CN113926434A - 一种蛋白吸附膜材料及其制备方法和应用 - Google Patents

一种蛋白吸附膜材料及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种蛋白吸附膜材料及其制备方法和应用。所述蛋白吸附膜材料的制备原料包括改性硅藻土膜和蛋白质；其中所述改性硅藻土膜为羧基化硅藻土膜；所述蛋白质为ProteinA和/或ProteinG。本发明的蛋白吸附膜材料将蛋白质连接至改性的硅藻土膜上，使得到的Protein A免疫吸附膜材具有较高的流速、较好的吸附容量和稳定性。

Description

一种蛋白吸附膜材料及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及生物医学材料技术领域，具体涉及一种蛋白吸附膜材料及其制备方法和应用。
背景技术
免疫吸附疗法是利用免疫吸附剂对血液中有毒、有害物质的特异性吸附作用以达到去除血液中的致病物质、净化血液目的的治疗方法，是治疗某些疑难病症、抢救急危病人的有效手段。对免疫吸附治疗疗效起决定性作用的是免疫吸附剂。免疫吸附剂的研究至今已有近30年的历史，其原理与传统的亲合分离原理相近。商业化的免疫吸附柱已有15年以上的历史，所用的基质是传统的分离基质--硅胶和琼脂糖凝胶。免疫吸附治疗要求免疫吸附柱具有良好的血液相容性、较高的吸附性及可靠的安全性。免疫吸附治疗中起决定作用的成分是免疫吸附柱中的免疫吸附剂。
现有的以硅胶和琼脂糖凝胶为基质的免疫吸附剂能够满足医学治疗的需要，但同时也有一定的缺点：1)硅胶的强度较好，但可耐受pH范围较窄；2)琼脂糖凝胶的血液相容性好，但强度较差；3)两种填料的形状都为均匀的珠状微粒。这种形状的填料能使柱子在装填过程中保持均匀，但也使柱压增大，使得在免疫吸附治疗中很难达到高的流速。
另外，膜材料因其良好的通透性、较高的强度及良好的传质性能而深受研究者的青睐。目前，对一些新的膜材料已进行了初步的研究，但较低的吸附容量使其很难投入到实际应用中。
因此，亟待提供一种高选择性、高吸附容量的免疫吸附材料。
发明内容
为了克服现有技术的不足，本发明提供了一种蛋白吸附膜材料，具有高选择性、高吸附容量等特点。
本发明提供了一种蛋白吸附膜材料，所述蛋白吸附膜材料的制备原料包括改性硅藻土膜和蛋白质；其中所述改性硅藻土膜为羧基化硅藻土膜；所述蛋白质为ProteinA和/或ProteinG。
可选的，在一些实施例中，所述羧基化硅藻土膜与所述蛋白质的质量比为100：0.1～0.16。
本发明还提供一种蛋白吸附膜材料的制备方法，包括：
制备氨基化硅藻土膜的步骤；
利用所述氨基化硅藻土膜制备羧基化硅藻土膜的步骤；
利用蛋白质和所述羧基化硅藻土膜制备蛋白吸附膜材料的步骤。
可选的，在一些实施例中，所述制备氨基化硅藻土膜的步骤包括：
将硅藻土膜、无水甲苯，以及3-氨基丙基三乙氧基硅烷或二乙烯三胺混合，加入促进剂，在105～115℃的温度下反应4～6h；反应结束后，冷却，冲洗以除去甲苯，得到氨基化硅藻土膜。
可选的，在一些实施例中，所述硅藻土膜与所述3-氨基丙基三乙氧基硅烷(APTES)的质量体积比(g/mL)为1～2.5：1。
可选的，在一些实施例中，所述促进剂为三乙胺。
可选的，在一些实施例中，所述制备羧基化硅藻土膜的步骤包括：
将所述氨基化硅藻土膜置于乙醇溶液中浸泡，加入戊二酸酐或柠檬酸，混合，于35～39℃恒温条件下反应，过滤，冲洗以除去未反应的戊二酸酐或柠檬酸，得到羧基化硅藻土膜。
可选的，在一些实施例中，所述硅藻土膜与所述戊二酸酐的质量比为1：0.8～1。
可选的，在一些实施例中，所述制备蛋白吸附膜材料的步骤包括：
