CN103038247A - 蛋白质提纯的装置和方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及提纯蛋白质的装置和方法。该装置涉及使用捕获色谱树脂、布置在捕获色谱树脂后的深度过滤器和布置在深度过滤器后的混合模式色谱树脂。该方法涉及提供含有蛋白质的样品，经由捕获色谱树脂、深度过滤器和混合模式色谱树脂加工样品。膜吸附器或整料可取代混合模式色谱柱。

Description

蛋白质提纯的装置和方法
对相关申请的交叉引用
本申请要求2010年5月18日提交的美国临时专利申请序号No. 61/345,634的优先权，其全文经此引用并入本文。
发明背景
本发明大体上涉及提纯蛋白质的装置和方法。
大规模蛋白质提纯的经济性是重要的，特别是治疗性抗体而言，因为抗体构成市面上的治疗生物学的很大百分比。除它们的治疗价值外，单克隆抗体例如也是诊断领域中的重要工具。已经开发出许多单克隆抗体并用于诊断许多疾病、妊娠和用于药物测试。
典型提纯法涉及多个色谱步骤以满足纯度、收率和吞吐量要求。这些步骤通常涉及捕获、中间提纯或抛光、和最终抛光。亲和色谱法（蛋白质A或G）或离子交换色谱法常用作捕获步骤。传统上，捕获步骤后接着至少两个其它中间提纯或抛光色谱步骤以确保足够的纯度和病毒清除。中间提纯或抛光步骤通常通过亲和色谱法、离子交换色谱法或疏水相互作用等方法完成。在传统方法中，最终抛光步骤可以通过离子交换色谱法、疏水相互作用色谱法或凝胶过滤色谱法完成。这些步骤从产品流和细胞培养物中除去工艺和产品相关的杂质，包括宿主细胞蛋白（HCP）、DNA、浸出的蛋白A、聚集体、片段、病毒和其它小分子杂质。
发明概述
简言之，本发明涉及从含有要提纯的蛋白质的样品中提纯蛋白质的装置，其包含捕获色谱树脂、相对于捕获色谱树脂布置的深度过滤器以使样品经过捕获色谱树脂进入深度过滤器，和相对于深度过滤器布置的混合模式色谱树脂以使样品经过深度过滤器进入混合模式色谱树脂。
另外，本发明涉及提纯蛋白质的方法，其包括提供含有蛋白质的样品，经由捕获色谱树脂加工样品以提供包含该蛋白质的第一洗脱液，在经由捕获色谱树脂加工样品后，经由深度过滤器加工第一洗脱液以提供包含该蛋白质的过滤洗脱液，和在经由深度过滤器加工第一洗脱液后，经由混合模式色谱树脂加工过滤洗脱液以提供包含该蛋白质的第二洗脱液。
本发明还涉及提纯蛋白质的装置和方法，其包括提供含有蛋白质的样品，经由捕获色谱树脂加工样品以提供包含该蛋白质的第一洗脱液，经由深度过滤器加工第一洗脱液以提供包含该蛋白质的过滤洗脱液，和经由膜吸附器或整料加工过滤洗脱液以提供包含该蛋白质的第二洗脱液。
附图简述
图1图解该方法的一个实施方案的示意图。
图2图解该方法的一个实施方案的另一示意图。
图3图解该方法的一个实施方案的另一示意图。
图4图解该方法的一个实施方案的另一示意图。
图5a和5b图解蛋白质提纯法的HCP清除概况图。
图6a和6b图解蛋白质提纯法的浸出蛋白质A清除概况图。
图7a和7b图解蛋白质提纯法的聚集体清除概况图。
图8a和8b图解蛋白质提纯法的DNA清除概况图。
图9a和9b图解蛋白质提纯法的步骤收率。
图10a图解蛋白质提纯法在不同缓冲条件下在深度过滤器上作为XOHC进料载量的函数的HCP水平。
图10a图解在3000L生产规模下通过蛋白质A捕获/pH灭活后的深度过滤除去HCP。
图11a、11b和11c图解通过双柱蛋白质提纯法获得的杂质清除概况图。
图12a和12b图解蛋白质提纯法的HCP清除概况图。
图13a和13b图解提纯法的浸出蛋白质A清除概况图。
图14a和14b图解蛋白质提纯法的聚集体清除概况图。
图15a和15b图解蛋白质提纯法的DNA清除概况图。
图16a和16b图解蛋白质提纯法的步骤收率。
实施方案详述
现在详细参考本发明的实施方案，下面阐述其一个或多个实例。各实例作为本发明的解释而非本发明的限制提供。实际上，本领域技术人员容易看出，可以在不背离本发明的范围或精神的情况下对本发明作出各种修改和变动。例如，作为一个实施方案的一部分例举或描述的特征可用于另一实施方案以产生再一实施方案。
因此，本发明意在涵盖落在所附权利要求及其对等物的范围内的这样的修改和变动。在下列详述中公开了或明显看出本发明的其它目的、特征和方面。本领域普通技术人员要理解的是，本论述仅描述示例性实施方案，并无意限制本发明的更宽方面。
在一个实施方案中，本发明包括两步色谱步骤蛋白质提纯系统和方法。使用本发明的系统和方法的总回收率可接受，并且最终产品质量与更传统的方法相当。通过消除下游加工中的特定步骤，在保持该分子的可接受的完整性和纯度的同时实现较高生产率。例如，使色谱步骤数最小化会降低传统蛋白质提纯法中常用的工艺部件、缓冲液、罐和杂项设备的数量。
在图1-4中提供本发明的两步色谱步骤提纯系统的若干实施方案的示意图。在本发明的一个实施方案中，提供含有蛋白质的样品。在本发明中可以使用任何含有蛋白质的样品。含有蛋白质的样品可包括例如细胞培养物或小鼠腹水液。该蛋白质可以是本领域中已知的任何蛋白质或其片段。在一些实施方案中，该蛋白质是抗体。在一个具体实施方案中，该蛋白质是单克隆抗体或其片段。在一些情况下，该蛋白质可以是人单克隆抗体。在另一些实施方案中，该蛋白质是免疫球蛋白G抗体。在再一些实施方案中，该蛋白质是融合蛋白，如Fc-融合蛋白。
