CN105200038A

CN105200038A - 一种质粒dna规模化纯化方法

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Publication number: CN105200038A
Application number: CN201510673296.8A
Authority: CN
Inventors: 唐荣宏; 李亚杰; 杨保收; 付旭彬; 梁武
Original assignee: Tianjin Ringpu Bio Technology Co Ltd
Current assignee: Tianjin Ringpu Bio Technology Co Ltd
Priority date: 2015-10-16
Filing date: 2015-10-16
Publication date: 2015-12-30

Abstract

本发明提供了一种质粒DNA规模化纯化方法，该方法采用三步纯化，第一步通过加入氯化钙使细菌基因组DNA和RNA以及大部分杂蛋白凝集后，通过纱网和囊式滤器过滤去除大块杂质，然后通过较大孔径的澄清纯化滤膜过滤质粒DNA裂解液，除去裂解液中小的碎片以及基因组DNA；第二步通过较小孔径的浓缩纯化滤膜浓缩洗滤质粒DNA，达到除去质粒DNA裂解液中的小分子化学物质、杂蛋白，RNA等杂质以及实现浓缩质粒DNA等目的；第三步通过加入表面活性剂Triton？X-114，去除内毒素，并再次洗滤去除杂蛋白及RNA的杂质。以上方法依托于中空纤维超滤膜澄清纯化系统对质粒DNA进行纯化和浓缩，工艺合理有效，极大的提高了质粒DNA的生产效率，降低了纯化成本。

Description

一种质粒DNA规模化纯化方法

技术领域

本发明涉及基因纯化技术领域，具体涉及一种质粒DNA规模化纯化方法。

背景技术

DNA疫苗，又称核酸疫苗或基因疫苗，是指把携带编码外源抗原基因的DNA(通常是质粒)直接导入体内，通过抗原基因表达产物刺激机体产生特异性免疫反应以达到预防和治疗的目的。近年来，DNA免疫被誉为疫苗技术领域一场新的革命，并在许多动物模型中被证明能够提供免疫保护力抵抗人类免疫缺陷病毒(HIV)、结核分枝杆菌、禽流感等传染性病原体的攻击。但质粒DNA在靶细胞中的基因表达效率低、持续时间短，因而其用药剂量大，这使质粒DNA作为生物制剂产品的生产面临着新的挑战。目前需要建立的大规模生产过程，可生产毫克级到千克级产量的质粒DNA，除了数量上的要求，对质粒DNA制品的纯度要求也很高，因而分离、纯化是生产过程质粒DNA的重大挑战。

在实验室的条件下，质粒DNA产量通常较低，且提取和制备的质粒DNA损失严重。质粒的工业化大规模生产除了要除去杂质之外，还应该避免使用有毒，有机、易燃试剂和动物源性的酶试剂。

目前广泛使用规模化纯化质粒DNA色谱法产率低，成本高，效率低下。主要原因是目前市场上的商品化的填料主要是针对蛋白，但是质粒DNA结构与蛋白差异较大，所以导致质粒不能进入大多数的填料孔径内，这就会导致填料对质粒的吸附性能下降，这是色谱法生产质粒的主要缺点。其次色谱法纯化质粒DNA需多步骤，首先离子交换层析，疏水层析，最后凝胶层析。设备投入大，处理量有限，损失大。

当前质粒DNA的纯化工艺有产量低、成本高的缺点，因此设计和开发新型质粒生产方法有重要的意义。中空纤维膜过滤技术属于切向流过滤技术(TangentialFlowFiltration,TFF)的范畴，又称错流过滤(Cross-FlowFiltration，CFF)：料液以一定的流速在膜的上表面循环，小于膜孔径的物质可以透过膜到透过端，而大于膜孔径的物质会被膜截留，从而实现目标物质的浓缩以及不同物质的分级分离。中空纤维膜具有纤维管状的开放式流道结构，无筛网的管状流道结构避免了料液的无规则剧烈湍流，因此具有低的剪切力，温和的操作可以有效防止质粒DNA的断裂和杂质蛋白的聚集，有利于保护质粒DNA的超螺旋结构，同时有助于杂蛋白的透过和去除。目前，对于质粒DNA的中空纤维纯化及浓缩工艺尚无报道。