将1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和所述羧基化的硅藻土膜加入至pH为6.5～7.5的缓冲液中，混合，得到混悬液；向所述混悬液中加入蛋白质，在3～5℃恒温条件下反应2～4h，过滤，冲洗，干燥，得到蛋白吸附膜材料；密封置于3～5℃保存，备用；所述蛋白质为ProteinA和/或ProteinG。
可选的，在一些实施例中，所述羧基化的硅藻土膜、所述1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐与所述蛋白质的质量比为100：0.8～1.5：0.1～0.16。优选地，所述羧基化的硅藻土膜、所述1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐与所述蛋白质的质量比为50：0.5：0.06。
此外，本发明还提供所述蛋白吸附膜材料在免疫吸附剂中的应用。
本发明的有益效果在于：
本发明的蛋白吸附膜材料将ProteinA和/或ProteinG连接至改性的硅藻土膜上，使得到的免疫吸附膜材具有较高的流速、较好的吸附容量和稳定性。本发明的蛋白吸附膜材料是一种新的蛋白吸附膜材料，可以作为IgG吸附的商业化应用。
本发明的蛋白吸附膜材料作为免疫吸附剂使用具有如下的优点：较高的选择性，即非特异吸附要小；良好的血液相容性，即无毒、不溶解、不激活补体和凝血系统、不致敏；稳定性好，便于储存和消毒；成本不高。因而本发明的材料可广泛应用于体外免疫吸附。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明实施例提供的氨基化硅藻土膜的结构示意图；
图2是本发明实施例提供的羧基化硅藻土膜的结构示意图；
图3是本发明实施例提供的蛋白吸附膜材料的结构示意图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明实施例提供一种蛋白吸附膜材料及其制备方法和应用。以下分别进行详细说明。需说明的是，以下实施例的描述顺序不作为对实施例优选顺序的限定。另外，在本发明的描述中，术语“包括”是指“包括但不限于”。本发明的各种实施例可以以一个范围的型式存在；应当理解，以一范围型式的描述仅仅是因为方便及简洁，不应理解为对本发明范围的硬性限制；因此，应当认为所述的范围描述已经具体公开所有可能的子范围以及该范围内的单一数值。例如，应当认为从1到6的范围描述已经具体公开子范围，例如从1到3，从1到4，从1到5，从2到4，从2到6，从3到6等，以及所数范围内的单一数字，例如1、2、3、4、5及6，此不管范围为何皆适用。另外，每当在本文中指出数值范围，是指包括所指范围内的任何引用的数字(分数或整数)。
已知体外免疫吸附治疗是血液净化疗法的重要组成部分，主要是通过免疫吸附柱的特异性吸附作用除去病人血液中的致病因子，实现净化血液、治疗疾病的目的。免疫吸附疗法比其他血液净化方法如血浆过滤、血液透析、血浆置换更具特异性，且副作用小，近些年来已成为治疗某些疑难病症如系统性红斑狼疮、肾炎综合症、血友病、高血脂症等的重要手段。免疫吸附治疗中起决定作用的成分是免疫吸附柱中的免疫吸附剂。
发明人在研究过程中发现，以硅藻土膜为基质合成的Protein A或ProteinG免疫吸附膜材具有较高的流速、较好的吸附容量和稳定性，成本也比现有商品化的Protein A凝胶及硅胶柱低。
本发明实施例提供一种蛋白吸附膜材料，所述蛋白吸附膜材料的制备原料包括改性硅藻土膜和蛋白质。所述蛋白质为ProteinA和/或ProteinG。硅藻土膜具有亲脂特性，可以结合脂溶性物质；ProteinA和ProteinG对具有Fc片段蛋白质具有特异性吸附作用。利用ProteinA或ProteinG改性后的硅藻土膜对于脂溶性的具有Fc片段的蛋白质具有更好的吸附作用。进一步地，所述改性硅藻土膜采用羧基化硅藻土膜。
