circuitos de producción seguros, mediante la puesta a punto de téenicas y dispositivos de purificación adecuados, la definición de métodos para identificar y analizar los contaminantes de manera eficaz.

Por ejemplo, en el caso de la diálisis peritoneal, se debe preparar un cierto número de ingredientes en las condiciones de pureza más estrictas.

De hecho, la diálisis peritoneal es un tipo de diálisis cuyo objetivo consiste en eliminar residuos, tales como urea, creatinina, exceso de potasio o exceso de agua que los riñones no consiguen o ya no consiguen purificar a partir del plasma sanguíneo. Este tratamiento médico se indica en el caso de insuficiencia renal crónica terminal.

Los líquidos de diálisis utilizados más habitualmente están compuestos por una solución tampón (de lactato o de bicarbonato) con un pH ácido (5.2-5.5) o pH fisiológico (7.4) a la cual se añaden electrolitos (sodio, calcio, magnesio, cloro) y especialmente un agente osmótico (glucosa o un polímero de glucosa, tal como la "icodextrina", presente en la solución de diálisis peritoneal ambulatoria EXTRANEAL® comercializada por la empresa BAXTER).

Se prefiere el polímero de glucosa, tal como la icodextrina mencionada anteriormente, en lugar de la glucosa como agente osmótico, ya que, debido a su menor tamaño, la glucosa, la cual atraviesa rápidamente el peritoneo, conduce a una pérdida de gradiente osmótico a las 2-4 horas de infusión.

En el campo más particular del uso de polímeros de glucosa para diálisis peritoneal ambulatoria continua, se puso de manifiesto muy rápidamente que estos hidrolizados de almidón (mezcla de glucosa, y de oligómeros y polímeros de glucosa) no se podían utilizar como tales.

La solicitud de patente europea EP 207676 describe que se prefieren los polímeros de glucosa que forman soluciones transparentes e incoloras con una concentración de un 10% en agua, que tienen un peso molecular medio másico (Mw) de 5000 a 100 000 daltons y un peso molecular medio numérico (Mn) inferior a 8000 daltons.

Tales polímeros de glucosa también comprenden preferentemente al menos un 80% de polímeros de glucosa cuyo peso molecular está comprendido entre 5000 y 50000 daltons, una cantidad pequeña o nula de glucosa o polímeros de glucosa con un DP (por sus siglas en inglés, referentes al grado de polimerización) inferior o igual a 3 (peso molecular 504) y una cantidad pequeña o nula de polímeros de glucosa con un peso molecular superior a 100 000 (DP de aproximadamente 600).

Dicho de otro modo, los polímeros de glucosa preferidos son los polímeros de glucosa con un índice de polidispersidad (valor obtenido al calcular el cociente Mw/Mn) bajo.

Los métodos propuestos en dicha solicitud de patente EP 207 676 para obtener estos polímeros de glucosa con un índice de polidispersidad bajo a partir de hidrolizados de almidón consisten en: o bien llevar a cabo una precipitación fraccionada de una maltodextrina con un disolvente miscible en agua, o llevar a cabo una filtración molecular de esta misma maltodextrina a través de varias membranas que posean un umbral de exclusión o corte adecuado.

En ambos casos, estos métodos tienen como objetivo eliminar tanto los polímeros de peso molecular muy elevado como los monómeros u oligómeros de peso molecular bajo.

Sin embargo, estos métodos no resultan satisfactorios ni desde el punto de vista de su implementación ni desde el punto de vista de los rendimientos y la calidad de los productos que permiten obtener.

En aras de desarrollar un método para producir un polímero de glucosa completamente hidrosoluble con un índice de polidispersidad bajo, preferentemente inferior a 2.5, preferentemente con un Mn inferior a 8000 daltons y con un Mw comprendido entre 12000 y 20000 daltons, donde dicho método carezca de las desventajas de la téenica anterior, la empresa solicitante se ha propuesto resolver este problema de su patente EP 667356 partiendo de almidón hidrolizado en lugar de una maltodextrina.

El polímero de glucosa obtenido mediante fraccionamiento cromatográfico contiene entonces preferentemente menos de un 3% de glucosa y de polímeros de glucosa con un DP inferior o igual a 3 y menos de un 0.5% de polímeros de glucosa con un DP superior a 600.

Ha sido finalmente aceptado en lo sucesivo por los expertos en el campo de la diálisis peritoneal que estos polímeros de glucosa, utilizados por su potencia osmótica, son completamente satisfactorios.

Sin embargo, ssee ddeebbeenn eevviittaarr llooss riesgos de contaminación microbiana de estos preparados diseñados para la diálisis peritoneal.

De hecho, existe constancia de que los circuitos para producir polímeros de glucosa se pueden contaminar con microorganismos o con sustancias proinflamatorias contenidas en dichos microorganismos.

La contaminación de almidones de trigo o maíz por parte de microorganismos de tipo bacteriano, de moho y levadura, y más particularmente por parte de bacterias acidotermófilas de tipo Alicyclobacillus acidocaldarius (bacterias extremófilas que crecen en zonas calientes y ácidas del circuito) se describe, por ejemplo, en la industria del almidón.

El riesgo principal para el paciente que recibe estos productos contaminados es, en este caso, la peritonitis.

Estos episodios de peritonitis están provocados por infecciones bacterianas intraperitoneales y su diagnóstico se establece normalmente con facilidad mediante cultivos de líquidos de diálisis positivos.

La "peritonitis estéril", la cual se describe como una peritonitis aséptica, química o de cultivo negativo está provocada normalmente, por su parte, por un irritante químico o un cuerpo extraño.

Desde la introducción de la icodextrina para preparar soluciones de diálisis peritoneal, se han registrado casos aislados de peritonitis aséptica, que se pueden relacionar con varias causas y, en particular, la inducción por parte de sustancias proinflamatorias que pueden estar presentes.

Por consiguiente, los episodios inflamatorios asépticos son complicaciones importantes observadas tras inyecciones de soluciones de diálisis.

Aunque algunos de estos episodios inflamatorios se relacionan con un problema de naturaleza química (inyección accidental de contaminantes químicos o dosis incorrectas de ciertos compuestos), la mayoría de los casos se asocian directamente con la presencia de contaminantes de origen microbiano que están presentes en las soluciones utilizadas para preparar las soluciones de diálisis.

Los lipopolisacáridos (LPS) y los peptidoglicanos (PGN) son los contaminantes principales de origen microbiano que presentan un mayor riesgo de desencadenar una inflamación incluso cuando están presentes en cantidades traza.

Además, es un mérito de la empresa solicitante el haber tenido en cuenta también la presencia de moléculas capaces de exacerbar la respuesta inflamatoria inducida por estos contaminantes, tales como productos de despolimerización de PGN, la estructura mínima de los cuales que sigue siendo bioactiva es el dipéptido muramil (MDP).

Estos derivados, considerados de forma aislada, no son muy inflamatorios in vi tro y provocan una respuesta significativa para valores superiores a 1 mg/ml.

Además de los productos de despolimerización de PGN, los péptidos microbianos formilados, un prototipo de los cuales es f-MLP (tripéptido for il-Met-Leu-Phe), también presentan una actividad sinérgica sustancial. Originariamente, estos péptidos se identificaron por su actividad quimioatrayente en leucocitos, aunque son incapaces de inducir una respuesta en citocinas per se.

Por consiguiente, es importante no ignorar estas "moléculas de bajo peso molecular", ya que pueden ser las responsables indirectamente de episodios inflamatorios asépticos, ya que exacerban los efectos de trazas de PGN y/o de LPS.

La farmacopea propone un conjunto de pruebas para detectar sustancias pirógenas: la prueba para detectar endotoxinas bacterianas, principalmente componentes de bacterias gra negativas (prueba LAL), la prueba de pirógenos en conejos.

Aunque por lo general son fiables, estas dos pruebas tienen sus limitaciones. La prueba de pirógenos en conejos se basa en la detección indirecta de sustancias pirógenas mediante la medición de un incremento de la temperatura del conejo al cual se le esté inyectando el producto que contiene estas sustancias (respuesta febril).

Esta prueba puede producir negativos falsos, si la sustancia no deseada tiene una actividad biológica que sea demasiado débil o una concentración que sea demasiado baja para inducir una respuesta pirógena sistémica.

Además, esta sustancia puede tener una actividad biológica o una concentración suficiente para producir una reacción inflamatoria local.

La prueba LAL, por su parte, detecta únicamente endotoxinas bacterianas (LPS) y también b-glucanos, que son componentes de las paredes de la flora fúngica. Las otras impurezas biológicas (ADN, peptidoglicanos, etc.) no se detectan.

Por consiguiente, la manifestación de peritonitis aséptica observada con las soluciones de diálisis peritoneal que contienen icodextrina, en algunos casos, confirma el hecho de que algunas sustancias pueden pasar desapercibidas en las pruebas descritas en la farmacopea y pueden ser responsables de efectos clínicos no deseados.

Con el fin de poner remedio a esta situación, la empresa BAXTER ha propuesto intentar detectar los contaminantes microbianos grampositivos.

En particular, en su patente EP 1 720 999, la empresa BAXTER propone desarrollar un método basado en la detección de peptidoglicanos, los cuales constituyen los componentes principales de las membranas bacterianas grampositivas, en particular en polímeros de glucosa para la preparación de soluciones de diálisis peritoneal.

Dicho de otro modo, con el fin de prevenir la aparición de estos episodios de peritonitis aséptica, la empresa BAXTER ha propuesto, para la producción y el uso de soluciones de diálisis peritoneal, un protocolo para detectar peptidoglicanos en la solución de diálisis peritoneal.

Además, aunque el tratamiento posterior de los polímeros de glucosa ha sido mencionado en esta patente EP 1 720 999, dicho tratamiento se realiza únicamente mediante resinas de afinidad capaces de atrapar los peptidoglicanos como tales.

Por consiguiente, no se concibió modificar el método para producir polímeros de glucosa de un modo tal que el producto final estuviera exento de contaminación por parte de bacterias acidotermófilas de tipo Alicyclobacillus acidocaldarius o por parte de residuos de membrana de estas bacterias particulares.

Por otro lado, en su solicitud de patente internacional WO 2010/125315, la empresa solicitante proporcionó, mediante un método de preparación y purificación seguro, sustancias para diálisis peritoneal de mejor calidad, en este caso concreto polímeros de glucosa, con el fin de garantizar que estas sustancias estuvieran exentas eficazmente de sustancias contaminantes.

La empresa solicitante ha implementado un método de purificación notable, que combina un cierto número de pasos de tratamiento con carbón activado/carbón negro granular, de filtración (microfiltración y ultrafiltración) y de tratamiento térmico, organizados de un modo adecuado para evitar cualquier contaminación.

Sin embargo, este método se puede mejorar y la empresa solicitante se ha dedicado a desarrollar métodos de detección y análisis que son más eficaces que los disponibles en la téenica anterior, con el fin de definir mejor los pasos clave del método que se deben implementar para garantizar una seguridad óptima en las líneas de producción, en particular de los polímeros de glucosa.

Con todo lo mencionado anteriormente, todavía no se ha conseguido proporcionar de forma satisfactoria, mediante un método de preparación y purificación seguro, sustancias para aplicaciones terapéuticas de mejor calidad, en este caso concreto polímeros de glucosa o hidrolizados de estos, con el fin de garantizar que estas sustancias estén exentas eficazmente de contaminantes.

Por consiguiente, la empresa solicitante ha descubierto que esta necesidad se puede satisfacer implementando los pasos de purificación adecuados, la eficacia de los cuales se puede medir con métodos para detectar y analizar contaminantes que sean completamente específicos.