在本发明的一个实施方案中，含有蛋白质的样品可首先使用本领域中已知的任何方法澄清（见图2，步骤1）。澄清步骤力图从样品中除去细胞、细胞碎片和一些宿主细胞杂质。在一个实施方案中，该样品可通过一个或多个离心步骤澄清（见图3-4，步骤1）。样品的离心可以如本领域中已知的那样进行。例如，可以使用大约1×10-8 m/s的标准化载量和大约5,000×g至大约15,000×g的重力进行样品的离心。
在另一实施方案中，该样品可通过微滤或超滤膜澄清。在一些实施方案中，该微滤或超滤膜可以是切向流过滤（TFF）模式。在此实施方案中可以使用本领域中已知的任何TFF澄清法。TFF是指受压力梯度驱动的在交叉流动构造中的膜分离法，其中该膜根据粒子和/或溶质大小和结构分馏液体混合物的组分。在澄清中，所选膜孔径允许一些组分随水穿过孔隙，同时使细胞和细胞碎片留在膜表面上。在一个实施方案中，可以用聚砜膜采用例如0.1 μm或750 kD截留分子量、5-40 psig和大约4°C至大约60°C的温度进行TFF澄清。
在再一实施方案中，该样品可通过一个或多个深度过滤步骤澄清（见图3-4，步骤1）。深度过滤是指使用孔径递减的依序布置的一系列过滤器从溶液中除去粒子的方法。该深度过滤器三维基质产生迷宫一样的样品流经路径。深度过滤器的保留原理机制取决于遍及基质深度的无规吸附和机械截留。在各种实施方案中，该过滤器膜或片可以是织棉（wound cotton）、聚丙烯、嫘萦纤维素、玻璃纤维、烧结金属、瓷、硅藻土或其它已知组分。在某些实施方案中，包含深度过滤器膜的组合物可以化学处理以提供正电性电荷，即阳离子电荷，以使该过滤器能捕获带负电荷的粒子，如DNA、宿主细胞蛋白质或聚集体。
在此实施方案中可以使用本领域技术人员可得的任何深度过滤系统。在一个具体实施方案中，可以用可获自Millipore Corporation的Millistak+® Pod深度过滤器系统，XOHC介质实施深度过滤步骤。在另一实施方案中，可以用可获自3M Purification Inc.的Zeta Plus™深度过滤器实施深度过滤步骤。
在一些实施方案中，深度过滤器介质具有大约0.1微米至大约8微米的标称孔径。在另一些实施方案中，深度过滤器介质可具有大约2微米至大约5微米的孔径。在一个具体实施方案中，深度过滤器介质可具有大约0.01微米至大约1微米的孔径。在再一些实施方案中，深度过滤器介质可具有大于大约1微米的孔径。在又一些实施方案中，深度过滤器介质可具有小于大约1微米的孔径。
在一些实施方案中，深度过滤澄清步骤可包括使用串联布置的两个或更多个深度过滤器。在这种实施方案中，例如，Millistak+® mini DOHC和XOHC过滤器可以串联布置并用于本发明的澄清步骤。
本领域中已知的这些或其它澄清法的任何组合可用作本发明的任选澄清步骤。例如，澄清步骤可包含离心和深度过滤（见图3-4，步骤1）。
在一个具体实施方案中，本系统包括使用澄清步骤和进一步处理步骤（见图2，步骤2）。进一步处理步骤可包括非色谱提纯步骤。
在一个具体实施方案中，进一步处理步骤可包括用洗涤剂处理（见图3-4，步骤2）。所用洗涤剂可以是已知可用在蛋白质提纯法中的任何洗涤剂。在一个实施方案中，洗涤剂可以以低含量施用于该样品，然后将该样品培养足以使包膜的哺乳动物病毒灭活的时间。要施用的洗涤剂含量在一个实施方案中可以为大约0至大约1% (v/v)。在另一实施方案中，要施用的洗涤剂含量可以为大约0.05%至大约0.7% (v/v)。在再一实施方案中，要施用的洗涤剂含量可以为大约0.5% (v/v)。在一个具体实施方案中，洗涤剂可以是聚山梨醇酯 80 (Tween® 80)或Triton® X-100。这一步骤提供包膜病毒的额外清除并提高整个方法的稳健性。这一步骤可以被称作洗涤剂病毒灭活步骤。
在一个实施方案中，在本发明的任选澄清和进一步提纯步骤后，可以对样品施以色谱捕获步骤（见图1-2）。设计捕获步骤以从澄清样品中分离蛋白质。通常，捕获步骤减少样品中的HCP、宿主细胞DNA和内源病毒或病毒样颗粒。此实施方案中所用的色谱机制可以是本领域中已知用作捕获步骤的任何机制。在一个实施方案中，可以对样品施以亲和色谱法、离子交换色谱法或疏水相互作用色谱法作为捕获步骤。
在本发明的一个具体实施方案中，亲和色谱法可用作捕获步骤。亲和色谱法利用分子之间的特异性结合相互作用。特定配体化学固定或“偶联”到固体载体上。在样品经过树脂时，对配体具有特异性结合亲和力的样品中的蛋白质被结合。在洗除其它样品组分后，随后从固定的配体上剥离结合的蛋白质并洗脱，以使其从原始样品中提纯。
在本发明的这一实施方案中，亲和色谱捕获步骤可包括抗原和抗体之间、酶和底物之间、或受体和配体之间的相互作用。在本发明的一个具体实施方案中，亲和色谱捕获步骤可包括蛋白质A色谱法、蛋白质G色谱法、蛋白质A/G色谱法或蛋白质L色谱法。