例如，所述羧基化硅藻土膜与所述蛋白质的质量比可以为100：0.1、100：0.11、100：0.12、100：0.13、100：0.14、100：0.15或100：0.16。
在一实施例中，所述蛋白吸附膜材料的制备原料包括硅藻土膜、3-氨基丙基三乙氧基硅烷(APTES)、戊二酸酐和蛋白质(ProteinA和/或ProteinG)。在另一实施例中，所述3-氨基丙基三乙氧基硅烷(APTES)可以采用二乙烯三胺替换；所述戊二酸酐可以采用柠檬酸替换。
详细地，本发明可以通过硅藻土膜、3-氨基丙基三乙氧基硅烷(APTES)和戊二酸酐等原料对硅藻土膜进行改性，进而制备得到羧基化硅藻土膜；然后将蛋白质连接至羧基化硅藻土膜上，形成最终的蛋白吸附膜材料。例如，所述硅藻土膜与所述3-氨基丙基三乙氧基硅烷(APTES)的质量体积比(g/mL)可以为1：1、1.5：1、2：1或2.5：1。例如，所述硅藻土膜与所述戊二酸酐的质量比可以为1：0.8、1：0.9或1：1。本发明中的硅藻土膜为市售产品；例如所述硅藻土膜为在硅藻土的基础上添加了木质素，呈现膜状或板状。
本发明实施例还提供一种蛋白吸附膜材料的制备方法，包括：
制备氨基化硅藻土膜的步骤，可参阅图1；
利用所述氨基化硅藻土膜制备羧基化硅藻土膜的步骤，可参阅图2；
利用蛋白质和所述羧基化硅藻土膜制备蛋白吸附膜材料的步骤，可参阅图3。进一步地，所述蛋白质为ProteinA和/或ProteinG。
在一实施例中，所述制备羧基化硅藻土膜的步骤包括：
将硅藻土膜、3-氨基丙基三乙氧基硅烷(APTES)及无水甲苯混合，加入促进剂，在105～115℃的温度下反应4～6h；反应结束后，冷却，冲洗以除去甲苯，得到氨基化硅藻土膜；所述氨基化硅藻土膜的合成过程请参考图1；
将所述氨基化硅藻土膜置于乙醇溶液中浸泡，加入戊二酸酐，混合，于35～39℃恒温条件下反应，过滤，冲洗以除去未反应的戊二酸酐，得到羧基化硅藻土膜；所述羧基化硅藻土膜的合成过程请参考图2。
进一步地，所述硅藻土膜与所述3-氨基丙基三乙氧基硅烷(APTES)的质量体积比(g/mL)可以为1～2.5：1。所述促进剂可以采用三乙胺。所述硅藻土膜与所述戊二酸酐的质量比为1：0.8～1。
在一实施例中，所述制备蛋白吸附膜材料的步骤包括：
将1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和所述羧基化的硅藻土膜加入至pH为6.5～7.5的缓冲液中，混合，得到混悬液；
向所述混悬液中加入蛋白质(ProteinA或ProteinG)，在3～5℃恒温条件下反应2～4h，过滤，冲洗，干燥，得到蛋白吸附膜材料。所述蛋白吸附膜材料的合成过程请参考图3，所述蛋白质上的氨基与所述羧基化的硅藻土膜上的羧基反应，进而将蛋白连接至硅藻土膜上，最终得到蛋白吸附膜材料。本发明的蛋白吸附膜材料可以密封置于3～5℃的条件下保存，用以备用。
进一步地，所述羧基化的硅藻土膜、所述1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐与所述蛋白质的质量比为100：0.8～1.5：0.1～0.16。也就是说，所述羧基化的硅藻土膜、所述1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐与所述ProteinA的质量比可以为100：0.8～1.5：0.1～0.16。或者，所述羧基化的硅藻土膜、所述1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐与所述ProteinG的质量比可以为100：0.8～1.5：0.1～0.16。
例如，所述羧基化的硅藻土膜、所述1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐与所述蛋白质的质量比可以为50：0.5：0.06。