En los últimos años, se han desarrollado numerosas pruebas que utilizan células primarias con el fin de reemplazar los modelos animales en pruebas de respuestas inflamatorias.

Sin embargo, estos modelos in vítro están sometidos a una variabilidad entre individuos considerable, que puede ser responsable de sesgos experimentales.

En cambio, las lineas celulares de monocitos proporcionan respuestas constantes, lo que explica por qué las pruebas que se están desarrollando actualmente utilizan cada vez más células de este tipo en los cultivos. Sin embargo, estas pruebas presentan la desventaja de que proporcionan una respuesta inflamatoria global a todos los contaminantes presentes como una mezcla en una solución y, cómo consecuencia, no permiten caracterizar la naturaleza del contaminante.

También cabe destacar que la respuesta inflamatoria exacerbada es visible para citocinas de la fase aguda de la inflamación, tales como TNF-a (factor de necrosis tumoral alfa), IL- ip (interleucina 1b) y quimiocinas tales como CCL5 (ligando de quimiocina (unidad C-C) 5)/RANTES (regulado por activación, expresado y secretado por linfocitos T normales), pero no es visible o es poco visible para IL-6 (interleucina 6)· Por lo tanto, los métodos basados en la producción de esta última (US 2009/0239819 y US 2007/0184496) no son adecuados para detectar contaminantes como una mezcla en una solución.

La empresa solicitante ha llegado a las siguientes conclusiones: i es difícil detectar contaminantes bacterianos presentes en cantidades traza en soluciones biológicas, ii es importante no limitarse a la detección de PGN y de LPS, debido a los efectos sinérgicos, ii es necesario desarrollar nuevos métodos de detección que sean sensibles y reproducibles, y v resulta favorable utilizar métodos de detección sensibles y reproducibles capaces de caracterizar la naturaleza de los contaminantes.

Por consiguiente, ha sido un mérito de la empresa solicitante el haber desarrollado métodos sensibles y eficaces para detectar contaminantes microbianos que poseen una acción proinflamatoria, por debajo del umbral de sensibilidad de los procedimientos utilizados en la actualidad y/o descritos en la bibliografía, y subsiguientemente el haber identificado la familia, o incluso la naturaleza, de las moléculas proinflamatorias presentes en cantidades traza en lotes originados a partir de circuitos de producción.

Sumario de la Invención La presente invención se refiere a un método para evaluar el efecto de un paso de producción o pasos de producción o la eficacia de un paso de purificación o pasos de purificación sobre la presencia o la naturaleza de moléculas proinflamatorias en polímeros de glucosa o hidrolizados de estos, que comprende: a) proporcionar polímeros de glucosa o hidrolizados de estos; b) opcionalmente, detectar o analizar las moléculas proinflamatorias en los polímeros de glucosa o hidrolizados de estos proporcionados en el paso a); c) llevar a cabo el paso o pasos de producción o purificación en los polímeros de glucosa o hidrolizados de estos proporcionados en el paso a); d) detectar o analizar las moléculas proinflamatorias en los polímeros de glucosa o hidrolizados de estos obtenidos después del paso c); e) determinar la eficacia o el impacto del paso c) sobre la presencia o la naturaleza de las moléculas proinflamatorias; donde el paso para detectar o analizar las moléculas proinflamatorias en los polímeros de glucosa o hidrolizados de estos comprende una prueba de respuesta inflamatoria in vitro que utiliza una línea celular, siendo la línea celular o bien un macrófago o una línea celular diferenciada en macrófagos o una célula que expresa uno o más TLR (receptor de tipo Toll) o receptores NOD ( proteína que contiene un dominio de oligomerización de unión a nucleótidos) , tales como TLR2, TLR4 o N0D2, y permite detectar las respuestas del receptor o receptores, o una combinación de estos.

También se refiere a un método optimizado para producir o purificar polímeros de glucosa o hidrolizados de estos, que comprende: a) proporcionar polímeros de glucosa o hidrolizados de estos; b) detectar o analizar las moléculas proinflamatorias en los polímeros de glucosa o hidrolizados de estos proporcionados en el paso a); c) seleccionar el paso o pasos para producir o purificar los polímeros de glucosa o hidrolizados de estos que sea o sean adecuados para las moléculas proinflamatorias presentes en los polímeros de glucosa o hidrolizados de estos; d) opcionalmente, llevar a cabo el paso o pasos de producción o purificación seleccionados en los polímeros de glucosa o hidrolizados de estos proporcionados en el paso a); y e) opcionalmente, detectar o analizar las moléculas proinflamatorias en los polímeros de glucosa o hidrolizados de estos obtenidos después del paso d); donde el paso para detectar o analizar las moléculas proinflamatorias en los polímeros de glucosa o hidrolizados de estos comprende una prueba de respuesta inflamatoria in vitro que utiliza una línea celular, siendo la línea celular o bien un macrófago o una línea celular diferenciada en macrófagos o una célula que expresa uno o más TLR (receptor de tipo Toll) o receptores NOD ( proteína que contiene un dominio de oligomerízación de unión a nucleótidos ) , tales como TLR2, TLR4 o NOD2, y permite detectar las respuestas del receptor o receptores, o una combinación de estos.

En un primer aspecto, la prueba de respuesta inflamatoria in vitro puede comprender poner los polímeros de glucosa o hidrolizados de estos en contacto con la línea celular THP-1 diferenciada en macrófagos y sensible a MDP o LPS, donde las moléculas proinflamatorias se detectan o analizan midiendo la cantidad de RANTES o TNF-a producida por la línea celular.

En un segundo aspecto, la prueba de respuesta inflamatoria in vi tro puede comprender poner los polímeros de glucosa o hidrolizados de estos en contacto con una línea de macrófagos transfectada con un gen marcador, cuya transcripción se encuentra bajo el control directo de las vías de señalización inflamatorias, tal como la línea Raw-Blue™, donde las moléculas proinflamatorias se detectan o analizan midiendo la actividad o la señal del gen marcador.

En un tercer aspecto, la prueba de respuesta inflamatoria in vitro puede comprender poner los polímeros de glucosa o hidrolizados de estos en contacto con una línea celular que exprese el receptor TLR2 y un gen marcador, cuya transcripción se encuentra bajo el control directo de las vías de señalización de TLR2, tal como la línea HEK-Blue™ hTLR2, donde las moléculas proinflamatorias se detectan o analizan midiendo la actividad o la señal del gen marcador.

En un cuarto aspecto, la prueba de respuesta inflamatoria in vi tro puede comprender poner los polímeros de glucosa o hidrolizados de estos en contacto con una línea celular que exprese el receptor N0D2 y un gen marcador, cuya transcripción se encuentra bajo el control directo de las vías de señalización de NOD2, tal como la línea HEK-Blue™ hNOD2, donde las moléculas proinflamatorias se detectan o analizan midiendo la actividad o la señal del gen marcador.

En un quinto aspecto, la prueba de respuesta inflamatoria in vitro puede comprender poner los polímeros de glucosa o hidrolizados de estos en contacto con una linea celular que exprese el receptor TLR4 y un gen marcador, cuya transcripción se encuentra bajo el control directo de las vías de señalización de TLR4, tal como la linea HEK-Blue™ hTLR4, donde las moléculas proinflamatorias se detectan o analizan midiendo la actividad o la señal del gen marcador.

En un sexto aspecto, la prueba de respuesta inflamatoria in vitro puede comprender poner los polímeros de glucosa o hidrolizados de estos en contacto con: a. la línea celular THP-1 diferenciada en macrófagos y sensible a DP o LPS, donde las moléculas proinflamatorias se detectan o analizan midiendo la cantidad de RANTES o TNF-a producida por la línea celular; y/o b. una línea de macrófagos transfectada con un gen marcador, cuya transcripción se encuentra bajo el control directo de las vías de señalización inflamatorias, tal como la línea Raw-Blue™, donde las moléculas proinflamatorias se detectan o analizan midiendo la actividad o la señal del gen marcador; y/o c. una línea celular que exprese el receptor TLR2 y un gen marcador, cuya transcripción se encuentra bajo el control directo de las vías de señalización de TLR2, tal como la línea HEK-Blue™ hTLR2, donde las moléculas proinflamatorias se detectan o analizan midiendo la actividad o la señal del gen marcador; y/o d. una línea celular que exprese el receptor NOD2 y un gen marcador, cuya transcripción se encuentra bajo el control directo de las vías de señalización de NOD2, tal como la linea HEK-Blue™ hNOD2, donde las moléculas proinflamatorias se detectan o analizan midiendo la actividad o la señal del gen marcador; y/o e. una linea celular que exprese el receptor TLR4 y un gen marcador, cuya transcripción se encuentra bajo el control directo de las vias de señalización de TLR4, tal como la linea HEK-Blue™ hTLR4, donde las moléculas proinflamatorias se detectan o analizan midiendo la actividad o la señal del gen marcador; y/o f. una linea de control no transfectada con ningún receptor de inmunidad.

En un séptimo aspecto, la prueba de respuesta inflamatoria in vitro puede comprender poner los polímeros de glucosa o hidrolizados de estos en contacto con: a. una línea de macrófagos transfectada con un gen marcador, cuya transcripción se encuentra bajo el control directo de las vías de señalización inflamatorias, tal como la línea Raw-Blue™, donde las moléculas proinflamatorias se detectan o analizan midiendo la actividad o la señal del gen marcador; b. una línea celular que exprese el receptor TLR2 y un gen marcador, cuya transcripción se encuentra bajo el control directo de las vías de señalización de TLR2, tal como la línea HEK-Blue™ hTLR2, donde las moléculas proinflamatorias se detectan o analizan midiendo la actividad o la señal del gen marcador; y/o c. una línea celular que exprese el receptor TLR4 y un gen marcador, cuya transcripción se encuentra bajo el control directo de las vías de señalización de TLR4, tal como la línea HEK-Blue™ hTLR4, donde las moléculas proinflamatorias se detectan o analizan midiendo la actividad o la señal del gen marcador; y/o d. una linea celular que exprese el receptor N0D2 y un gen marcador, cuya transcripción se encuentra bajo el control directo de las vías de señalización de N0D2, tal como la linea HEK-Blue™ hN0D2, donde las moléculas proinflamatorias se detectan o analizan midiendo la actividad o la señal del gen marcador; y e. una linea de control no transfectada con ningún receptor de inmunidad tal como la linea HEK-Blue™ Null2.

Preferentemente, las moléculas proinflamatorias son moléculas de origen bacteriano, preferentemente seleccionadas entre PGN, LPS, lipopéptidos, productos de despolimerización de PGN, en particular MDP, péptidos microbianos formilados tales como f-MLP, y b-glucanos.

Preferentemente, el paso o pasos de producción o purificación se selecciona o seleccionan entre pasos de tratamiento térmico, de acidificación, de pase sobre carbón activado, de pase sobre resinas de adsorción, de ultrafiltración, de filtración, o de hidrólisis química o enzimática.

Preferentemente, los polímeros de glucosa se seleccionan entre icodextrina y maltodextrinas, en particular maltodextrinas ramificadas o no ramificadas, y los hidrolizados de los polímeros de glucosa son un producto de hidrólisis total, tal como la dextrosa monohidratada.

Las muestras de los polímeros de glucosa o de los hidrolizados de estos se prefiltran, en particular con un umbral de corte de 30 kDa, y el filtrado se pone en contacto con la linea celular utilizada en la prueba.