发明内容

本发明旨在针对现有技术的技术缺陷，提供一种质粒DNA规模化纯化方法，以解决现有技术的质粒DNA纯化方法不易实现规模化生产的技术问题。

本发明解决的另一技术问题是现有技术的质粒DNA纯化方法工艺过于复杂。

本发明解决的再一技术问题是现有技术的质粒DNA纯化方法成本较高。

本发明解决的又一技术问题是现有技术的质粒DNA纯化方法收率较低。

为实现以上技术目的，本发明采用以下技术方案：

一种质粒DNA疫苗纯化方法，该方法通过澄清纯化系统和浓缩系统来实现，在实施该方法之前所述澄清纯化系统和浓缩系统应当满足以下条件：

1系统的组装

无菌条件下，将澄清纯化系统和浓缩系统按照组装要求进行组装。在澄清系统中可安装无菌0.22μm、0.45μm或0.65μm、完整无损的中空纤维微滤膜，在浓缩系统中可安装安装无菌100KD或300KD、完整无损的中空纤维超滤膜。

2系统完整性检测

压力保持法检测系统的完整性。

3系统的处理

3.1清洗及灭菌

将0.5MNaOH溶液注满系统的进料罐，浸泡处理20min，开启循环泵300rpm，进行系统的清洗及灭菌处理30min。

3.2水洗及通量检测

灭菌结束后，排尽系统内的NaOH溶液。将无菌超纯水注满系统的进料罐，开启循环泵，300rpm循环30min，弃尽系统内的液体，如此反复水洗，直至系统内PH为7.0左右。

3.3PBS处理

水洗结束后，弃尽最后一次超纯水。将0.01MPBS溶液注满进料罐，开启循环泵300rpm循环冲洗20min。

上述所述技术方案中，步骤3.1和3.2中用到的NaOH溶液起到清洗、灭菌作用，也可选用50％～80％的酒精溶液，或采用蒸汽灭菌的方式进行系统灭菌。

一种质粒DNA规模化纯化方法，包括以下步骤：

1)将氯化钙加入质粒DNA的裂解液中，使终浓度为0.2～2mol/L，过夜沉淀后，用50～500目纱网过滤裂解液，然后再用10～100μm囊式滤器过滤裂解液；

2)将步骤1)过滤后裂解液注入澄清纯化系统的进料罐中，开启循环泵循环，而后经0.22～0.65μm中空纤维微滤柱微滤，收集透过液待用；

3)以1:2(v/v)的比例将无菌的0.01MPBS缓冲液加入进料罐中的截留液中，重悬，开启循环泵循环，收集透过液，得到第一洗滤液待用；

4)以1:2(v/v)的比例将无菌的0.01MPBS缓冲液加入进料罐中的截留液中，重悬，开启循环泵循环，收集透过液，得到第二洗滤液待用；

5)以1:2(v/v)的比例将无菌的0.01MPBS缓冲液加入进料罐中的截留液中，重悬，开启循环泵循环，收集透过液，得到第三洗滤液待用；

6)将步骤2)所述透过液、步骤3)所述第一洗滤液、步骤4)所述第二洗滤液、步骤5)所述第三洗滤液混合均匀，得到混合液；

7)将步骤6)得到的混合液注入浓缩系统的进料罐，开启循环泵循环，而后经100～500KD中空纤维超滤柱超滤，弃去透过液，收集进料罐中剩余截留液，即为初级质粒DNA裂解液；

8)以1:1(v/v)的比例将0.01MPBS注入进料罐中的初级质粒DNA裂解液中，重悬，开启循环泵循环，弃去透过液，收集进料罐中剩余截留液，即为二级质粒DNA裂解液；

9)以1:1(v/v)的比例将0.01MPBS注入进料罐中的二级质粒DNA裂解液中，重悬，开启循环泵循环，弃去洗滤液，收集进料罐中剩余截留液，即为三级质粒DNA裂解液；