本发明的蛋白吸附膜材料能够作为免疫吸附剂应用。所述蛋白吸附膜材料具有高的选择性、良好的血液相容性、稳定性好及成本较低等优点，使其可以有效的在免疫吸附剂中应用，进而促进其在体外免疫吸附治疗中发挥作用。
本发明先后进行过多次试验，现举一部分试验结果作为参考对发明进行进一步详细描述，下面结合具体实施例进行详细说明。
实施例1
本实施例提供一种蛋白吸附膜材料，其制备方法包括如下步骤：
将硅藻土膜、3-氨基丙基三乙氧基硅烷(APTES)及无水甲苯混合，加入促进剂三乙胺，在115℃的温度下反应4h；反应结束后，冷却，冲洗以除去甲苯，得到氨基化硅藻土膜；所述硅藻土膜与所述3-氨基丙基三乙氧基硅烷(APTES)的质量体积比(g/mL)为1：1；
将所述氨基化硅藻土膜置于乙醇溶液中浸泡，加入戊二酸酐，混合，于35℃恒温条件下反应，过滤，冲洗以除去未反应的戊二酸酐，得到羧基化硅藻土膜；所述硅藻土膜与所述戊二酸酐的质量比为1：1；
将1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和所述羧基化的硅藻土膜加入至pH为7.5的缓冲液中，混合，得到混悬液；向所述混悬液中加入ProteinA或ProteinG，在3℃恒温条件下反应4h，过滤，冲洗，干燥，得到蛋白吸附膜材料。制得的蛋白吸附膜材料密封置于3℃保存，备用。
实施例2
本实施例提供一种蛋白吸附膜材料，其制备方法包括如下步骤：
将硅藻土膜、3-氨基丙基三乙氧基硅烷(APTES)及无水甲苯混合，加入促进剂三乙胺，在105℃的温度下反应6h；反应结束后，冷却，冲洗以除去甲苯，得到氨基化硅藻土膜；所述硅藻土膜与所述3-氨基丙基三乙氧基硅烷(APTES)的质量体积比(g/mL)为2.5：1；
将所述氨基化硅藻土膜置于乙醇溶液中浸泡，加入戊二酸酐，混合，于39℃恒温条件下反应，过滤，冲洗以除去未反应的戊二酸酐，得到羧基化硅藻土膜；所述硅藻土膜与所述戊二酸酐的质量比为1：0.8；
将1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和所述羧基化的硅藻土膜加入至pH为6.5的缓冲液中，混合，得到混悬液；向所述混悬液中加入ProteinA或ProteinG，在5℃恒温条件下反应2h，过滤，冲洗，干燥，得到蛋白吸附膜材料。制得的蛋白吸附膜材料密封置于5℃保存，备用。
实施例3
本实施例提供一种蛋白吸附膜材料，其制备方法包括如下步骤：
称取硅藻土膜50g，量取3-氨基丙基三乙氧基硅烷(APTES)50mL加入无水甲苯中摇匀(硅藻土膜(g)：APTES(mL)＝1：1)，滴加1mL的三乙胺作为促进剂。然后在110℃油浴充分反应5h；反应结束后，冷却至室温，滤去溶剂甲苯，并用丙酮多次冲洗。得到氨基化硅藻土膜；
置入乙醇溶液中浸泡1h，而后在溶液中加入40g戊二酸酐(硅藻土膜(g)：戊二酸酐(g)＝1：0.8)，37℃恒温震荡反应3h，反应完毕后滤去未反应掉的戊二酸酐及乙醇溶液，并用0.1mol/L的NaCl溶液多次冲洗除去表面吸附的戊二酸酐，得到羧基化硅藻土膜；
将羧基化的硅藻土膜50g、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)0.5g加入磷酸盐缓冲液中(0.1mol/L，pH＝7.0，PBS)中，然后在此混悬液中加入60mg的ProteinA或ProteinG，4℃恒温震荡反应3h；反应结束后倒去溶液，用PBS缓冲液多次冲洗除去表面吸附的ProteinA或ProteinG，直至冲洗液中检测不到蛋白质为止；表面吸水后密封4℃保存。
试验例1
为试验研究本发明的蛋白吸附膜材料在免疫吸附治疗中的使用效果，具体采用本发明实施例3得到的蛋白吸附膜材料作为免疫吸附柱中的免疫吸附剂，并分别对四个患者的血浆进行免疫吸附(过滤)，记为实验组1～4，并记录过滤前后血浆中检测物质IgG的含量，结果详见表1所示(数据来源于宣武医院数据)。