Descripción Detallada de la Invención Por consiguiente, la presente invención se refiere a un método para evaluar el impacto o el efecto de un paso de producción o pasos de producción o la eficacia de un paso de purificación o pasos de purificación sobre la presencia o la naturaleza de moléculas proinflamatorias en polímeros de glucosa o hidrolizados de estos, que comprende: a) proporcionar polímeros de glucosa o hidrolizados de estos; b) opcionalmente, detectar o analizar las moléculas proinflamatorias en los polímeros de glucosa o hidrolizados de estos proporcionados en el paso a); c) llevar a cabo el paso o pasos de producción o purificación en los polímeros de glucosa o hidrolizados de estos proporcionados en el paso a); d) detectar o analizar las moléculas proinflamatorias en los polímeros de glucosa o hidrolizados de estos obtenidos después del paso c); e) determinar la eficacia o el impacto del paso c) sobre la presencia o la naturaleza de las moléculas proinflamatorias; donde el paso para detectar o analizar las moléculas proinflamatorias en los polímeros de glucosa o hidrolizados de estos comprende una prueba de respuesta inflamatoria in vitro que utiliza una línea celular, siendo la línea celular o bien un macrófago o una línea celular diferenciada en macrófagos o una célula que expresa uno o más TLR (receptor de tipo Toll) o receptores NOD ( proteína que contiene un dominio de oligomerización de unión a nucleótídos) , tales como TLR2, TLR4 o N0D2, y permite detectar las respuestas del receptor o receptores, o una combinación de estos.

El método puede comprender, en particular en el contexto del paso e), una comparación de las moléculas proinflamatorias en los polímeros de glucosa o hidrolizados de estos, detectadas o analizadas en los pasos b) y d). De este modo, una reducción de la cantidad de moléculas proinflamatorias o de algunas de estas moléculas indica que un paso de producción o purificación es eficaz a la hora de descontaminar los polímeros de glucosa o hidrolizados de estos. La cantidad y la naturaleza de las moléculas proinflamatorias se determinarán con los métodos que se describen detalladamente más adelante.

El objetivo de este método es, en particular, desarrollar un método optimizado para descontaminar polímeros de glucosa o hidrolizados de estos, en particular polímeros de glucosa para la preparación de una solución de diálisis peritoneal, donde este método comprende preferentemente detectar o analizar las moléculas proinflamatorias mediante una prueba de respuesta inflamatoria in vitro.

En particular, una vez que se ha caracterizado el impacto o la eficacia de los pasos de purificación o producción sobre las moléculas proinflamatorias, en particular de acuerdo con su presencia y su naturaleza, los expertos en la téenica son capaces de seleccionar los pasos más adecuados considerando las moléculas proinflamatorias presentes en los polímeros de glucosa o hidrolizados de estos. Por lo tanto, el método utilizado comprende: a) proporcionar polímeros de glucosa o hidrolizados de estos; b) detectar o analizar las moléculas proinflamatorias en los polímeros de glucosa o hidrolizados de estos proporcionados en el paso a); c) seleccionar el paso o pasos para producir o purificar los polímeros de glucosa o hidrolizados de estos gue sea o sean adecuados para las moléculas proinflamatorias presentes en los polímeros de glucosa o hidrolizados de estos; d) opcionalmente, llevar a cabo el paso o pasos de producción o purificación seleccionados en los polímeros de glucosa o hidrolizados de estos proporcionados en el paso a); y e) opcionalmente, detectar o analizar las moléculas proinflamatorias en los polímeros de glucosa o hidrolizados de estos obtenidos después del paso d); donde el paso para detectar o analizar las moléculas proinflamatorias en los polímeros de glucosa o hidrolizados de estos comprende una prueba de respuesta inflamatoria in vitro que utiliza una línea celular, siendo la línea celular o bien un macrófago o una línea celular diferenciada en macrófagos o una célula que expresa uno o más TLR (receptor de tipo Toll) o receptores NOD ( proteína que contiene un dominio de oligomerización de unión a nucleótidos) , tales como TLR2, TLR4 o NOD2, y permite detectar las respuestas del receptor o receptores, o una combinación de estos.

Los polímeros de glucosa o hidrolizados de estos pueden ser para diálisis peritoneal, alimentación parenteral y enteral, y alimentación de recién nacidos.

En una realización preferida, los polímeros de glucosa, los cuales se prepararán en el contexto de la presente invención, son icodextrina o maltodextrinas (ramificadas o no ramificadas, como se describirá posteriormente en la presente).

Se considera que los hidrolizados de los polímeros de glucosa a los cuales se hace referencia en la presente son, en particular, el producto de hidrólisis total, tal como la dextrosa monohidratada no pirógena, la cual es comercializada con la marca LYCADEX® PF por la empresa solicitante.

Se pueden descontaminar en uno o más estadios de su preparación y, en particular, en el nivel del material de partida, en cualquier paso de su método de preparación y/o en el nivel del producto final del método.

De este modo, los polímeros de glucosa o hidrolizados de estos proporcionados en los métodos de acuerdo con la presente invención corresponden al material de partida, al producto en cualquier nivel del método de preparación o al producto final.

Los contaminantes proinflamatorios son especialmente moléculas de origen bacteriano. Pueden ser en particular PGN, LPS, lipopéptidos, productos de despolimerización de PGN, en particular MDP, péptidos microbianos for ilados tales como f-MLP, b-glucanos, etc.

Los métodos para medir las respuestas inflamatorias in vitro que se utilizan en el contexto de la presente invención con el fin de monitorizar la eficacia de los pasos de descontaminación de los métodos para preparar polímeros de glucosa para uso terapéutico en seres humanos (p. ej., soluciones de diálisis peritoneal) se basan en pruebas celulares ( "bioensayos") que utilizan líneas de tipo monocito/macrófago (THP-1 y/o Raw-Blue™) y líneas transíectadas que expresan un receptor específico de inmunidad natural (HEK-Blue™).

La línea THP-1 (88081201, ECACC) es una línea de promonocitos humanos. Para las pruebas de respuesta proinflamatoria, las células se diferencian en monocitos/macrófagos durante 3 días en presencia de un éster de forbol (PMA).

Para las pruebas llevadas a cabo de acuerdo con la presente invención, los macrófagos o las células diferenciadas en macrófagos, en particular las células THP-1 diferenciadas en macrófagos, se sintetizan en presencia de MDP, en particular MDP de S. aureus. Esto se debe a que MDP es un inductor inflamatorio débil, pero existe constancia de que actúa de forma sinérgica con otras moléculas inflamatorias. Esta propiedad se basa en el hecho de que estas moléculas actúan mediante la intervención de receptores distintos del receptor MDP, esencialmente TLR. Como consecuencia, la presencia de MDP exacerbará la respuesta inflamatoria inducida por los contaminantes presentes en las soluciones de polímeros de glucosa o de hidrolizados de estos, lo cual permite detectar dosis bajas de contaminantes. Preferentemente, el MDP se añade a la muestra con una concentración superior a 1 mr/ih?, preferentemente con una concentración comprendida entre 1 y 100 mV/ih?. En una realización bastante preferida particularmente, el MDP se añade a la muestra con una concentración de 10 mV/ih?.

Como alternativa, los macrófagos o las células diferenciadas en macrófagos, en particular las células THP-1 diferenciadas en macrófagos, se pueden sintetizar en presencia de moléculas distintas del MDP. En efecto, también se puede utilizar LPS, en particular un LPS de E. coli . Se puede añadir a la muestra con una concentración de al menos 10 mg/ml, por ejemplo, con una concentración de 25 pg/ml.

En una realización preferida, los macrófagos o las células diferenciadas en macrófagos, en particular las células THP-1 diferenciadas en macrófagos, se utilizan con una densidad comprendida entre 0.5 y 1 x 106 células/ml de medio de cultivo, preferentemente entre 0.7 y 0.8 x 106 células/ml, y aún más preferentemente de aproximadamente 0.75 x 106 células/ml.

La prueba de respuesta inflamatoria in vitro se basa en la medición de la producción de RANTES por parte de células THP-1 sensibilizadas. Esto se debe a que estudios previos mostraron que el ensayo de esta quimiocina es adecuado para detectar dosis bajas de contaminantes, en particular endotoxinas, en soluciones de polímeros de glucosa. Como alternativa, la prueba de respuesta inflamatoria in vi tro también se puede basar en la medición de la producción de TNF-a por parte de células THP-1 sensibilizadas. El ensayo de las citocinas se puede llevar a cabo mediante métodos con los cuales estarán familiarizados los expertos en la téenica y, en particular, mediante ELISA. En una realización preferida, la prueba comprende la medición de la producción de TNF-a después de 8 h de estimulación. En otra realización preferida, la prueba comprende la medición de la producción de RANTES después de 20 h de estimulación, en particular mediante un ensayo de tipo ELISA.

Esta primera prueba permite detectar en particular la contaminación de polímeros de glucosa o de hidrolizados de estos con PGN y/o LPS, preferentemente con PGN de tamaño medio (en particular de aproximadamente 120 kDa) y/o LPS, aún más preferentemente con LPS.

La línea Raw-Blue™ es una linea de macrófagos de ratón transfectada con un gen marcador que produce una forma secretada de fosfatasa alcalina (SEAP: fosfatasa alcalina embriónica secretada), cuya transcripción se encuentra bajo el control directo de las vías de señalización inflamatorias. La ventaja de esta línea es que expresa de forma natural prácticamente todos los receptores de inmunidad innata, incluidos los receptores TLR2, TLR4 y NOD2. Por lo tanto, estas células responderán a la mayoría de contaminantes inflamatorios y la respuesta se monitorizará midiendo la actividad enzimática de la SEAP producida. Preferentemente, esta línea se utiliza en la prueba con una densidad celular de aproximadamente 0.5 x 106 células/pocillo. La puesta en contacto del preparado de polímeros de glucosa o de hidrolizados de estos con las células dura aproximadamente de 16 a 24 h.

Las líneas celulares, en particular HEK-Blue™ (InvivoGen), sen líneas modificadas por transfección estable con un vector que codifica un receptor de inmunidad innata, en particular receptores humanos (h). TTaammbbiiéénn están cotransfectadas con un gen marcador, en particular un gen marcador que produce SEAP, cuya síntesis se encuentra bajo el control directo de la vía de señalización asociada con el receptor sobreexpresado. Preferentemente, este gen marcador codifica una proteína fluorescente o coloreada o una proteína cuya actividad puede ser medida con o sin sustrato. La detección de la actividad o de la señal del gen marcador indica que la muestra contiene contaminantes capaces de activar uno o más receptores de inmunidad innata y de desencadenar una reacción inflamatoria. El uso de estas lineas permite tener como diana ciertas familias de moléculas de origen microbiano de acuerdo con el receptor expresado. Preferentemente, se utilizan líneas celulares que expresan hTLR2 o hTLR4 o hNOD2. Además, también se utiliza una línea de control que no expresa ningún receptor de inmunidad innata. El uso de esta línea de control tiene utilidad para verificar que las soluciones de polímeros de glucosa o de hidrolizados de estos no inducen la producción del gen marcador mediante un mecanismo parasitario tal como un mecanismo de toxicidad.

Para las pruebas de acuerdo con la presente invención, se utilizan preferentemente cuatro líneas: Línea HEK-Blue™ hTLR2: esta línea que expresa el receptor hTLR2 responde específicamente a agonistas de TLR2 (especialmente PGN y lipopéptidos). Por consiguiente, su uso permite conocer el nivel de estos contaminantes en el desencadenamiento de las respuestas inflamatorias.

Línea HEK-Blue™ hTLR4: esta línea que expresa el receptor hTLR4 responde específicamente a LPS. Por consiguiente, su uso permite conocer el nivel de estos contaminantes en el desencadenamiento de las respuestas inflamatorias.