10)以1:1(v/v)的比例将0.01MPBS注入进料罐中的三级质粒DNA裂解液中，重悬，开启循环泵，循环一定时间，弃去洗滤液，收集进料罐中剩余截留液，即为质粒DNA裂解液浓缩液；

11)在步骤10)得到的DNA裂解液浓缩液中加入终浓度0.5～2％(W/V)的TritonX-114，涡旋振荡后置于冰浴中10～40min；

12)将步骤11)处理后裂解液注入澄清纯化系统的进料罐中，开启循环泵循环，而后经0.1～0.45μm中空纤维微滤柱微滤，收集透过液待用；

13)将步骤12)得到的透过液注入浓缩系统的进料罐，并注入4倍体积的0.01MPBS，开启循环泵循环，经100～500KD中空纤维超滤柱超滤，弃去透过液，收集进料罐中剩余截留液，即为初级质粒DNA纯化液；

14)以2:1(v/v)的比例将0.01MPBS注入进料罐中的初级质粒DNA裂解液中，重悬，开启循环泵循环，而后弃去透过液，收集进料罐中剩余截留液，即为二级质粒DNA纯化液；

15)以2:1(v/v)的比例将0.01MPBS注入进料罐中的二级质粒DNA裂解液中，重悬，开启循环泵循环，而后弃去洗滤液，收集进料罐中剩余截留液，即为三级质粒DNA纯化液；

16)以2:1(v/v)的比例将0.01MPBS注入进料罐中的三级质粒DNA裂解液中，重悬，开启循环泵循环，而后弃去洗滤液，收集进料罐中剩余截留液，即为质粒DNA纯化液；

17)将步骤16)得到质粒DNA纯化液，用0.22μm囊式滤器过滤除菌，得到纯化的质粒DNA成品。

优选的，步骤1)所述的加入的氯化钙，使终浓度为2mol/L。

优选的，步骤1)所述的纱网孔径为200目，囊式滤器的孔径为30μm。

优选的，步骤2)所述的微滤的滤膜孔径为0.45μm。

优选的，步骤7)所述的超滤滤膜孔径为300KD。

优选的，步骤11)所述的加入的TritonX-114，使终浓度为1.5％(W/V)。

优选的，步骤11)所述的冰浴时间为30min。

优选的，步骤12)所述的微滤的滤膜孔径为0.22μm。

优选的，步骤13)所述的超滤滤膜孔径为300KD。

优选的，以上步骤2)、3)、4)、5)、7)、8)、9)、10)、12)、13)、14)、15)或16)中所述开启循环泵循环的操作条件均为400rpm循环30min。

将上述制备的质粒DNA成品保存于4℃。

在本发明中，所述澄清纯化系统专指生物技术领域中的中空纤维澄清纯化系统，进一步可以专指由通用电气公司(GeneralElectricCompany，GE)出品的型号为FlexStand的中空纤维澄清纯化系统。所述浓缩系统是指生物技术中内装有中空纤维超滤柱、能够执行超滤浓缩的的各种装置。

上述质粒DNA纯化方法，采用的是三步纯化法，第一步通过加入氯化钙使细菌基因组DNA和RNA以及大部分杂蛋白凝集后，通过纱网和囊式滤器过滤去除大块杂质，然后通过较大孔径的澄清纯化滤膜过滤质粒DNA裂解液，除去裂解液中小的碎片以及基因组DNA；第二步通过较小孔径的浓缩纯化滤膜浓缩洗滤质粒DNA，达到除去质粒DNA裂解液中的小分子化学物质、杂蛋白，RNA等杂质以及实现浓缩质粒DNA等目的；第三步通过加入表面活性剂TritonX-114，去除内毒素，并再次洗滤去除杂蛋白及RNA的杂质。