表1
Figure BDA0003335495490000081
根据表1可知，本发明的蛋白吸附膜材料对IgG具有优异的特异性吸附作用，过滤后的血浆中的IgG含量要明显低于过滤前的含量。可见本发明的蛋白吸附膜材料可应用于体外免疫吸附中，并且可作为IgG吸附的商业化应用。
在上述实施例中，对各个实施例的描述都各有侧重，某个实施例中没有详述的部分，可以参见其他实施例的相关描述。
以上对本发明实施例所提供的一种蛋白吸附膜材料及其制备方法和应用进行了详细介绍，本文中应用了具体个例对本发明的原理及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想；同时，对于本领域的技术人员，依据本发明的思想，在具体实施方式及应用范围上均会有改变之处，综上所述，本说明书内容不应理解为对本发明的限制。

Claims (10)

1.一种蛋白吸附膜材料，其特征在于，所述蛋白吸附膜材料的制备原料包括改性硅藻土膜和蛋白质；其中所述改性硅藻土膜为羧基化硅藻土膜；所述蛋白质为ProteinA和/或ProteinG。
2.根据权利要求1所述的蛋白吸附膜材料，其特征在于，所述羧基化硅藻土膜与所述蛋白质的质量比为100：0.1～0.16。
3.一种蛋白吸附膜材料的制备方法，其特征在于，包括：
制备氨基化硅藻土膜的步骤；
利用所述氨基化硅藻土膜制备羧基化硅藻土膜的步骤；
利用蛋白质和所述羧基化硅藻土膜制备蛋白吸附膜材料的步骤。
4.根据权利要求3所述的蛋白吸附膜材料的制备方法，其特征在于，所述制备氨基化硅藻土膜的步骤包括：
将硅藻土膜、无水甲苯，以及3-氨基丙基三乙氧基硅烷或二乙烯三胺混合，加入促进剂，在105～115℃的温度下反应4～6h；反应结束后，冷却，冲洗以除去甲苯，得到氨基化硅藻土膜。
5.根据权利要求4所述的蛋白吸附膜材料的制备方法，其特征在于，所述硅藻土膜与所述3-氨基丙基三乙氧基硅烷的质量体积比(g/mL)为1～2.5：1；和/或，所述促进剂为三乙胺。
6.根据权利要求4所述的蛋白吸附膜材料的制备方法，其特征在于，所述制备羧基化硅藻土膜的步骤包括：
将所述氨基化硅藻土膜置于乙醇溶液中浸泡，加入戊二酸酐或柠檬酸，混合，于35～39℃恒温条件下反应，过滤，冲洗以除去未反应的戊二酸酐或柠檬酸，得到羧基化硅藻土膜。
7.根据权利要求6所述的蛋白吸附膜材料的制备方法，其特征在于，所述硅藻土膜与所述戊二酸酐的质量比为1：0.8～1。
8.根据权利要求3所述的蛋白吸附膜材料的制备方法，其特征在于，所述制备蛋白吸附膜材料的步骤包括：
将1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和所述羧基化的硅藻土膜加入至pH为6.5～7.5的缓冲液中，混合，得到混悬液；向所述混悬液中加入蛋白质，在3～5℃恒温条件下反应2～4h，过滤，冲洗，干燥，得到蛋白吸附膜材料；密封置于3～5℃保存，备用；所述蛋白质为ProteinA和/或ProteinG。
9.根据权利要求8所述的蛋白吸附膜材料的制备方法，其特征在于，所述羧基化的硅藻土膜、所述1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐与所述蛋白质的质量比为100：0.8～1.5：0.1～0.16；
优选地，所述羧基化的硅藻土膜、所述1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐与所述蛋白质的质量比为50：0.5：0.06。
10.一种如权利要求1或2所述的蛋白吸附膜材料或如权利要求3～9中任一项制备得到的蛋白吸附膜材料在免疫吸附剂中的应用。
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