Linea HEK-Blue™ hNOD2: esta linea que expresa el receptor hNOD2 responde específicamente a agonistas de NOD2. Por consiguiente, su uso permite conocer el nivel de MDP y moléculas relacionadas en el desencadenamiento de las respuestas inflamatorias.

Línea HEK-Blue™ Null2: es una línea de control, no transfectada con ningún receptor de inmunidad. Su uso es necesario para verificar que las soluciones de polímeros de glucosa o de hidrolizados de estos no inducen la producción de SEAP mediante un mecanismo de toxicidad.

Sin embargo, cabe destacar que los expertos en la téenica también pueden utilizar otras líneas comerciales (Imgenex) o pueden preparar las líneas.

En una realización preferida, las líneas celulares se utilizan con una densidad comprendida entre 0.5 y 1 x 106 células/ml de medio de cultivo, y la puesta en contacto del preparado de polímeros de glucosa o hidrolizados de estos con las células dura aproximadamente de 16 a 24 h.

Se puede realizar una cuantificación de los contaminantes mediante una curva de dosis-respuesta. La curva de dosis-respuesta se puede producir, en particular, con las mismas células, en las mismas condiciones, con dosis cada vez mayores de contaminantes. Las curvas de dosis-respuesta se producen, en particular, con patrones de LPS, PGN, lipopéptido, b-glucano y MDP. Preferentemente, una curva de dosis-respuesta de este tipo se puede producir para células que expresan TLR4 (por ejemplo, THP-1, HEK-Blue™ hTLR4 y Raw-Blue™) con dosis cada vez mayores de LPS, para células que expresan TLR2 (por ejemplo, THP-1, HEK-Blue™ hTLR2 y Raw-Blue™) con dosis cada vez mayores de PGN, y para células que reaccionan mediante NOD2 (por ejemplo, HEK-Blue™ hN0D2) con dosis cada vez mayores de MDP.

En realizaciones particulares, las lineas THP-1, Raw-Blue™ y HEK-Blue™ se incuban con concentraciones cada vez mayores de los patrones y la respuesta celular se mide cuantificando la producción de RANTES por ELISA para la linea THP-1 y midiendo el gen marcador, en particular la actividad enzimática de SEAP, para las lineas Raw-Blue™ y IIEK-Blue™.

La prueba de acuerdo con la invención permite identificar el contaminante o contaminantes capaces de desencadenar una reacción inflamatoria. De este modo, la linea que expresa NOD2, en particular HEK-Blue™ hNOD2, permite detectar de forma bastante particular una contaminación con productos de despolimerización de PGN y MDP, preferentemente MDP. La linea que expresa TLR2, en particular HEK-Blue™ hTLR2 y/o Raw-Blue™, permite detectar de forma bastante particular una contaminación con PGN. Además, los macrófagos, en particular los macrófagos THP-1, y la linea que expresa TLR4, en particular HEK-Blue™ hTLR4, permiten detectar de forma bastante particular una contaminación con LPS.

En una realización preferida, la prueba de respuesta inflamatoria in vitro incluye pruebas con las siguientes lineas celulares: macrófagos, en particular macrófagos THP-1, una linea celular que permite detectar la actividad de un * receptor TLR2, en particular la línea HEK-Blue™ hTLR2, una línea celular que permite detectar la actividad de un receptor TLR4, en particular la línea HEK-Blue™ hTLR4, una línea celular que permite detectar la actividad de un receptor NOD2, en particular la línea HEK-Blue™ hN0D2 y, opcionalmente pero preferentemente, una línea de control, en particular la línea HEK-Blue™ Null2; o una línea de macrófagos transfectada con un gen marcador, en particular la línea Raw-Blue™, una línea celular que permite detectar la actividad de un receptor TLR2, en particular la línea HEK-Blue™ hTLR2, una línea celular que permite detectar la actividad de un receptor TLR4, en particular la línea HEK-Blue™ hTLR4, una línea celular que permite detectar la actividad de un receptor N0D2, en particular la línea HEK-Blue™ hNOD2 y, opcionalmente pero preferentemente, una línea de control, en particular la línea HEK-Blue™ Null2.

En la realización preferida, la presencia de contaminantes en las diferentes muestras se analiza utilizando los cinco tipos celulares presentados anteriormente, para tener una idea de la respuesta inflamatoria general y también de las respuestas específicas a ciertos contaminantes: línea THP-1 sensible a MDP: cualesquiera contaminantes con una reactividad marcada frente a LPS, línea Raw-Blue™: cualesquiera contaminantes con una reactividad marcada frente a PGN, línea HEK-Blue™ hTLR2: PGN y otros ligandos de TLR2 (lipopéptidos, etc.), línea HEK-Blue™ hTLR4: LPS, linea HEK-Blue™ hNOD2: MDP y productos de despolimerización de PGN, linea HEK-Blue™ Null2: control negativo.

En el método de acuerdo con la presente invención, el paso o pasos de producción o purificación se pueden seleccionar entre pasos de tratamiento térmico, de acidificación, de pase sobre carbón activado, de pase sobre resinas de adsorción, de ultrafiltración, de filtración, o de hidrólisis química o enzimática, o combinaciones de estos. En cada paso se pueden analizar varios parámetros, lo cual permite seleccionar los que sean más eficaces. Por ejemplo, en el caso del pase sobre carbón activado, se pueden evaluar varias calidades de carbón activado y combinaciones de estas. En el caso de una ultrafiltración, será posible evaluar varios umbrales de corte y/o combinarlos. En el caso de un tratamiento térmico, será posible variar la temperatura y el tiempo de tratamiento. En el caso de un tratamiento enzimático, será posible variar la enzima o enzimas utilizadas, su concentración y sus condiciones de tratamiento.

En una realización muy particular, los tratamientos se llevan a cabo en muestras preparadas con una concentración de un 32% (peso/volumen) en agua no pirógena (para inyección) y a continuación las soluciones se filtran a través de 0.22 mm. Para las pruebas celulares, las muestras se diluyen hasta 1/10 en el medio de cultivo celular (concentración final: 3.2% (p/v)).

Además, las muestras de polímeros de glucosa o hidrolizados de estos se pueden someter a tratamientos enzimáticos o químicos o a pasos de filtración antes de la prueba para detectar o analizar las moléculas proinflamatorias. Opcionalmente, los resultados obtenidos antes y después de estos pasos de tratamiento o filtración se pueden comparar.

De este modo, una muestra de polímeros de glucosa o hidrolizados de estos se puede tratar con una mutanolisína antes de la prueba. Esta enzima, debido a su actividad muramidasa, es capaz de despolimerizar PGN. Por ejemplo, se puede colocar la enzima con una concentración de aproximadamente 2500 U/ml en presencia de la muestra, opcionalmente diluida de modo que se obtenga una concentración de polímeros de glucosa de un 7.5 a un 37.5% (peso/volumen), durante 6-16 h, preferentemente durante aproximadamente 16 h. La muestra tratada de este modo se someterá a continuación a la prueba con una o más líneas celulares de acuerdo con la presente invención.

Como alternativa, la muestra del preparado de polímeros de glucosa o de hidrolizados de estos se puede filtrar antes de la prueba. El propósito de esta filtración es esencialmente eliminar las moléculas de peso molecular elevado, tales como los PGN de peso molecular elevado, y llevar a cabo la prueba sobre el filtrado con el fin de analizar de forma bastante particular los contaminantes de tamaños pequeños. El umbral de corte para la filtración puede estar comprendido, por ejemplo, entre 30 kD y 150 kD, preferentemente entre 30 y 100 kD o entre 30 y 50 kD, y en particular puede ser de aproximadamente 30 kD. En una realización preferida, las pruebas celulares se llevan a cabo sobre las fracciones obtenidas por ultrafiltración, en particular con umbrales de corte de 30 y 100 kD .

Preferentemente, la filtración se lleva a cabo por ultrafiltración. También se puede llevar a cabo utilizando cualesquiera medios conocidos por los expertos en la téenica. Por lo tanto, una vez que la muestra se ha filtrado de este modo, el filtrado se someterá a las pruebas celulares de acuerdo con la presente invención. La comparación de los resultados obtenidos antes de la filtración o sin ella permitirán deducir la contribución inflamatoria específica de las moléculas de tamaños pequeños. Además, esto permite verificar si los pasos de producción o purificación modifican el tamaño de los contaminantes (hidrólisis en comparación con agregación) y/o no eliminan ciertos contaminantes de tamaño definido.

Además, el tratamiento de las muestras con lisozima y/o b-glucanasa permite eliminar el PGN y/o los b-giucanos, y determinar de este modo la trascendencia de los demás agonistas de TLR2 que puedan estar presentes en los lotes contaminados (glicolípidos y lipopéptidos).

En una realización preferida de los métodos de acuerdo con la presente invención, se lleva a cabo una primera serie de pruebas celulares sobre muestras no filtradas, con el fin de medir las respuestas sin tener en cuenta el tamaño de las moléculas y para conservar los posibles efectos sinérgicos entre estas moléculas. A continuación, en una segunda serie, las pruebas celulares se llevan a cabo sobre las fracciones obtenidas por ultrafiltración (umbrales de corte: 30 y 100 kDa), con el fin de verificar si los tratamientos modifican el tamaño de los contaminantes (hidrólisis en comparación con agregación) y/o no eliminan ciertos contaminantes de tamaño definido.

Con el fin de ilustrar el método de la invención, se llevan a cabo varios pasos de descontaminación en varias matrices de polímeros de glucosa diferentes y en un lote de hidrolizado de polímeros de glucosa: polímeros de glucosa, materiales de partida de icodextrina (antes del fraccionamiento cromatográfico de acuerdo con el contenido de la patente EP 667356), un lote de icodextrina, un lote de maltodextrina ramificada, comercializada por la empresa solicitante con el nombre comercial NUTRIOSE® FB06, un lote de dextrosa monohidratada preparada de modo que esté acondicionada en una solución inyectable, comercializada por la empresa solicitante con el nombre comercial LYCADEX® PF, un lote de polímeros de glucosa solubles muy ramificados, preparados de acuerdo con el contenido de la solicitud de patente internacional WO 2007/099212, de la cual es propietaria la empresa solicitante, una maltodextrina comercial.

Los tratamientos empleados son: tratamiento térmico, por ejemplo: o 70 °C y/o o 120 °C, acidificación, pase sobre carbón activado de varias calidades, por ejemplo: o SX+ de la empresa NORIT, o SX2 de la empresa NORIT, o C EXTRA USP de la empresa NORIT, o A SUPRA EUR de la empresa NORIT, o ENO-PC de la empresa CECA, o L4S de la empresa CECA, o L3S de la empresa CECA, o CSA de la empresa CECA, pase sobre una resina de adsorción, o Amberlite XAD-4 de la empresa Rohm & Haas, o Amberlite XAD-761 de la empresa Rohm & Haas, o Amberlite XAD-1600 de la empresa Rohm & Haas, o Amberlite XAD-16 HP (= FPX66) de la empresa Dow, o Dowex SD2 de la empresa Dow, o Macronet MN-100 de la empresa Purolite, o Macronet MN-150 de la empresa Purolite, ultrafiltración con un umbral de corte diferente, por ejemplo: 5 kDa; 30 kDa; hidrólisis enzirnática utilizando enzimas especificas, por ejemplo: o b-l,3-glucanasa, o proteasas, o preparados enzimáticos con actividad mananasa (por ejemplo, Mannaway®, comercializado por la empresa NOVOZYMES, utilizado por sus propiedades detergentes y de aclaramiento), o preparados enzimáticos con actividad endo-beta-glucanasa (por ejemplo, SEBflo® TI, producido por la empresa Specialty Enzymes and Biotechnologies Co. y comercializado por Advanced Enzyme Technologies Ltd.)r o preparados enzimáticos con actividad proteasa ácida (por ejemplo, SEBPro® FL100, producido por la empresa Specialty Enzymes and Biotechnologies Co. y comercializado por Advanced Enzyme Technologies Ltd.).