上述质粒DNA纯化方法中，步骤1)所述的加入的氯化钙，使终浓度为2mol/L；骤1)所述的纱网孔径为200目，囊式滤器的孔径为30μm；步骤2)所述的微滤的滤膜孔径为0.22μm；步骤7)所述的超滤滤膜孔径为300KD；步骤11)所述的加入的TritonX-114，使终浓度为1.5％(W/V)；步骤11)所述的冰浴时间为30min；步骤12)所述的微滤的滤膜孔径为0.22μm；步骤13)所述的超滤滤膜孔径为300KD；步骤2、3、4、5、7、8、9、10、12、13、14、15、16中所述的开启循环泵循环一定时间的操作条件均为400rpm循环30min；上述所述质粒DNA澄清纯化及浓缩方法，步骤2)中透过液的体积可以根据需要进行调整，优选为透过液体积达到原液的90％；步骤7)中的浓缩倍数可以根据实际需要进行调整，优选为浓缩50倍以上。

本发明的优点：

1、本发明的纯化方法综合采用三级纯化，重复洗滤，表面活性剂去除内毒素等一系列工艺，最大限度的增大了PCV2的回收效率，降低了纯化成本，提高了质粒DNA的纯度。

2、本发明纯化质粒DNA的工艺及设备易线性放大，适用于规模化生产质粒DNA疫苗。

3、本发明纯化质粒DNA的工艺安全，尽量避免使用了有毒，易燃易爆有机试剂和动物源性的酶试剂。

4、本发明所纯化的质粒DNA各项检测指标均能达到或接近中国食品和药品监督管理局(CFDA)的质量标准。

本发明采用美国通用电气公司(GeneralElectricCompany，GE)的中空纤维超滤膜澄清纯化系统对质粒DNA进行纯化和浓缩，并设计了一整套工艺，极大的提高了质粒DNA的生产效率，降低了纯化成本。

附图说明

图1是本发明具体实施方式中纯化后的质粒DNA成品核酸电泳检测结果。

具体实施方式

以下将对本发明的具体实施方式进行详细描述。为了避免过多不必要的细节，在以下实施例中对属于公知的结构或功能将不进行详细描述。

以下实施例中所使用的近似性语言可用于定量表述，表明在不改变基本功能的情况下可允许数量有一定的变动。因此，用“大约”、“左右”等语言所修正的数值不限于该准确数值本身。在一些实施例中，“大约”表示允许其修正的数值在正负百分之十(10％)的范围内变化，比如，“大约100”表示的可以是90到110之间的任何数值。此外，在“大约第一数值到第二数值”的表述中，大约同时修正第一和第二数值两个数值。在某些情况下，近似性语言可能与测量仪器的精度有关。

除有定义外，以下实施例中所用的技术和科学术语具有与本发明所属领域技术人员普遍理解的相同含义。

以下实施例中所用的试验试剂耗材，如无特殊说明，均为常规生化试剂；所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值；以下实施例中的％，如无特别说明，均为质量百分含量。

实施例1

1仪器及试剂

1.1实施例所用仪器如下：

中空纤维澄清纯化系统，型号：FlexStand；微滤柱，0.22μm；超滤柱，300KD，购自GE公司。30μm、0.22μm囊式滤器购自多明尼克公司。

1.2实施例所用试剂如下：

(1)100L质粒DNA裂解液，由本公司生产；

(2)0.5MNaOH100L；0.01MPBS200L；高纯水100L；

2本实施例包括以下步骤

2.1前处理

2.1.1系统的组装

无菌条件下，将澄清纯化系统和浓缩系统按照组装要求进行组装。在澄清系统中可安装无菌0.22μm、完整无损的中空纤维微滤膜，在浓缩系统中安装孔径为300KD的无菌中空纤维超滤膜；

2.1.2系统完整性检测

压力保持法检测系统的完整性。

2.1.3系统的处理

清洗及灭菌：

水洗及通量检测：

PBS处理：

2.2质粒DNA的澄清纯化

2.2.1质粒DNA裂解液的处理

将氯化钙加入质粒DNA的裂解液中，使终浓度为2mol/L。过夜沉淀后，用200目纱网过滤裂解液，然后再用30μm囊式滤器过滤裂解液。

2.2.2质粒DNA裂解液的澄清

澄清系统处理完毕后，弃尽系统内的PBS溶液，将振荡处理后的质粒DNA裂解液，注入澄清纯化系统的进料罐中，开启循环泵，400rpm循环30min，经0.22μm中空纤维微滤柱进行纯化处理，收集透过液90L，进料罐内存留截留液10L。