在某些实施方案中，在本发明的捕获步骤中可以使用蛋白质A亲和色谱法（见图3-4，步骤3）。蛋白质A亲和色谱法涉及使用蛋白质A，其是一种证实与许多种类的免疫球蛋白的非抗原结合部分特异性结合的细菌蛋白。所用蛋白质A树脂可以是本领域技术人员可得的任何蛋白质A树脂。在一个实施方案中，蛋白质A树脂可选自可获自GE Healthcare Life Sciences的MabSelect™系列的树脂。在另一实施方案中，蛋白质A树脂可以是可获自Millipore Corporation的ProSep® Ultra Plus树脂。在此步骤中可以使用本领域中可得的任何柱。在一个具体实施方案中，该柱可以是可获自GE Healthcare Life Sciences的MabSelect™柱或可获自Millipore Corporation的ProSep® Ultra Plus柱。
如果利用蛋白质A亲和力作为色谱步骤，该柱可具有大约5厘米的内径和大约20厘米的柱长。在其它实施方案中，柱长可以为大约5厘米至大约100厘米。在又一实施方案中，柱长可以为大约10厘米至大约50厘米。在再一实施方案中，柱长可以为大约5厘米或更大。在一个实施方案中，柱的内径可以为大约0.5厘米至大约2米。在另一实施方案中，柱的内径可以为大约1厘米至大约10厘米。在又一实施方案中，柱的内径可以为大约0.5厘米或更大。
用于色谱捕获步骤的特定方法（包括使样品流经柱、洗涤和洗脱）取决于所用的特定柱和树脂并通常由制造商供应或是本领域中已知的。本文所用的术语“加工”可描述样品流经或经过色谱柱、树脂、膜、过滤器或其它机构的过程，并应包括连续流经各机构以及在各机构之间暂停或停止的流。
在色谱捕获步骤后，可以对洗脱液施以病毒灭活（见图2-4，步骤4）。在一个实施方案中，这种病毒灭活步骤可包括低pH病毒灭活（见图3-4，步骤4）。在一个方面中，可以在用于低pH病毒灭活的目标范围中的最终洗脱液池中使用在低洗脱pH下的高浓度甘氨酸缓冲液，而不用进一步pH调节。或者，乙酸盐或柠檬酸盐缓冲液可用于洗脱，然后将洗脱液池滴定至用于低pH病毒灭活的适当pH范围。在一个实施方案中，pH为大约2.5至大约4。在另一实施方案中，pH为大约3至大约4。
在一个实施方案中，一旦降低洗脱液池的pH，将该池孵育大约15至大约90分钟的时长。在一个具体实施方案中，可通过用0.5 M磷酸滴定以获得大约3.5的pH来实现低pH病毒灭活步骤，然后将样品孵育1小时。
在低pH病毒灭活步骤后，可以将灭活的洗脱液池中和至较高pH。在一个实施方案中，中和的较高pH可以为大约6至大约10的pH。在另一实施方案中，中和的较高pH可以为大约8至大约10的pH。在再一实施方案中，中和的较高pH可以为大约6至大约10的pH。在再一实施方案中，中和的较高pH可以为大约6至大约8的pH。在再一实施方案中，中和的较高pH可以为大约8.1的pH。
在一个实施方案中，可以使用1 M Tris pH 9.5缓冲液或本领域中已知的另一缓冲液完成pH中和。可随后用纯净水或去离子水调节灭活的洗脱液池的电导率。在一个实施方案中，可以将灭活的洗脱液池的电导率调节至大约0.5至大约50 mS/cm。在另一实施方案中，可以将灭活的洗脱液池的电导率调节至大约6至大约8 mS/cm。
在另一些实施方案中，可以使用本领域中已知的其它方法进行病毒灭活步骤。例如，病毒灭活步骤在各种实施方案中可包括用酸、洗涤剂、化学品、核酸交联剂、紫外线、γ射线、热处理或本领域中已知可用于此用途的任何其它方法。
在任选病毒灭活步骤后，可以对灭活的洗脱液池施以如上所述的深度过滤（见图1-4）。这种深度过滤步骤可补充用作澄清步骤的深度过滤。在一个实施方案中，这一步骤可包括使用串联布置的两个或更多个深度过滤器。根据本领域中已知的加工条件适当设定深度过滤器的尺寸后，可以在进一步加工之前从工艺流中除去或减少各种杂质。
在一个实施方案中，深度过滤步骤后可接着无菌过滤步骤或与无菌过滤步骤结合（见图3-4，步骤5）。本领域中已知的任何无菌过滤器可用在此实施方案中。在一个实施方案中，无菌过滤器是微过滤器。在本发明的一个方面中，无菌过滤器可包含Sartopore® 2除菌级过滤器。除菌过滤器例如可以在0.2微米最终过滤器前具有0.45微米预过滤器。在另一实施方案中，除菌过滤器可具有大约0.1微米至大约0.5微米的膜孔隙。在其它实施方案中，除菌过滤器可具有大约0.1微米至大约0.3微米的膜孔隙。在一个方面中，除菌过滤器可具有大约0.22微米的膜孔隙。在一个实施方案中，除菌过滤器可以与深度过滤器串联布置。
在深度过滤和任选无菌过滤后，可随后对样品施以中间/最终抛光步骤（见图1-2）。在一个实施方案中，中间/最终抛光步骤可包括混合模式（也称作多模式）色谱步骤（见图3，步骤6）。在此步骤中，从样品中清除残留HCP、DNA、浸出蛋白质A和聚集体。本发明中所用的混合模式色谱步骤可采用本领域中已知的任何混合模式色谱法。混合模式色谱法包括使用树脂、整料或膜形式的固相色谱载体，其使用多种化学机制吸附蛋白质或其它溶质。本发明中可用的实例包括，但不限于，利用两种或更多种下列机制的组合的色谱载体：阴离子交换、阳离子交换、疏水相互作用、亲水相互作用、嗜硫相互作用、氢键合、pi-pi键合和金属亲和。在具体实施方案中，混合模式色谱法结合：(1) 阴离子交换和疏水相互作用技术；(2) 阳离子交换和疏水相互作用技术；和/或(3) 静电和疏水相互作用技术。