La invención se comprenderá con mayor claridad mediante los siguientes ejemplos, que se pretende que sean ilustrativos y no limitantes.

Descripción de las Figuras de la Invención Figura 1: respuestas de las células Raw-Blue™ a agonistas estándar.

Figura 2: respuestas de las células HEK-Blue™ TLR2 a agonistas estándar.

Figura 3: respuestas de las células HEK-Blue™ TLR4 a agonistas estándar.

Figura 4: respuestas de las células HEK-Blue™ N0D2 a agonistas estándar.

Figura 5: respuestas de las células HEK-Blue™ Nuil a agonistas estándar.

Figura 6: respuestas de las células Raw-Blue™ inducidas por matrices no filtradas y tras el pase sobre filtros de 100 kDa y 30 kDa.

Figura 7: respuestas de las células HEK-Blue™ TLR2 inducidas por matrices no filtradas y tras el pase sobre filtros de 100 kDa y 30 kDa.

Figura 8: respuestas de las células HEK-Blue™ TLR4 inducidas por matrices no filtradas y tras el pase sobre filtros de 100 kDa y 30 kDa.

Figura 9: respuestas de las células HEK-Blue™ N0D2 inducidas por matrices no filtradas y tras el pase sobre filtros de 100 kDa y 30 kDa.

Figura 10: respuestas de las células HEK-Blue™ Nuil inducidas por las matrices.

Figura 11: evaluación de las actividades inflamatorias de las diferentes matrices.

Figura 12: respuestas de las células inducidas por las matrices tras el pase sobre carbón SX+.

Figura 13: respuestas de las células inducidas por la matriz E3063 tras el pase sobre varios tipos de carbón.

Figura 14: respuestas de las células inducidas por la matriz E1565 tras el pase sobre varios tipos de carbón.

Figura 15: respuestas de las células inducidas por la matriz E1242 tras el pase sobre varios tipos de carbón.

Figura 16: respuestas de las células inducidas por la matriz Lab3943 tras el pase sobre varios tipos de carbón.

Figura 17: respuestas de las células inducidas por la matriz E1565 tras el tratamiento por ultrafiltración de 5 kDa.

Figura 18: respuestas de las células inducidas por la matriz Lab3943 tras el tratamiento por ultrafilt ación de 5 kDa.

Figura 19: respuestas de las células inducidas por las matrices E3063 y E5250 tras el tratamiento con Mannaway®.

Figura 20: respuestas de las células inducidas por la matriz E5250 tras el tratamiento con SEBflo® TL.

Figura 21: respuestas de las células inducidas por la matriz E3063 tras el tratamiento con SEBPro® FL100.

Figura 22: respuestas de las células inducidas por la matriz E1565 tras el tratamiento con resinas industriales.

Ejemplos Ejemplo 1: establecimiento de las curvas de dosis-respuesta Las curvas de dosis-respuesta se producen con moléculas agonistas estándar: LPS, PGN, LTA, zimosano y MDP. Se incuban las lineas Raw-Blue™ y HEK-Blue™ TLR2, TLR4, NOD2 y Nuil con concentraciones cada vez mayores de agonistas y se mide la respuesta de las células cuantificando la actividad SEAP (Figuras 1-5). Se utiliza TNF-a como control positivo para la activación celular: linea Raw-Blue™: las células responden a las principales moléculas inflamatorias que pueden estar presentes en las matrices y los derivados de polímeros de glucosa (PGN, LPS, zimosano, LTA); en particular presentan una reactividad marcada con respecto a los PGN, pero no responden a sus productos de despolimerización (MDP). línea HEK-Blue™ hTLR2: reactividad marcada respecto a los LPS; las células responden de forma más débil a los demás ligandos de TLR2 (LTA, zimosano) y no presentan reactividad respecto a los LPS ni MDP. - línea HEK-Blue™ hTLR4: reactividad marcada respecto a los LPS; las células responden de forma muy débil al zimosano y no presentan reactividad respecto a PGN, LTA ni MDP. - línea HEK-Blue™ hNOD2: reactividad marcada respecto a MDP. línea HEK-Blue™ Null2: control para la ausencia de toxicidad celular.

Ejemplo 2: preparación de varias matrices de polímeros de glucosa diferentes y de un lote de hidrolizado de polímeros de glucosa Según se ha indicado anteriormente, las matrices son las siguientes: 5 polímeros de glucosa, materiales de partida de icodextrina (antes del fraccionamiento cromatográfico de acuerdo con el contenido de la patente EP 667 356), que se denominan en la presente E1565, E3063, E1242, E5248 y E5250.

La preparación de estos cinco polímeros se lleva a cabo de acuerdo con el contenido de la solicitud de patente WO 2012/059685.

Un lote contaminado de icodextrina (que se denomina en la presente E209J) y un lote "estándar" de icodextrina, es decir, un control para la ausencia de contaminación en las pruebas celulares (que se denomina en la presente Pll-11). Estos lotes se preparan de acuerdo con el contenido de la patente EP 667 356 y se describen detalladamente en el Ejemplo 1 de la solicitud de patente WO 2010/125315.

Un lote de maltodextrina ramificada, comercializada por la empresa solicitante con el nombre comercial NUTRIOSE® FB06.

Un lote de dextrosa monohidratada, preparada de modo que esté acondicionada en una solución inyectable, comercializada por la empresa solicitante con el nombre comercial LYCADEX® PF.

Un lote de polímeros de glucosa solubles y muy ramificados para diálisis peritoneal, que se denomina en la presente LAB3943.

Este lote se prepara mediante un tratamiento enzimático doble con una enzima ramificadora y una amiloglucosidasa de acuerdo con el Ejemplo 2 de la solicitud de patente WO 2007/099212.

Una maltodextrina comercial (maltodextrina de Cargill, C*Dry MD 01915, lote 02044770), que se denomina en la presente Cargill.

Ejemplo 3: análisis de las respuestas de las células inducidas por las muestras no tratadas o tras su pase sobre un filtro de 100 kDa o 30 kDa El objetivo de estas pruebas consiste en determinar la reactividad proinflamatoria y la naturaleza de los contaminantes presentes en las matrices de polímeros de glucosa y el lote de hidrolizado de polímeros de glucosa.

Las muestras de acuerdo con el Ejemplo 2 se preparan con una concentración de un 32% (peso/volumen) en agua no pirógena (para inyección).

Los ensayos de los niveles de LPS y PGN se llevan a cabo antes de las pruebas celulares utilizando los ensayos de SLP-HS y LAL (se presentan los datos a continuación): Para las pruebas celulares, las muestras se diluyeron hasta 1/10 en el medio de cultivo celular (concentración final: 3.2% (p/v)).

Los análisis se llevaron a cabo en: la linea Raw-Blue™: cualesquiera contaminantes con una reactividad elevada frente a PGN, linea HEK-Blue™ hTLR2: reactividad elevada frente a PGN, línea HEK-Blue™ hTLR4: reactividad elevada frente a LPS, línea HEK-Blue™ hNOD2: MDP y productos de despolimerización de PGN, línea HEK-Blue™ Null2: control para la ausencia de toxicidad celular.

En las Figuras 6-10 se presentan los resultados según el tipo celular.

Respuestas de las celulas Raw (Figura 6): Con la excepción de la matriz Cargill, que proporciona una respuesta equivalente a la observada en presencia del control sin contaminación Pll-11, todas las demás muestras desencadenan una respuesta inflamatoria al entrar en contacto con la línea de macrófagos. Las matrices más reactivas son E-3063 (saturación de la respuesta de las células), a continuación E-1242 y E-1565. ' Los contaminantes son esencialmente moléculas de peso molecular elevado (por ejemplo, PGN, zimosano) o capaces de formar agregados (por ejemplo, LPS, LTA). Acemás, la filtración de 100 kDa redujo de forma significativa las respuestas inducidas por las muestras, lo cual indica que este tratamiento las eliminó en gran medida. Únicamente las matrices E-1242 y E-5250 siguieron presentando una actividad significativamente más elevada que la de Pll-11, lo cual indica que contienen contaminantes con un tamaño < 100 kDa, probablemente originados a partir de la degradación de contaminantes más grandes. La filtración de 30 kDa es aún más eficaz, ya que las diferentes muestras pierden prácticamente toda su actividad proinflamatoria tras el tratamiento.

Respuestas de las celulas HEK-TLR2 (Figura 7): Los resultados obtenidos con las células HEK-TLR2 confirman los resultados previos.

La matriz E-3063 induce una respuesta saturada, lo cual indica un nivel de contaminación inductor de TLR2 muy elevado. Las matrices E-1242, E-1565, Lab3943 e Ico-E209J también proporcionan respuestas elevadas, mayores que las observadas en las células Raw. Esta diferencia se explica por el hecho de que contienen inductores potentes de TLR2 (PGN o lipopéptidos).

Las filtraciones de 100 kDa y 30 kDa neutralizan las respuestas inflamatorias inducidas por estas muestras, lo cual indica que los contaminantes son principalmente PGN de peso molecular elevado. ? pesar de ello, las matrices E-3063 y E-1565 siguen exhibiendo una actividad significativa tras la filtración. Estos datos demuestran que estos compuestos contienen productos de degradación de PGN y/o lipopéptidos. En efecto, a diferencia de los PGN, los demás inductores potentes de TLR2 tienen un peso < 30 kDa y, por consiguiente, seguirían generando una respuesta celular tras la filtración.

Las matrices E-5250 y E-5248, así como también NUTRIOSE®, generaron respuestas débiles, de una intensidad equivalente a la observada con las células Raw, lo cual sugiere que estas tres muestras contienen inductores débiles de TLR2 (por ejemplo, zimosano, b-glucanos o LTA).

Como sucedió anteriormente, la matriz Cargill, asi como también LYCADEX®, no desencadenaron respuestas, lo cual indica una ausencia de contaminantes inductores de TLR2.

Respuestas de las células HEK-TLR4 (Figura 8): Las matrices E1565, E3063, Lab3943, Cargill y NUTRIOSE® desencadenan una respuesta de intensidad media en las células HEK-TLR4, lo cual confirma la presencia de LPS. Las filtraciones reducen en parte las respuestas de las células, lo cual se puede explicar por el hecho de que LPS puede formar agregados y que solo se eliminaron las moléculas no agregadas.

Las matrices E1242, IcoE209J, E5248, E5250 y LYCADEX® no desencadenan ninguna respuesta significativa, lo cual indica que los niveles de LPS se encuentran por debajo de los umbrales capaces de desencadenar una respuesta inflamatoria. Las primeras dos matrices generan una respuesta inflamatoria en las células Raw, que se correlaciona con una reactividad marcada en las células HEK-TLR2. Estos datos indican que estas dos matrices están esencialmente contaminadas con PGN. Las matrices E5248 y E5250, así como también LYCADEX®, desencadenan también una respuesta inflamatoria en las células Raw. Sin embargo, apenas son activas o no son activas en absoluto con respecto a TLR2, lo cual indica la presencia de contaminantes distintos de los PGN y LPS en estas tres muestras.