2.2.3截留液的洗滤

第一次洗滤：

将10L无菌的0.01MPBS加入进料罐中的截留液中，重悬，开启循环泵400rpm循环30min，收集透过液10L。

第二次洗滤：

第三次洗滤：

2.2.4质粒DNA裂解液的收集

将上述澄清纯化过程所收集的透过液及三次洗滤液混合均匀，得到混合液120L。

2.3质粒DNA浓缩纯化

浓缩系统处理完毕后，将混合液注入浓缩系统的进料罐，开启循环泵，400rpm循环30min，经300KD中空纤维超滤柱进行纯化处理，弃去透过液，进料罐中剩余截留液2L，记为初级质粒DNA浓缩液。

2.3.1浓缩液的洗滤

第一次洗滤：

将4L0.01MPBS注入进料罐中的初级浓缩液中，重悬，开启循环泵，400rpm循环30min，弃去透过液4，进料罐中剩余截留液2L，记为二级质粒DNA浓缩液。

第二次洗滤：

将4L0.01MPBS注入进料罐中的二级浓缩液，重悬，开启循环泵，400rpm循环30min，弃去洗滤液4L，进料罐中剩余截留液2L，记为三级质粒DNA浓缩液。

第三次洗滤：

将4L0.01MPBS注入进料罐中的三级浓缩液，重悬，开启循环泵，400rpm循环30min，弃去洗滤液4L，进料罐中剩余截留液2L，即为质粒DNA裂解液最终浓缩液。

2.4第三步精细纯化

将质粒DNA裂解液浓缩液中加入TritonX-11430g使终浓度为1.5％(W/V)，涡旋振荡后置于冰浴中30min，期间多次混匀样品。

澄清系统处理完毕后，弃尽系统内的PBS溶液，将振荡处理后的质粒DNA裂解液，注入澄清纯化系统的进料罐中，开启循环泵，400rpm循环30min，经0.22μm中空纤维微滤柱进行纯化处理，收集透过液。

浓缩系统处理完毕后，将透过液注入浓缩系统的进料罐，并注入0.01MPBS8L，开启循环泵，400rpm循环30min，经300KD中空纤维超滤柱进行纯化处理，弃去透过液，进料罐中剩余截留液2L，记为初级质粒DNA纯化液。

第一次洗滤：

将4L0.01MPBS注入进料罐中的初级浓缩液中，重悬，开启循环泵，400rpm循环30min，弃去透过液4L，进料罐中剩余截留液2L，记为二级质粒DNA纯化液。

第二次洗滤：

将4L0.01MPBS注入进料罐中的二级浓缩液，重悬，开启循环泵，400rpm循环30min，弃去洗滤液4L，进料罐中剩余截留液2L，记为三级质粒DNA纯化液。

第三次洗滤：

将4L0.01MPBS注入进料罐中的三级浓缩液，重悬，开启循环泵，400rpm循环30min，弃去洗滤液4L，进料罐中剩余截留液2L，即为质粒DNA纯化液。

2.4除菌过滤

将得到质粒DNA纯化液，用0.22μm囊式滤器过滤除菌，得到纯化的质粒DNA成品。

将经过上述处理后的得到的质粒DNA成品保存于4℃。

3质粒DNA回收率测定

将裂解液和已知定量质粒使用凝胶核酸电泳，跑胶检测，电泳图像用凝胶成像仪显现并得到，再以伯乐公司ImageLab凝胶成像系统计算出裂解液中质粒含量。通过计算本发明的质粒DNA回收率高于80％。