在一个实施方案中，可以使用柱和树脂，如可获自GE Healthcare Life Sciences的Capto®粘附柱和树脂完成混合模式色谱步骤。Capto®粘附柱是用于捕获后的单克隆抗体的中间提纯和抛光的多模式介质。在一个具体实施方案中，混合模式色谱步骤可以以流通模式进行。在另一些实施方案中，混合模式色谱步骤可以以结合-洗脱模式进行。
在另一些实施方案中，可以使用一个或多个下列系统完成混合模式色谱步骤：Capto® MMC（可获自GE Healthcare Life Sciences）、HEA HyperCel™（可获自Pall Corporation）、PPA HyperCel™（可获自Pall Corporation）、MBI HyperCel™（可获自Pall Corporation）、MEP HyperCel™（可获自Pall Corporation）、Blue Trisacryl M（可获自Pall Corporation）、CFT™ Ceramic Fluoroapatite（可获自Bio-Rad Laboratories, Inc.）、CHT™ Ceramic Hydroxyapatite（可获自Bio-Rad Laboratories, Inc.）、和/或ABx（可获自J. T. Baker）。用于混合模式色谱步骤的特定方法可取决于所用的特定柱和树脂，并通常由制造商供应或是本领域中已知的。
该方法中所用的各柱可大到足以提供最大通过量和最大规模经济。例如，在某些实施方案中，各柱可划定出大约1升至大约1500升，大约1升至大约1000升，大约1升至大约500升，或大约1升至大约250升的内部体积。在一些实施方案中，该混合模式柱可具有大约1厘米的内径和大约7厘米的柱长。在另一些实施方案中，该混合模式柱的内径可以为大约0.1厘米至大约10厘米，大约0.5厘米至大约5厘米，大约0.5厘米至大约1.5厘米，或可以为大约1厘米。在一个实施方案中，该混合模式柱的柱长可以为大约1至大约50厘米，大约1至大约20厘米，大约5至大约10厘米，或可以为大约7厘米。
在一些实施方案中，本发明的系统能够处理高滴定浓度，例如大约5 g/L，大约6 g/L，大约7 g/L，大约8 g/L，大约9 g/L，大约10 g/L，大约12.5 g/L，大约15 g/L，大约20 g/L，大约25 g/L的浓度，大约1 g/L至大约5 g/L的浓度，大约5 g/L至大约10 g/L的浓度，大约5 g/L至大约12.5 g/L的浓度，大约5 g/L至大约15 g/L的浓度，大约5 g/L至大约20 g/L的浓度，或大约5 g/L至大约55 g/L的浓度，或大约5 g/L至大约100 g/L的浓度。例如，一些系统能够处理高抗体浓度，并同时加工大约200 L至大约2000 L培养物/小时，大约400 L培养物至大约2000 L/小时，大约600 L至大约1500 L培养物/小时，大约800 L至大约1200 L培养物/小时，或大于大约1500 L培养物/小时。
在如图3中所示的本发明的一个实施方案中，捕获柱和混合模式柱是仅用的色谱柱。在本实施方案的一个方面中，不使用第三色谱柱；但是，如果进一步加工需要附加的色谱步骤，那些步骤也包括在本文中。
在一个实施方案中，可以通过一个或多个膜吸附器或整料（见图4，步骤6）而非混合模式柱完成中间/最终抛光步骤。膜吸附器是用与等效树脂上的那些类似的官能团衍生化的薄的合成微孔或大孔膜。在它们的表面上，膜吸附器带有能与在重力作用下经过该膜的流体相中接触的至少一种物质相互作用的官能团、配体、交织纤维或反应物。该膜通常在比较小的筒中堆叠5至15层深，以产生比具有类似输出量的柱小得多的足迹。本文所用的膜吸附器可以是膜离子交换器、混合模式、配体膜和/或疏水膜。
在一个实施方案中，所用膜吸附器可以是可获自Millipore Corporation的ChromaSorb™膜吸附器。ChromaSorb™膜吸附器是经设计用于MAb和蛋白质提纯的旨在除去痕量杂质，包括HCP、DNA、内毒素和病毒的膜基阴离子交换器。可用的其它膜吸附器包括Sartobind® Q（可获自Sartorium BBI Systems GmbH）、Sartobind® S（可获自Sartorium BBI Systems GmbH）、Sartobind® C（可获自Sartorium BBI Systems GmbH）、Sartobind® D（可获自Sartorium BBI Systems GmbH）、Pall Mustang™（可获自Pall Corporation）或本领域中已知的任何其它膜吸附器。
如上所述，在本发明的中间/最终抛光步骤中也可以使用整料（见图4，步骤6）。整料是特定受控尺寸的不间断和互连通道的整体式多孔结构。通过对流将样品输送经过整料，以造成流动相和固定相之间的快速质量转移。因此，色谱特性是非流依赖的（non-flow dependent）。整料甚至在高流速下也表现出低背压，从而显著降低提纯时间。在一个实施方案中，该整料可以是离子交换或混合模式配体基整料。在一个方面中，所用整料可包括UNO整料（可获自Bio-Rad Laboratories, Inc.）或ProSwift或IonSwift整料（可获自Dionex Corporation）。