Respuestas de las células HEK-NOD2 (Figura 9): Las células HEK-NOD2 responden a todas las muestras, pero únicamente las matrices E-1565, Lab3943 y Cargill contienen concentraciones elevadas de inductores de NOD2. Este receptor reacciona con el producto final de la despolimerización de PGN (MDP), pero también con los productos de degradación de este de bajo peso molecular. Como consecuencia, la intensidad de las respuestas observadas indica que las muestras están y/o estaban contaminadas con PGN que ha sufrido un proceso de degradación más o menos avanzado. Como era de esperar, las filtraciones de 100 y 30 kDa no presentan ningún efecto significativo sobre la respuesta de las células, ya que los compuestos en cuestión (MDP y PGN degradados) son de tamaño pequeño.

Respuestas de las células HEK-Null (Figura 10): Finalmente, las células HEK-Null no generan respuestas significativas en presencia de las diferentes muestras, lo cual demuestra que las reactividades observadas en las otras lineas celulares no están relacionadas con un efecto tóxico, sino que en su lugar se relacionan con una respuesta de tipo inflamatorio.

Evaluación en función de la muestra (Figura 11): E1242: actividad inflamatoria de intensidad media relacionada con una contaminación pronunciada de PGN ligeramente degradados.

E1565: actividad inflamatoria de intensidad media relacionada con una contaminación pronunciada de PGN ligeramente degradados y con la presencia de LPS.

E3063: actividad inflamatoria de intensidad elevada relacionada con una contaminación muy pronunciada de PGN ligeramente degradados y con trazas de LPS.

E5248: actividad inflamatoria de intensidad baja relacionada con una contaminación débil de PGN y con la presencia de moléculas inflamatorias distintas de PGN y LPS.

E5250: actividad inflamatoria de intensidad baja relacionada con una contaminación débil de PGN y con la presencia de moléculas inflamatorias distintas de PGN y LPS.

Lab3943: actividad inflamatoria de intensidad media relacionada con contaminaciones medias de PGN ligeramente degradados y de LPS.

IcoE209J: actividad inflamatoria de intensidad media relacionada con una contaminación pronunciada de PGN ligeramente degradados.

Cargill: ausencia de actividad inflamatoria detectable, pero presencia de productos de degradación de PGN.

NUTRIOSE®: actividad inflamatoria de intensidad media relacionada con trazas de PGN ligeramente degradados y con una contaminación media de LPS.

LYCADEX®: actividad inflamatoria de intensidad baja relacionada con una contaminación débil de productos de degradación de PGN y con la presencia de moléculas inflamatorias distintas de PGN y LPS.

Ejemplo 4: efecto de los tratamientos de pase sobre carbones activados En una primera serie de experimentos, se sometieron todas las muestras a dos tratamientos sucesivos con el mismo carbón (un 1% de carbón NORIT SX+, a 80 °C durante 1 h).

La Figura 12 presenta los resultados obtenidos con la linea celular.

El primer tratamiento con carbón reduce drásticamente la capacidad de las muestras E1242, E-565, E3063 e IcoE209J de desencadenar una respuesta inflamatoria en las células Raw y HEK-TLR2. En cualquier caso, el segundo tratamiento mejora adicionalmente la eliminación de las moléculas responsables de la respuesta inflamatoria. El efecto del tratamiento es mucho menos pronunciado para las muestras E5248, E5250, Lab3943 y NUTRIOSE®. Estos datos indican que el tratamiento con el carbón SX+ seria eficaz para eliminar PGN que prácticamente no estuvieran degradados, con lo que reducirla la actividad inflamatoria de las matrices en las cuales predominasen estos contaminantes.

Para las células HEK-TLR4, la respuesta es muy reducida para las matrices E1565, Lab3943 y NUTRIOSE®, que son las que están más contaminadas con LPS. Sin embargo, el efecto no es tan pronunciado como en el caso de las respuestas atribuidas a PGN, lo cual muestra una cinética especifica para LPS.

Los tratamientos con el carbón SX+ ejercen un efecto pequeño sobre la respuesta de las células HEK-NOD2, lo cual indica que los productos de degradación de PGN no son eliminados correctamente. Finalmente, las células HEK-Null no son reactivas respecto a las muestras tratadas, lo cual excluye cualquier efecto tóxico asociado con el carbón.

Las diferencias observadas tras el tratamiento de pase sobre carbón activado eran de esperar, ya que las pruebas previas indican que las muestras contienen contaminantes de diferente naturaleza molecular. Una información importante proporcionada por este experimento es la demostración de que existe una diferencia en la eficacia que depende del tamaño de los contaminantes. Por lo tanto, el tratamiento con carbón SX+ ejercerla un efecto más pronunciado en la eliminación de una cierta categoría de contaminantes, en particular PGN de peso molecular elevado.

Con el fin de confirmar esta hipótesis, se evaluaron varios carbones de diferente porosidad para determinar su eficacia a la hora de descontaminar las matrices E3063, E1565, E1242 y Lab3943.

A diferencia de las matrices E3063 y E1242, las cuales están contaminadas principalmente con PGN de gran tamaño (respuesta de TLR2 pronunciada), las matrices E1565 y Lab3943 contienen PGN parcialmente degradados (respuestas de TLR2 y NOD2) y LPS (respuesta de TLR4).

Las condiciones de tratamiento optimizadas son las siguientes: carbón con una concentración de un 0.5%, pH ajustado a 4.5, incubación durante 1 h a 80 °C. Después del tratamiento, las muestras se filtran a través de un filtro de 0.22 mm y a continuación se utilizan en las pruebas celulares.

Los resultados para la matriz E3063 se presentan en la Figura 13.

La ausencia de respuesta en las células HEK-Null confirma que ninguno de los carbonos exhibe toxicidad celular.

Todos los carbones evaluados son eficaces para reducir drásticamente las respuestas de las células Raw y HEK-TLR2, lo cual confirma su eficacia a la hora de eliminar los PGN de gran tamaño, que son los contaminantes principales de esta matriz.

Cabe destacar que los carbones nuevos son equivalentes a SX+ o más eficaces que este.

Por lo tanto, las muestras tratadas con L4S, L3S, ENO-PC, C-extra USP y SX2 inducen respuestas celulares similares al ruido de fondo en las células HEK-TLR2, lo cual sugiere que estos carbones son más eficaces a la hora de eliminar los PGN.

En cuanto a los carbones menos eficaces, la filtración de 30 kDa y 100 kDa reduce las respuestas residuales después del tratamiento, lo cual demuestra que son debidas esencialmente a trazas de PGN no eliminados.

Se observan los mismos resultados en las células Raw, con la excepción de L4S, que parece ser menos eficaz, y A-Supra-Eur, que, por el contrario, resulta ser más eficaz que en las células HEK-TLR2. Por consiguiente, este último carbón presenta un espectro más amplio de acción y elimina las otras moléculas, tales como LPS.

Aunque los carbones reducen significativamente la reactividad de las células HEK-N0D2 y HEK-TLR4 respecto a la matriz E3063, es difícil encontrar diferencias en la eficacia entre los tratamientos debido al pequeño tamaño de las respuestas inducidas por esta matriz en los dos tipos celulares.

Los resultados para la matriz E1565 se presentan en la Figura 14.

Como en el caso de la matriz E3063, los mismos carbones son eficaces a la hora de reducir las respuestas de las células HEK-TLR2 y Raw inducidas por E1565. Sin embargo, se pueden detectar algunas diferencias minoritarias, probablemente debido a las diferencias en los tamaños y, por consiguiente, en las propiedades de los PGN.

Prácticamente la totalidad de la respuesta de las células HEK-N0D2 se debe claramente a la presencia de productos de degradación de PGN, ya que la filtración de 30 kDa conserva los contaminantes solo muy ligeramente o no los conserva en absoluto. Por otro lado, los carbones no son muy eficaces a la hora de reducir la respuesta de estas células. Es más, la reducción de la respuesta provocada por la reducción de la carga de contaminantes de tipo MDP no supera un 50% de la respuesta máxima de las células.

Finalmente, los carbones presentan un efecto medio sobre la respuesta de TLR4. Con la excepción de SX+, que es muy eficaz a la hora de eliminar todas las formas de LPS, la reducción provocada por el tratamiento con otros carbones no supera un 50% de la respuesta inducida por la misma muestra que no haya sido tratada. Sin embargo, cabe destacar que los carbones L4S y A-Supra-Eur, y en menor grado los carbones C-extra USP y ENO-PC, son más eficaces a la hora de reducir las respuestas inducidas por moléculas de tamaño < 100 kDa, lo cual sugiere que estos carbones actúan preferentemente sobre LPS no agregados.

Los resultados para la matriz E1242 se presentan en la Figura 15.

Todos los carbones evaluados son eficaces a la hora de reducir las respuestas inducidas por la matriz E1242 en las células Raw y HEK-TLR2. Las respuestas obtenidas, que son similares o iguales al ruido de fondo, son idénticas antes y después de la filtración de 30 kDa y 100 kDa, lo cual demuestra que las moléculas grandes correspondientes a PGN han sido eliminadas.

La matriz E1242 está muy poco contaminada con LPS. A pesar de ello, se puede observar que ENO-PC y A-Supra-Eur son más eficaces que los demás carbones a la hora de reducir la respuesta de las células HEK-TLR4 hasta el nivel del ruido de fondo. Esta observación confirma que estos dos carbones presentan un espectro amplio de acción y que son eficaces a la hora de eliminar moléculas distintas de los PGN, tales como los LPS.

Finalmente, los carbones no son eficaces a la hora de eliminar los productos de degradación de PGN, con excepción de ENO-PC y SX2, los cuales reducen la respuesta de las células HEK-N0D2 aproximadamente un 50%.

Los resultados para la matriz Lab3943 se presentan en la Figura 16.

Esta matriz está contaminada con un amplio espectro de moléculas diferentes. Como era de esperar, todos los carbones reducen las respuestas inducidas en las células Raw, pero con eficacias diferentes. Cabe destacar que SX+, CSA, L4S y, en menor grado, A-Supra-Eur son los más eficaces, lo cual confirma que estos carbones presentan un espectro amplio de acción. Para las células HEK-TLR2, se observa que todos los carbones son eficaces a la hora de eliminar PGN, pero las respuestas residuales siguen siendo idénticas antes y después de la filtración, lo cual indica que los productos de degradación de PGN son más difíciles de eliminar.

El comportamiento de los carbones a la hora de eliminar los LPS también es variable. Por lo tanto, los carbones SX+, ENO-PC, L4S y A-Supra-Eur siguen siendo los más eficaces a la hora de reducir la respuesta de las células HEK-TLR . Finalmente, se observa que únicamente los carbones ENO-PC, C-Extra-USP y SX2 son relativamente activos a la hora de reducir de forma significativa la respuesta de las células HEK-N0D2, lo cual demuestra que son eficaces a la hora de eliminar los productos de degradación de PGN presentes en esta matriz.

C-extra-USP y SX2: eficaces a la hora de eliminar PGN y los productos de degradación de estos.

A-Supra-Eur: amplio espectro con mayor eficacia para moléculas de peso molecular elevado (por ejemplo: LPS agregados y PGN).

ENO-PC: amplio espectro con mayor eficacia para moléculas con un peso molecular < 100 kDa (por ejemplo: LPS y productos de degradación de PGN). otros carbones: espectro de acción y eficacia en el mejor de los casos equivalentes a los del carbón SX+.

Ejemplo 5: efecto de un tratamiento por ultrafiltración de 5 kDa El objetivo del tratamiento por ultrafiltración consiste en reducir, o incluso eliminar, la contaminación con moléculas de pequeño tamaño, con el fin de evaluar su participación en el desencadenamiento de una respuesta inflamatoria, tanto si se produce mediante un efecto directo o mediante un fenómeno de sinergia con otras moléculas contaminantes.