4质粒DNA质量检测

对纯化的质粒DNA样品进行质粒DNA含量，纯度，超螺旋比例，蛋白污染，宿主基因组DNA及RNA进行检测，以分析纯化工艺的有效性。

3.1质粒DNA含量的检测：

用紫外分光光度计测其在波长260nm时的吸收值，测量3次，取平均值，每毫升质粒含量应不低于1mg。

3.2质粒DNA纯度检测：

用紫外分光光度计测其在波长260nm和280nm时测定吸收值，其260nm/280nm比值应在1.8～2.0之间。

3.3蛋白污染检测。

使用BCA蛋白浓度检测试剂盒进行。蛋白质含量低于10μg/mL。

3.4基因组DNA和RNA污染物检测

使用琼脂糖核酸电泳跑胶检测，电泳图像用凝胶成像仪显现并得到，应检测不到相应条带。

3.5超螺旋含量检测方法

使用琼脂糖核酸电泳跑胶检测，电泳图像用凝胶成像仪显现并得到，再以伯乐公司ImageLab凝胶成像系统计算出超螺旋体DNA质粒及各类质粒构型的图像映像点，从而计算出超螺旋体DNA质粒在总DNA质粒量的百分比。超螺旋体DNA质粒占总质粒量的比例不少于90％。

综上所述，利用本发明纯化得到的质粒DNA。

实施例2

1截留液的洗滤

第一次洗滤：

第二次洗滤：

第三次洗滤：

质粒DNA裂解液的收集

2质粒DNA浓缩纯化

浓缩系统处理完毕后，将混合液注入浓缩系统的进料罐，开启循环泵，400rpm循环30min，经100KD中空纤维超滤柱进行纯化处理，弃去透过液，进料罐中剩余截留液2L，记为初级质粒DNA浓缩液。

2.1浓缩液的洗滤

第一次洗滤：

第二次洗滤：

第三次洗滤：

实施例3

澄清系统处理完毕后，弃尽系统内的PBS溶液，将振荡处理后的质粒DNA裂解液，注入澄清纯化系统的进料罐中，开启循环泵，400rpm循环30min，经0.45μm中空纤维微滤柱进行纯化处理，收集透过液90L，进料罐内存留截留液10L。

1截留液的洗滤

第一次洗滤：

第二次洗滤：

第三次洗滤：

质粒DNA裂解液的收集

2质粒DNA浓缩纯化

2.1浓缩液的洗滤

第一次洗滤：

第二次洗滤：

第三次洗滤：

实施例4

浓缩系统处理完毕后，将透过液注入浓缩系统的进料罐，并注入0.01MPBS8L，开启循环泵，400rpm循环30min，经100KD中空纤维超滤柱进行纯化处理，弃去透过液，进料罐中剩余截留液2L，记为初级质粒DNA纯化液。

第一次洗滤：

第二次洗滤：

第三次洗滤：

以上对本发明的实施例进行了详细说明，但所述内容仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明。凡在本发明的申请范围内所做的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种质粒DNA规模化纯化方法，其特征在于包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的质粒DNA规模化纯化方法，其特征在于步骤1)所述的加入的氯化钙，使终浓度为2mol/L。

3.根据权利要求1所述的质粒DNA规模化纯化方法，其特征在于步骤1)所述的纱网孔径为200目，囊式滤器的孔径为30μm。

4.根据权利要求1所述的质粒DNA规模化纯化方法，其特征在于步骤2)所述的微滤的滤膜孔径为0.45μm。

5.根据权利要求1所述的质粒DNA规模化纯化方法，其特征在于步骤7)所述的超滤滤膜孔径为300KD。

6.根据权利要求1所述的质粒DNA规模化纯化方法，其特征在于步骤11)所述的加入的TritonX-114，使终浓度为1.5％(W/V)。

7.根据权利要求1所述的质粒DNA规模化纯化方法，其特征在于步骤11)所述的冰浴时间为30min。

8.根据权利要求1所述的质粒DNA规模化纯化方法，其特征在于步骤12)所述的微滤的滤膜孔径为0.22μm。

9.根据权利要求1所述的质粒DNA规模化纯化方法，其特征在于步骤13)所述的超滤滤膜孔径为300KD。

10.根据权利要求1所述的质粒DNA规模化纯化方法，其特征在于步骤2)、3)、4)、5)、7)、8)、9)、10)、12)、13)、14)、15)或16)中所述开启循环泵循环的操作条件均为400rpm循环30min。