在又一实施方案中，可以通过附加深度过滤步骤而非膜吸附器、整料或混合模式柱完成中间/最终抛光步骤。在这种实施方案中，用于中间/最终抛光的深度过滤可以是CUNO VR深度过滤器。在这种实施方案中，深度过滤器可起到中间/最终抛光以及病毒清除用途。
在中间/最终抛光或混合模式色谱步骤后，可以对洗脱液池施以病毒或纳米过滤步骤（见图2-4，步骤7）。在一个实施方案中，可以通过纳米过滤器或病毒过滤器完成这种过滤步骤。如图2-4，步骤8中所示，在病毒或纳米过滤步骤后可任选接着UF/DF，以在装瓶前实现目标药物浓度和缓冲条件。病毒过滤和UF/DF步骤可以结合或换成本领域中已知提供可供装瓶的纯化蛋白质的任何方法（图2-4，步骤9）。
可以看出，本发明的方法可提供一贯高的产品质量和工艺收率。此外，与传统蛋白质提纯法相比，本发明的方法可以将总下游分批加工时间降低大约40%至50%并显著降低生产成本。
在一个实施方案中，整个提纯过程可以在比通常时间少的时间内完成，例如整个过程可以在少于5天内完成。例如，步骤1和2、或步骤3和4、或步骤5、6和7（如图3-4中的虚线所示）分别可以在一天或更短的时间内完成。这为通常三柱法所需的提纯时间的大约一半。
下列实施例描述本发明的各种实施方案。本领域技术人员考虑如本文中公开的本发明的说明书或实践容易看出在本文的权利要求书的范围内的其它实施方案。说明书以及实施例只应被视为示例，通过实施例后的权利要求书指示本发明的范围和精神。
实施例 1
进行提纯实验并与标准三柱法比较收率和纯度。在此研究中使用用于MAb A的澄清收获物（在本文中称作“CH”）和MAb B的蛋白质A洗脱液（在本文中称作“PAE1”）。进行各蛋白质样品的两次操作（第1例和第2例）。
步骤
将样品离心并使用可获自Millipore Corporation的Millistak+® Pod深度过滤器系统，XOHC介质过滤。在过滤后，将0.5% (v/v)最终浓度的Tween® 80添加到澄清收获物中并用冰袋冷却该混合物。5 cm（内径(i.d.)）x 20 cm（柱长）ProSep® Ultra Plus柱用于捕获。在平衡后，以400 cm/hr向柱中加载MAb A的CH至45 g/L，接着用平衡和中间盐缓冲液洗涤，然后用pH 3.5乙酸盐缓冲液洗脱。该柱在下一操作之前用0.15 M磷酸再生。然后混合洗脱液池并用0.5 M磷酸滴定至pH 3.5，孵育1小时，然后使用1 M Tris, pH 9.5缓冲液中和至pH 8.1。使用Milli-Q®水将该池的电导率调节至6-8 mS/cm。
评估后继步骤的两组条件。在第1例中，pH-灭活的蛋白质A池经23 cm2 Millistak+® mini XOHC过滤器以60 L/m2的载量过滤，接着经可获自Sartorius Stedim Biotech的13 cm2 0.45/0.22 μm Sartopore® 2膜过滤器过滤。在第二例中，两个Millistak+® mini XOHC过滤器串联并以每个装置100 L/m2加载蛋白质A洗脱液池。各滤液随后流经：(1) 1 cm (i.d.) x 7 cm Capto®粘附柱；或(2) 在标准三柱法中，包括0.66 cm (i.d.) x 21.3 cm Q Sepharose® Fast Flow (QSFF)柱（可获自GE Healthcare Life Sciences），接着在0.66 cm (i.d.) x 15.2 cm 苯基Sepharose® HP柱（可获自GE Healthcare Life Sciences）上结合-洗脱提纯。详细的精细提纯条件概括在表1中。所有步骤在室温下进行。
表1. 各抛光色谱步骤的实验条件
Figure 2011800352289100002DEST_PATH_IMAGE002
进行类似实验以提纯用于MAb B的PAE1。在这一情况下使用蛋白质A洗脱液池样品代替从澄清收获物开始。在两个操作中将XOHC深度过滤器加载至60 L/m2并将Capto®粘附柱加载至200至250 g/L。测量各步骤的关键杂质，如HCP、浸出蛋白质A、聚集体/片段和DNA，以及步骤收率。
结果
图5-8显示三柱法（标作蛋白质A-QSFF-苯基）vs 本发明的两柱法（标作蛋白质A-Capto粘附）的各单元操作后的HCP、浸出蛋白质A、聚集体和DNA水平。可以看出，蛋白质A洗脱液池（标作蛋白质A洗脱液）含有大约1700至2000 ng/mg HCP、15至26 ng/mg浸出蛋白质A和2.7%至3.5%高分子量种类（在这种情况下没有检测DNA）。在低pH灭活后，蛋白质A洗脱液在两种不同的载量水平下经XOHC深度过滤器过滤。