Los experimentos se llevaron a cabo con las matrices E1565 y Lab3943, las cuales están ambas contaminadas con PGN parcialmente degradados (respuestas de TLR2 y NOD2) y LPS (respuesta de TLR4).

La filtración de 5 kDa se llevó a cabo con una tasa de flujo media de 25 ml/min. Las tasas de flujo del filtrado son respectivamente de 55 ml/h para E1565 y de 65 ml/h para Lab3943.

Con el fin de verificar la eficacia de la ultrafiltración, las respuestas celulares se midieron en primer lugar utilizando muestras originadas a partir de las fracciones retenidas y de filtrado recuperadas después del pase de la solución de partida (100 mi).

A continuación, la ultrafiltración se llevó a cabo en un circuito cerrado con una inyección continua de las fracciones retenidas en la muestra de partida. Para compensar la pérdida de liquido debida a la eliminación del filtrado, el volumen de la muestra se ajustó de forma continuada hasta alcanzar el volumen de partida añadiendo agua para inyección. En este caso, las pruebas celulares se llevaron a cabo utilizando alícuotas tomadas a partir de la muestra después de 1 h, 2 h y 3 h de ultrafiltración.

Los resultados para la matriz E1565 se presentan en la Figura 17.

Las respuestas inducidas por las fracciones retenidas siguen siendo similares a las observadas por las muestras no filtradas en las cuatro pruebas celulares. Sin embargo, se observa una respuesta inflamatoria significativa como respuesta a las fracciones de filtrado en las células Raw y HEK-NOD2. Estos datos son compatibles con el umbral de corte del filtro (5 kDa), el cual permite que los productos de despolimerización de PGN pasen, pero no los PGN ni los LPS, especialmente si estos últimos se encuentran en forma de agregados. Por otro lado, la ausencia de una reducción de la respuesta inflamatoria en las fracciones retenidas indica que un único pase a través del filtro es ineficaz a la hora de reducir la reactividad inflamatoria de la matriz. Esto se debe a que la división entre las fracciones retenidas/de filtrado es de 25 a 1, lo cual resulta insuficiente para eliminar las moléculas inflamatorias pequeñas.

La ultrafiltración continuada es eficaz a la hora de reducir la respuesta inducida en las células HEK-NOD2, lo cual era predecible, pero también en las células Raw y HEK-TLR2. Debido a la contaminación de E1565 con PGN y LPS, la reducción de la respuesta en los dos últimos tipos celulares está relacionada ciertamente con una reducción de la actividad sinérgica de las moléculas inflamatorias pequeñas.

Los resultados para la matriz Lab3943 se presentan en la Figura 18.

Como era de esperar, se observa una actividad inflamatoria asociada con MDP en el filtrado (HEK-N0D2). También se observa una respuesta significativa en las células HEK-TLR . Este resultado indica que el LPS se encuentra en una configuración estructural menos agregada que la presente en la matriz E1565, lo cual le permite pasar a través del filtro.

Como en el caso de E1565, la filtración continuada es eficaz a la hora de reducir la carga de los productos de despolimerización de PGN, lo cual se pone de manifiesto mediante una clara reducción de la respuesta de las células HEK-NOD2 (efecto directo) y mediante una reducción menor pero significativa de la reactividad de las células Raw y HEK-TLR2 (acción sinérgica).

Ejemplo 6: efecto de los tratamientos enzimáticos El objetivo de estas pruebas consiste en evaluar la capacidad de enzimas industriales para reducir la reactividad proinflamatoria de los contaminantes presentes en matrices de polímeros de glucosa.

Las muestras se preparan con una concentración de un 32% (peso/volumen) y se tratan en presencia de las enzimas de acuerdo con las condiciones que se describen más adelante en la presente. Después del tratamiento, las enzimas se desactivan por calentamiento y las soluciones se filtran a través de un filtro estéril de 0.22 mm y a continuación se utilizan en las pruebas celulares.

Se evaluaron tres preparados enzimáticos industriales con el fin de determinar su capacidad para reducir la carga contaminante: - Mannaway®: incubación con una concentración de un 0.4% (vol/vol), pH 10, 50 °C, durante 4 h y 24 h.

- SEBflo® TL: incubación con una concentración de 0.35 mg/g de matriz, 50 °C, pH 5, desde 30 min hasta 24 h.

- SEBPro® FL100: incubación con una concentración de un 4% (vol/vol), pH 3, 55 °C, desde 1 h hasta 24 h.

Las dos matrices seleccionadas para las pruebas son: E3063 (contaminación pronunciada con PGN ligeramente degradados y trazas de LPS) y E5250 (contaminación débil de PGN y presencia de moléculas inflamatorias distintas de PGN y LPS).

Los efectos de los tratamientos de las dos matrices con Mannaway® se presentan en la Figura 19.

La adición de la solución enzimática a la matriz P-ll.ll (control sin contaminación) no induce ninguna respuesta inflamatoria en las células Raw, HEK-TLR2 ni HEK-TLR4. Se observa un ligero incremento en las células HEK-NOD2, lo cual sugiere la presencia de productos de degradación de PGN en cantidades traza. A pesar de ello, estos resultados muestran que la enzima utilizada en las condiciones del experimento no introduce contaminantes proinflamatorios importantes.

Las pruebas llevadas a cabo con la matriz E3063 muestran que la enzima ejerce probablemente una acción litica leve sobre los PGN, ya que se observa una reducción de las respuestas en las células Raw y HEK-TLR2. El tratamiento provoca un incremento de la respuesta de las células HEK-NOD2, que es compatible con una degradación parcial de PGN. Por otro lado, se observa también un incremento de la respuesta de las células HEK-TLR4. Debido a que el preparado enzimático no introduce ninguna contaminación, la aparición de LPS se debe probablemente a la liberación de este contaminante a partir de la matriz en si.

El tratamiento enzimático de la matriz E5250 induce un incremento de la respuesta inflamatoria en los cuatro tipos celulares. Originariamente, esta matriz desencadenó respuestas inflamatorias débiles. Como consecuencia, el incremento de las respuestas de TLR2 y TLR4 sugiere que la enzima liberó contaminantes de tipo PGN y LPS a partir de la matriz.

Mannaway® se utiliza habitualmente como un agente para aclarar productos de procesamiento de alimentos. Los resultados obtenidos sugieren que probablemente la enzima disoció macrocomplejos (residuos bacterianos) que eran eliminados normalmente por el paso de filtración a través de un filtro 0.22 mm. Al solubilizar estas moléculas inflamatorias, la enzima las hizo accesibles para inducir respuestas en las pruebas celulares.

Los efectos de los tratamientos de la matriz E5250 con SEBflo® TL se presentan en la Figura 20.

La adición de la solución enzimática a la matriz P-ll.ll no induce ninguna respuesta inflamatoria en los cuatro tipos celulares, lo cual demuestra que la enzima utilizada en las condiciones del experimento no introduce contaminantes.

El tratamiento de la matriz E5250 induce una ligera reducción de las respuestas inflamatorias en las células Raw y HEK-TLR2. La enzima se describe esencialmente por sus propiedades de beta-glucanasa. A pesar de ello, la reducción observada de las respuestas de las células viene acompañada por un incremento de la respuesta de las células HEK-NOD2. Estos datos indican que el preparado enzimático también contiene una actividad capaz de degradar PGN.

De forma paralela a la aparición de productos de degradación de PGN, se observa un ligero incremento de la respuesta de TLR4 en presencia de la enzima, aunque esta última no está contaminada. Del mismo modo que anteriormente, la enzima probablemente liberó contaminantes inflamatorios, pero en menor grado que el observado con Mannaway®.

Los efectos de los tratamientos de la matriz E3063 con SEBPro® FL100 se presentan en la Figura 21.

La adición del preparado enzimático a la matriz P-ll.ll induce una respuesta inflamatoria marcada en las células HEK-TLR4 y también provoca respuestas débiles pero significativas en las células Raw y HEK-TLR2. Estos datos indican que la enzima está contaminada con LPS y trazas de PGN.

La adición de la enzima a la matriz E3063 induce una ligera reducción de la respuesta de TLR2, que viene acompañada por un incremento de la respuesta de las células HEK-NOD2. Estos datos indican que SEBPro® FL100 ejerce una acción litica débil sobre PGN. ? pesar de ello, su uso requerirla de forma imprescindible un paso de descontaminación previo con el fin de eliminar los LPS.

Ejemplo 7: efecto de los tratamientos de pase sobre resinas El objetivo de estas pruebas consiste en evaluar la capacidad de resinas industriales para retener los contaminantes presentes en matrices de polímeros de glucosa y, como consecuencia, reducir la reactividad proinflamatoria de estas matrices.

Las pruebas se llevaron a cabo con la matriz E1565 (solubilizada con una concentración de un 32% de peso/volumen en agua estéril), ya que está contaminada con los diferentes tipos de moléculas proinflamatorias que se pueden encontrar en los circuitos de producción (respuestas de TLR2, TLR4 y NOD2).

Para los experimentos, la solución que se debía descontaminar se eluyó de forma continuada en una columna que contenia 20 mi de cada resina (volumen del lecho). Las pruebas celulares para determinar la reactividad inflamatoria se llevaron a cabo utilizando la solución antes del pase sobre la columna (control de contaminación) y a continuación en las muestras recuperadas después de hacer pasar 4 volúmenes (pase 5) y 10 volúmenes (pase 11) de solución. Este procedimiento permitió verificar que la presencia del polímero de glucosa no provocaría un fenómeno de saturación de la resina.

Los resultados se presentan en la Figura 22.

El pase de la solución sobre las diferentes resinas provoca una reducción de la reactividad inflamatoria de la matriz E1565 en contacto con las células Raw. Con la excepción de FPX66, la reducción de la respuesta alcanza al menos un 50% para las demás resinas. La reducción alcanzó incluso un 70% después del pase sobre la resina SD2, lo cual indica que esta resina es la más eficaz a la hora de eliminar las moléculas contaminantes con actividad proinflamatoria contenidas en la matriz E1565. En cualquier caso, no se observa ninguna diferencia significativa entre los pases 5 y 11, lo cual excluye cualquier fenómeno de saturación del sustrato.

La reactividad de las células HEK-TLR2 respecto a la matriz E5250 no se ve modificada de forma significativa tras el pase sobre las diferentes resinas, lo cual indica que estos tratamientos son ineficaces a la hora de reducir la carga de PGN contaminada.

Se observa que las resinas MN-100 y XAD-1600, por su parte, son muy eficaces a la hora de reducir las respuestas de HEK-TLR4 respecto a la matriz E1565. Estos datos indican que estas dos resinas tienen una capacidad elevada para retener moléculas de tipo LPS. En cambio, las demás resinas son prácticamente, o incluso totalmente, ineficaces a la hora de retener este contaminante.

Finalmente, las diferentes resinas redujeron de forma moderada las respuestas de las células HEK-NOD2 respecto a la matriz, con la excepción de FPX66, que resultó ser totalmente ineficaz. A pesar de ello, el efecto observado sigue siendo débil, lo cual demuestra que las resinas tienen poca capacidad para retener los productos de degradación de PGN.

A pesar de la presencia de trazas de LPS, la matriz E1565 está muy contaminada con PGN y con productos de degradación de este. Estos últimos presentan poca reactividad inflamatoria de por si; por otro lado, son capaces de actuar de forma sinérgica con las demás moléculas inflamatorias que interaccionan con los TLR, tales como PGN y LPS, y de exacerbar la respuesta inmunológica global.