在第1例中——其中串联组装两个XOHC过滤器并将各过滤器加载至100 L/m2（因此基于总过滤器面积的平均载量为50 L/m2），除去几乎所有HCP，残留HCP水平为大约1.8至大约2.4 ng/mg（在图中显示为XOHC滤液）。此外，除去大约65%的浸出蛋白质A和大约54%的聚集体。也从产品池中除去宿主细胞DNA至低于检测下限的水平。在第2例中，仅使用一个XOHC过滤器并加载至60 L/m2。这造成略高的杂质水平：大约56 ng/mg HCP、大约7.2至8.6 ng/mg蛋白质A、大约1.8%至2.0%聚集体和大约30至40 pg/mg DNA。尽管杂质水平不同，但这两种XOHC滤液都在经由后继色谱步骤加工——通过标准Q plus苯基柱（标准三柱法）或通过Capto®粘附柱（两柱法）（在图中显示为流通）——时被提纯至产生可接受的最终产物质量。Capto®粘附流通池含有少于4 ng/mg的HCP，其在典型的可接受界限内（＜10 ng/mg）。这一步骤看似提供比Q和phenyl柱都更有效的蛋白质A清除率，且残留蛋白质A水平低于1 ng/mg。此外，来自这两种方法的最终产物聚集体水平相当，小于1%，DNA低于定量限。图8a和8b概括各提纯步骤的产物收率。类似于大多数其它单元操作，两柱法产生90%的步骤收率，类似于Q和苯基操作的结合收率，由此使这两种方法的总加工收率相当。
与两柱法中的正电荷功能一起使用高效深度过滤器，例如Millistak+® Pod XOHC深度过滤器系统增强杂质清除的稳健性而不显著影响产物收率。图10a显示在不同进料加载条件下经过XOHC深度过滤器的蛋白质A洗脱液池的滤液中的HCP水平。较高pH和较低载量水平产生较好的HCP清除率。无需进一步柱提纯，滤液第二道经过另一XOHC过滤器也导致HCP的几乎完全清除。在如图5-8中所示的第1例和第2例中也观察到类似趋势。因此，在混合模式中间/抛光步骤之前的深度过滤器的恰当大小确保整个工艺中产物相关和工艺相关的杂质的稳健清除和优质材料的一致生产。
图10b图解在3000 L生产规模下对后-蛋白质A捕获/pH灭活材料施以XOHC深度过滤器。将原料调节至pH 7.9和5.4 mS/cm电导率并以49 L/M2 深度过滤器面积加载。在过滤过程中提取的样品显示，在经Q膜装置过滤之前残留HCP从原料中的清除大于500倍。
为了评估该两柱法对不同MAb分子的普遍适用性，本发明人还评估在上述加工条件下的MAb B的PAE1。如图11a和11b中所示，总工艺收率和最终产品纯度类似于对MAb A的CH获得的水平，并与在用于这种分子的标准三柱法中观察到的相当。因此，这种方法具有成为单克隆抗体的大规模提纯的平台技术的潜力。
通过使用高效蛋白质A树脂和将深度过滤与混合模式流通式操作集成，本发明的两柱法可提供与标准三柱法相当的收率和产品纯度。在蛋白质A捕获之前使用的单独洗涤剂灭活步骤可为此方法提供额外的病毒清除。此外，该方法导致不需要使用硫酸铵盐，减少硬件量、罐储量、柱填充量、清洗和验证，显著降低分批加工时间和最终改进工艺经济性。
实施例 2
在此实施例中，将MAb A的MabSelect™蛋白质A洗脱液（在本文中标作“PAE2”）pH灭活，用1 M Tris, pH 9.5缓冲液中和至pH 8，然后经CUNO 60/90 ZA和去脂质深度过滤器列过滤，在各自后接着Sartopore 2 0.45/0.22 μm无菌过滤器。滤液随后用5M NaOH调节至pH 9.5并用水稀释至6-7 mS/cm的电导率范围。这种滤液含有大约3%聚集体、15 ng/mg HCP和<1 ng/mg蛋白质A。为了更好评估蛋白质A清除率，样品在加载到5 mL Capto®粘附柱中之前加入另外20 ng/mg MabSelect™蛋白质A。在室温下进行两次操作，特定条件概括在表2中。分析洗脱池的收率、HCP、蛋白质A和聚集体/片段水平。
表2. 在Capto®粘附柱上用于MAb A的PAE2的结合-洗脱操作的实验条件
Figure 2011800352289100002DEST_PATH_IMAGE004
表3概括对PAE2使用Capto®粘附柱在结合-洗脱模式下的本发明的方法的提纯性能。杂质水平与通过标准三柱法获得的那些相当。尽管收率在这种两柱法中略低于标准三柱法，但这种两柱法的性能在可接受的范围内，并可进一步优化，由此提高步骤收率而不损害产品纯度。
表3. Capto®粘附柱用于MAb A的PAE2的结合-洗脱提纯性能的概要
实施例 3
用由蛋白质A捕获、低pH灭活、XOHC深度过滤和用于最终抛光的阴离子交换膜构成的方法进行另一组提纯实验。
在此研究中再使用用于MAb A的CH，在XOHC深度过滤器的不同载量水平下进行两个操作（第1例和第2例）。蛋白质A捕获、pH灭活和XOHC过滤步骤以与实施例1中所示相同的方式运行。但是，从这种方法中移除苯基柱并将QSFF柱换成0.08 ml ChromaSorb®膜装置（Millipore Corporation），其也以流通模式运行。该ChromaSorb装置根据制造商的方法润湿和清洗，用pH 8的含有50 mM NaCl的25 mM Tris缓冲液平衡，然后引入3 kg/L载量和1 ml/min流速的进料。在加载后，该装置用相同流速的平衡缓冲液洗涤。从加载时的200 mAU (UV280)至洗涤时的200 mAU汇集流通部分。在各步骤后测量关键杂质，如HCP、浸出蛋白质A、聚集体/片段和DNA。这种方法也与标准三柱法（如实施例1中详述）比较收率和纯度。
图12-15图解一柱法 vs 三柱法中的各单元操作的杂质概况图。如上论述，在对XOHC深度过滤器施加相对较低的进料载量时（第1例），更有效减少HCP、聚集体、浸出蛋白质A和DNA ，造成极低残留杂质水平。在经由Q膜进一步加工这样的POD滤液时，所有杂质进一步清除至可接受的水平。例如，第1例中的Q膜滤液含有大约0.7 ng/mg HCP、1.5 ng/mg蛋白质A、1.4%聚集体和低于定量限的DNA。尽管聚集体水平略高于在苯基洗脱液中观察到的水平，但其可通过优化Q膜的工艺条件，包括pH、电导率和载量水平来进一步最小化。或者，通过扩大Q膜步骤之前的深度过滤器的尺寸，杂质水平可以由此处观察到的水平降低。如图16中所示，Q膜流通式的步骤收率与Q柱相当；因此，与两柱法相比，苯基柱的消除不仅降低总加工时间，还提高总提纯收率。
本说明书中引用的所有参考资料，包括但不限于所有论文、出版物、专利、专利申请、报告、教科书、报道、手稿、手册、书籍、网帖、期刊文章和/或期刊全文经此引用并入本说明书。本文中的参考资料的论述仅意在概括它们的作者作出的论断而非承认任何参考资料构成现有技术。申请人保留挑战引文的准确性和恰当性的权利。
本领域普通技术人员可以在不背离更特别阐述在所附权利要求中的本发明的精神和范围的情况下对本发明作出这些和其它修改和变动。此外，应该理解的是，各种实施方案的方面可以完全或部分互换。此外，本领域普通技术人员会认识到，上述说明书仅作为实例，且无意限制如所附权利要求中进一步描述的本发明。因此，所附权利要求的精神和范围不应限于其中所含的型式（versions）的描述。

Claims (60)

1.从含有要提纯的蛋白质的样品中提纯蛋白质的装置，其包含：
a. 捕获色谱树脂；
b. 深度过滤器，其相对于捕获色谱树脂布置以使样品经过捕获色谱树脂进入并穿过深度过滤器；和
c. 混合模式色谱树脂，其相对于深度过滤器布置以使样品经过深度过滤器进入并穿过混合模式色谱树脂。
2. 权利要求1的装置，其中所述捕获色谱树脂选自亲和树脂、离子交换树脂和疏水相互作用树脂。
3. 权利要求1的装置，其中所述捕获色谱树脂选自蛋白质A树脂、蛋白质G树脂、蛋白质A/G树脂和蛋白质L树脂。
4. 权利要求1的装置，其中所述捕获色谱树脂和/或混合模式色谱树脂包含在色谱柱内。
5. 权利要求1的装置，其另外包含一个或多个用于澄清蛋白质的澄清装置，所述澄清装置经布置以在样品送入捕获色谱树脂之前接收样品。
6. 权利要求5的装置，其中所述澄清装置选自离心机、微过滤器、超过滤器和深度过滤器中的一项或多项。
7. 权利要求1的装置，其进一步包含第二深度过滤器，所述第二深度过滤器布置成在经由混合模式色谱树脂加工样品之前从第一深度过滤器接收样品。
8. 权利要求1的装置，其进一步包含无菌过滤器，所述无菌过滤器布置成在经由混合模式色谱树脂加工样品之前从深度过滤器接收样品。
9. 权利要求1的装置，其中所述混合模式色谱树脂包含采用选自以下的一种或多种色谱机制的色谱树脂：阴离子交换、阳离子交换、疏水相互作用、亲水相互作用、氢键合、pi-pi键合和金属亲和。
10. 权利要求1的装置，其中所述混合模式色谱树脂包含采用阴离子交换和疏水相互作用色谱机制的组合的色谱树脂。
11. 从含有要提纯的蛋白质的样品中提纯蛋白质的装置，其包含：
a. 捕获色谱树脂；
b. 深度过滤器，其相对于捕获色谱树脂布置以使样品经过捕获色谱树脂进入并穿过深度过滤器；和
c. 膜吸附器，其相对于深度过滤器布置以使样品经过深度过滤器进入并穿过膜吸附器。
12. 权利要求11的装置，其中所述捕获色谱树脂选自蛋白质A树脂、蛋白质G树脂、蛋白质A/G树脂和蛋白质L树脂。
13. 权利要求11的装置，其另外包含一个或多个用于澄清蛋白质的澄清装置，所述澄清装置经布置以在样品送入捕获色谱树脂之前接收样品。
14. 权利要求13的装置，其中所述澄清装置选自离心机、微过滤器、超过滤器和深度过滤器中的一项或多项。
15. 权利要求11的装置，其进一步包含第二深度过滤器，所述第二深度过滤器布置成在经由膜吸附器加工样品之前从第一深度过滤器接收样品。
16. 权利要求11的装置，其进一步包含无菌过滤器，所述无菌过滤器布置成在经由膜吸附器加工样品之前从深度过滤器接收样品。
17. 权利要求11的装置，其中所述膜吸附器选自膜离子交换器、混合模式配体膜和疏水膜。
18. 权利要求11的装置，其进一步包含相对于膜吸附器布置的预装瓶过滤器，以使样品经过膜吸附器进入并穿过所述过滤器。
19. 权利要求18的装置，其中所述预装瓶过滤器选自病毒过滤器、纳米过滤器、超滤器和渗滤器。
20. 从含有要提纯的蛋白质的样品中提纯蛋白质的装置，其包含：
a. 捕获色谱树脂；
b. 深度过滤器，其相对于捕获色谱树脂布置以使样品经过捕获色谱树脂进入并穿过深度过滤器；和
c. 整料，相对于深度过滤器布置以使样品经过深度过滤器进入并穿过整料。
21. 提纯蛋白质的方法，其包括：
a. 提供含有蛋白质的样品；
b. 经由捕获色谱树脂加工样品以提供包含所述蛋白质的第一洗脱液；
c. 在经由捕获色谱树脂加工样品后，经由深度过滤器加工第一洗脱液以提供包含所述蛋白质的过滤洗脱液；和