Las pruebas llevadas a cabo en este ejemplo muestran una reducción significativa de la reactividad de las células Raw después del pase sobre las diferentes resinas. Esta reducción de la respuesta inflamatoria global no es consecuencia de la retención de PGN, ya que el pase sobre las resinas no modifica las respuestas de TLR2.

Solamente dos (MN-100, XAD-1600) de las siete resinas son claramente eficaces a la hora de reducir la respuesta de TLR4. Por consiguiente, se puede deducir de esto que la reducción de la respuesta inflamatoria observada en las células Raw es consecuencia, al menos en parte, de la retención de LPS tras el pase de la matriz sobre estas dos resinas.

Con la excepción de FPX66, todas las resinas retienen de forma moderada los productos de degradación de PGN. Debido al impacto de estas moléculas pequeñas sobre la exacerbación de las respuestas inflamatorias, estos resultados indican que el efecto principal de las resinas consiste en eliminar los efectos sinérgicos asociados con estas moléculas pequeñas.

En cuanto a la matriz FPX66, su efecto está relacionado probablemente con la eliminación de moléculas inflamatorias distintas de LPS, asi como también PGN y productos de degradación de estos. Esta hipótesis es compatible con el hecho de que esta resina es la menos eficaz a la hora de reducir la respuesta inflamatoria global.

En conjunto, estos datos indican que el tratamiento de las matrices con ciertas resinas industriales seleccionadas debidamente puede resultar eficaz a la hora de eliminar contaminantes inflamatorios distintos de PGN, asi como también a la hora de reducir los efectos de la sinergia observada entre estas moléculas. El Ejemplo 4 del presente estudio ha demostrado que algunos carbones industriales son particularmente eficaces para eliminar PGM. Como consecuencia, un procedimiento que combinase los dos tipos de tratamiento deberla permitir actuar sobre las diferentes familias de contaminantes y proporcionar matrices exentas de reactividad inflamatoria.

Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (13)

REIVINDICACIONES

1. Un método para evaluar el efecto de un paso de producción o pasos de producción o la eficacia de un paso de purificación o pasos de purificación sobre la presencia o la naturaleza de moléculas proinflamatorias en polímeros de glucosa o hidrolizados de estos, que comprende: a) proporcionar polímeros de glucosa o hidrolizados de estos; b) opcionalmente, detectar o analizar las moléculas proinflamatorias en los polímeros de glucosa o hidrolizados de estos proporcionados en el paso a); c) llevar a cabo el paso o pasos de producción o purificación en los polímeros de glucosa o hidrolizados de estos proporcionados en el paso a); d) detectar o analizar las moléculas proinflamatorias en los polímeros de glucosa o hidrolizados de estos obtenidos después del paso c); e) determinar la eficacia o el impacto del paso c) sobre la presencia o la naturaleza de las moléculas proinflamatorias; donde el paso para detectar o analizar las moléculas proinflamatorias en los polímeros de glucosa o hidrolizados de estos comprende una prueba de respuesta inflamatoria in vitro que utiliza una línea celular, siendo la línea celular o bien un macrófago o una línea celular diferenciada en macrófagos o una célula que expresa uno o más TLR (receptor de tipo Toll) o receptores NOD ( proteína que contiene un dominio de oligomerización de unión a nucleótidos) , tales como TLR2, TLR4 o N0D2, y permite detectar las respuestas del receptor o receptores, o una combinación de estos.

2. Un método optimizado para producir o purificar polímeros de glucosa o hidrolizados de estos, que comprende: a) proporcionar polímeros de glucosa o hidrolizados de estos; b) detectar o analizar las moléculas proinflamatorias en los polímeros de glucosa o hidrolizados de estos proporcionados en el paso a); c) seleccionar el paso o pasos para producir o purificar los polímeros de glucosa o hidrolizados de estos que sea o sean adecuados para las moléculas proinflamatorias presentes en los polímeros de glucosa o hidrolizados de estos; d) opcionalmente, llevar a cabo el paso o pasos de producción o purificación seleccionados en los polímeros de glucosa o hidrolizados de estos proporcionados en el paso a); y e) opcionalmente, detectar o analizar las moléculas proinflamatorias en los polímeros de glucosa o hidrolizados de estos obtenidos después del paso d); donde el paso para detectar o analizar las moléculas proinflamatorias en los polímeros de glucosa o hidrolizados de estos comprende una prueba de respuesta inflamatoria in vitro que utiliza una línea celular, siendo la línea celular o bien un macrófago o una línea celular diferenciada en macrófagos o una célula que expresa uno o más TLR (receptor de tipo Toll) o receptores NOD ( proteína que contiene un dominio de oligomerización de unión a nucleótidos) , tales como TLR2, TLR4 o NOD2, y permite detectar las respuestas del receptor o receptores, o una combinación de estos.

3. El método según se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde la prueba de respuesta inflamatoria in vitro comprende poner los polímeros de glucosa o hidrolizados de estos en contacto con la línea celular THP-1 diferenciada en macrófagos y sensible a MDP o LPS, donde las moléculas proinflamatorias se detectan o analizan midiendo la cantidad de RANTES o TNF-a producida por la línea celular.

4. El método según se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde la prueba de respuesta inflamatoria in vitro comprende poner los polímeros de glucosa o hidrolizados de estos en contacto con una línea de macrófagos transfectada con un gen marcador, cuya transcripción se encuentra bajo el control directo de las vías de señalización inflamatorias, tal como la línea Raw-Blue™, donde las moléculas proinflamatorias se detectan o analizan midiendo la actividad o la señal del gen marcador.

5. El método según se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde la prueba de respuesta inflamatoria in vitro comprende poner los polímeros de glucosa o hidrolizados de estos en contacto con una línea celular que expresa el receptor TLR2 y un gen marcador, cuya transcripción se encuentra bajo el control directo de las vías de señalización de TLR2, tal como la línea HEK-Blue™ hTLR2, donde las moléculas proinflamatorias se detectan o analizan midiendo la actividad o la señal del gen marcador.

6. El método según se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde la prueba de respuesta inflamatoria in vitro comprende poner los polímeros de glucosa o hidrolizados de estos en contacto con una línea celular que expresa el receptor TLR4 y un gen marcador, cuya transcripción se encuentra bajo el control directo de las vías de señalización de TLR4, tal como la línea HEK-Blue™ hTLR4, donde las moléculas proinflamatorias se detectan o analizan midiendo la actividad o la señal del gen marcador.

7. El método según se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde la prueba de respuesta inflamatoria in vitro comprende poner los polímeros de glucosa o hidrolizados de estos en contacto con una línea celular que expresa el receptor NOD2 y un gen marcador, cuya transcripción se encuentra bajo el control directo de las vías de señalización de NOD2, tal como la línea HEK-Blue™ hNOD2, donde las moléculas proinflamatorias se detectan o analizan midiendo la actividad o la señal del gen marcador.

8. El método según se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde la prueba de respuesta inflamatoria in vitro comprende poner los polímeros de glucosa o hidrolizados de estos en contacto con: a. la línea celular THP-1 diferenciada en macrófagos y sensible a MDP o LPS, donde las moléculas proinflamatorias se detectan o analizan midiendo la cantidad de RANTES o TNF-a producida por la línea celular; y/o b. una línea de macrófagos transfectada con un gen marcador, cuya transcripción se encuentra bajo el control directo de las vías de señalización inflamatorias, tal como la linea Raw-Blue™, donde las moléculas proinflamatorias se detectan o analizan midiendo la actividad o la señal del gen marcador; y/o c. una linea celular que expresa el receptor TLR2 y un gen marcador, cuya transcripción se encuentra bajo el control directo de las vías de señalización de TLR2, tal como la linea HEK-Blue™ hTLR2, donde las moléculas proinflamatorias se detectan o analizan midiendo la actividad o la señal del gen marcador; y/o d. una linea celular que expresa el receptor NOD2 y un gen marcador, cuya transcripción se encuentra bajo el control directo de las vías de señalización de NOD2, tal como la linea HEK-Blue™ hNOD2, donde las moléculas proinflamatorias se detectan o analizan midiendo la actividad o la señal del gen marcador; y/o e. una linea celular que expresa el receptor TLR4 y un gen marcador, cuya transcripción se encuentra bajo el control directo de las vías de señalización de TLR4, tal como la linea HEK-Blue™ hTLR4, donde las moléculas proinflamatorias se detectan o analizan midiendo la actividad o la señal del gen marcador; y/o f. una linea de control no transfectada con ningún receptor de inmunidad.

9. El método según se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde la prueba de respuesta inflamatoria in vitro comprende poner los polímeros de glucosa o hidrolizados de estos en contacto con: a. una línea de macrófagos transfectada con un gen marcador, cuya transcripción se encuentra bajo el control directo de las vías de señalización inflamatorias, tal como la línea Raw-Blue™, donde las moléculas proinflamatorias se detectan o analizan midiendo la actividad o la señal del gen marcador; b. una línea celular que expresa el receptor TLR2 y un gen marcador, cuya transcripción se encuentra bajo el control directo de las vías de señalización de TLR2, tal como la línea HEK-Blue™ hTLR2, donde las moléculas proinflamatorias se detectan o analizan midiendo la actividad o la señal del gen marcador; y/o c. una línea celular que expresa el receptor TLR4 y un gen marcador, cuya transcripción se encuentra bajo el control directo de las vías de señalización de TLR4, tal como la línea HEK-Blue™ hTLR4, donde las moléculas proinflamatorias se detectan o analizan midiendo la actividad o la señal del gen marcador; y/o d. una línea celular que expresa el receptor NOD2 y un gen marcador, cuya transcripción se encuentra bajo el control directo de las vías de señalización de NOD2, tal como la línea HEK-Blue™ hNOD2, donde las moléculas proinflamatorias se detectan o analizan midiendo la actividad o la señal del gen marcador; y e. una línea de control no transfectada con ningún receptor de inmunidad tal como la linea HEK-Blue™ Null2.

10. El método según se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde las moléculas proinflamatorias son moléculas de origen bacteriano, preferentemente seleccionadas entre PGN, LPS, lipopéptidos, productos de despolimerización de PGN, en particular MDP, péptidos microbianos formilados tales como f-MLP, y b-glucanos.

11. El método según se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde el paso o pasos de producción o purificación se selecciona o seleccionan entre pasos de tratamiento térmico, de acidificación, de pase sobre carbón activado, de pase sobre resinas de adsorción, de ultrafiltración, de filtración o de hidrólisis química o enzimática, o combinaciones de estos.

12. El método según se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde los polímeros de glucosa se seleccionan entre icodextrina y maltodextrinas, en particular maltodextrinas ramificadas o no ramificadas, y los hidrolizados de los polímeros de glucosa son un producto de hidrólisis total, tal como la dextrosa monohidratada.

13. El método según se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde las muestras de los polímeros de glucosa o de los hidrolizados de estos se prefiltran, en particular con un umbral de corte de 30 kDa, y el filtrado se pone en contacto con la línea celular utilizada en la prueba. RESUMEN DE LA INVENCION La presente invención se refiere a un método para determinar el impacto de un paso de producción o un paso de purificación sobre la presencia o la naturaleza de moléculas contaminantes proinflamatorias en polímeros de glucosa o hidrolizados de estos utilizando una prueba de respuesta inflamatoria ín vitro que emplea líneas celulares. También se refiere a un método optimizado para producir o purificar polímeros de glucosa o hidrolizados de estos que comprende un análisis de las moléculas contaminantes proinflamatorias en los polímeros de glucosa o los hidrolizados de estos y la selección de pasos de producción o purificación optimizados respecto a la presencia y la naturaleza de las moléculas contaminantes proinflamatorias.