d. 在经由深度过滤器加工第一洗脱液后，经由混合模式色谱树脂加工过滤洗脱液以提供包含所述蛋白质的第二洗脱液。
22. 权利要求21的方法，其中所述捕获色谱树脂选自亲和树脂、离子交换树脂和疏水相互作用树脂。
23. 权利要求21的方法，其中所述捕获色谱树脂选自蛋白质A树脂、蛋白质G树脂、蛋白质A/G树脂和蛋白质L树脂。
24. 权利要求21的方法，其中所述蛋白质选自蛋白质片段、抗体、单克隆抗体、免疫球蛋白和融合蛋白。
25. 权利要求21的方法，其中所述样品是细胞培养物。
26. 权利要求21的方法，其中在经由捕获色谱树脂加工之前澄清样品。
27. 权利要求26的方法，其中通过选自离心、微滤、超滤、深度过滤、无菌过滤和用洗涤剂处理的澄清方法澄清所述样品。
28. 权利要求21的方法，其中第一洗脱液在经由捕获色谱树脂加工之后但在经由深度过滤器加工之前施以病毒灭活。
29. 权利要求28的方法，其中所述病毒灭活包括选自用酸、洗涤剂、化学品、核酸交联剂、紫外线、γ射线和热处理的方法。
30. 权利要求28的方法，其中病毒灭活包括将第一洗脱液的pH降至大约3至大约4的pH。
31. 权利要求30的方法，其中第一洗脱液在病毒灭活过程中孵育大约30至大约90分钟。
32. 权利要求21的方法，其中所述过滤洗脱液第二次经由深度过滤器加工。
33. 权利要求32的方法，其中所述过滤洗脱液经由相同深度过滤器加工两次。
34. 权利要求32的方法，其中所述过滤洗脱液经由两个单独的深度过滤器加工。
35. 权利要求21的方法，其中所述混合模式色谱树脂包含采用选自以下的一种或多种色谱技术的色谱树脂：阴离子交换、阳离子交换、疏水相互作用、亲水相互作用、氢键合、pi-pi键合和金属亲和。
36. 权利要求21的方法，其中所述混合模式色谱树脂包含采用阴离子交换和疏水相互作用色谱技术的组合的色谱树脂。
37. 权利要求21的方法，其中在经由混合模式色谱树脂加工后，对第二洗脱液施以进一步过滤。
38. 权利要求37的方法，其中所述进一步过滤包括选自病毒过滤、纳米过滤、超滤和渗滤的一种或多种方法。
39. 权利要求21的方法，其中过滤洗脱液以流通模式经由混合模式色谱树脂加工。
40. 权利要求21的方法，其中过滤洗脱液以结合-洗脱模式经由混合模式色谱树脂加工。
41. 提纯蛋白质的方法，其包括：
a. 提供含有该蛋白质的样品；
b. 经由捕获色谱树脂加工样品以提供包含所述蛋白质的第一洗脱液；
c. 在经由捕获色谱树脂加工样品后，经由深度过滤器加工第一洗脱液以提供包含所述蛋白质的过滤洗脱液；和
d. 在经由深度过滤器加工第一洗脱液后，经由膜吸附器加工过滤洗脱液以提供包含所述蛋白质的第二洗脱液。
42. 权利要求41的方法，其中所述捕获色谱树脂选自亲和树脂、离子交换树脂和疏水相互作用树脂。
43. 权利要求41的方法，其中所述捕获色谱树脂选自蛋白质A树脂、蛋白质G树脂、蛋白质A/G树脂和蛋白质L树脂。
44. 权利要求41的方法，其中所述蛋白质选自蛋白质片段、抗体、单克隆抗体、免疫球蛋白和融合蛋白。
45. 权利要求41的方法，其中所述样品是细胞培养物。
46. 权利要求41的方法，其中在经由捕获色谱树脂加工之前澄清样品。
47. 权利要求46的方法，其中通过选自离心、微滤、超滤、深度过滤、无菌过滤和用洗涤剂处理的澄清方法澄清所述样品。
48. 权利要求41的方法，其中第一洗脱液在经由深度过滤器加工之前施以病毒灭活。
49. 权利要求48的方法，其中所述病毒灭活包括选自用酸、洗涤剂、化学品、核酸交联剂、紫外线、γ射线和热处理的方法。
50. 权利要求48的方法，其中病毒灭活包括将第一洗脱液的pH降至大约3至大约4的pH。
51. 权利要求49的方法，其中第一洗脱液在病毒灭活过程中孵育大约30至大约90分钟。
52. 权利要求41的方法，其中所述过滤洗脱液第二次经由深度过滤器加工。
53. 权利要求41的方法，其中所述过滤洗脱液经由相同深度过滤器加工两次。
54. 权利要求41的方法，其中所述过滤洗脱液经由两个单独的深度过滤器加工。
55. 权利要求41的方法，其中所述膜吸附器选自膜离子交换器、混合模式配体膜和疏水膜。
56. 权利要求41的方法，其中所述第二洗脱液第二次经由膜吸附器加工。
57. 权利要求41的方法，其中在经由膜吸附器加工后，对所述第二洗脱液施以进一步过滤。
58. 权利要求57的方法，其中所述进一步过滤包括选自病毒过滤、纳米过滤、超滤和渗滤的方法的一种或多种。
59. 权利要求41的方法，其中：
a. 在经由捕获色谱树脂加工样品后经由深度过滤器加工第一洗脱液；和
b. 在经由深度过滤器加工第一洗脱液后经由膜吸附器加工过滤洗脱液。
60. 提纯蛋白质的方法，其包括：
a. 提供含有该蛋白质的样品；
b. 经由捕获色谱树脂加工样品以提供包含所述蛋白质的第一洗脱液；
c. 在经由捕获色谱树脂加工样品后，经由深度过滤器加工第一洗脱液以提供包含所述蛋白质的过滤洗脱液；和
d. 在经由深度过滤器加工第一洗脱液后，经由整料加工过滤洗脱液以提供包含所述蛋白质的第二洗脱液。
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