CN102993298B - 一种制备α1-抗胰蛋白酶的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种制备α1-抗胰蛋白酶的方法,它包括如下步骤:a.沉淀溶解;b.PEG沉淀;c.病毒灭活;d.纯化;e.超滤;f.纯化;g.超滤透析;i.除菌分装,冻干。本发明方法采用改良Kistler和Nitschmann法工艺的废弃组分沉淀FIV来制备α1-抗胰蛋白酶,既解决了长期困扰的K-N工艺或其改良工艺制备α1-抗胰蛋白酶的难题,实现了血浆资源的综合利用,又对血浆蛋白主体分离工艺无干扰影响,PEG4000用量少,操作体积小,不使用离心设备,简化工艺,节省设备投入具备了很好的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及运用改良K-N法组份Ⅳ沉淀制备人α1-抗胰蛋白酶的方法,属血浆蛋白领域。
背景技术
α1-抗胰蛋白酶(Alpha-1antitrypsin AAT)。分子由394个氨基酸组成,分子量为52000的糖蛋白,以天然有活性及变性无活性两种形式存在,由肝脏产生,主要功能为抑制胰蛋白酶和中性白细胞的弹性蛋白酶的活性,还可抑制糜蛋白酶,纤维蛋白溶酶等,为人体内功能最强大的酶抑制剂之一。AAT先天性缺乏如基因突变或后天因素如长期吸烟或细菌感染会造成AAT活性中心失活,都会导致AAT功能性不足进而造成机体蛋白酶与抗蛋白酶系统失衡,肺组织抵抗弹性蛋白酶的能力下降,引起肺泡变形及末端小支气管以及下肺空间扩张等肺组织的慢性损害,会发生泡性肺气肿,慢性阻塞性肺病(COPD),成人呼吸道窘迫症(ARDS),现阶段美国FDA批准的临床适应症为α1-抗胰蛋白酶遗传性缺乏引起的肺气肿,临床上一直就存在着采用AAT制剂进行增补治疗的需求。由于α1-抗胰蛋白酶自身具备抗炎,抗感染以及抗自身免疫反应等多功能特性,故在炎症性肠病(Inflammatory bowel disease IBD),脂膜炎,脉管炎,鼻窦炎,风湿性关节炎,糖尿病1型,糖尿病所引起足病,囊性纤维化(粘滞症),支气管扩张,肌纤维痛,某些皮肤病像牛皮癣等常见慢性疾病具备潜在治疗价值。
国外公司在进行扩大适应症方面的尝试并取得了进展,扩大的适应症为支气管扩张(Bronchiectasis)和囊性纤维化疾病(Cystic fibrosis),糖尿病1型。另有国外公司采用基因重组技术基于酿酒酵母系统表达的重组α-1抗胰蛋白酶rAAT,剂型为胶体,进行了特应性皮肤病的临床试验。rAAT也在进行针对其它皮肤炎症,例如银屑病以及中耳炎的临床前研究。至今国内没有商品供应临床治疗需要。开发AAT能有利于宝贵的血浆资源的综合利用,极大地提升血浆蛋白生产的附加利润。因此开展AAT的研发不仅有很好的经济效益而且会有极佳的社会效益。
国内外文献及专利报道α1-抗胰蛋白酶剂提纯原料常为Cohn法组分Ⅳ-1。科恩等Coan et al:Preparation and Properties of Alpha 1-ProteinaseInhibitor Concentrate from Human Plasma Vox Sang.48:333-342(1985)发表的采用Cohn法组分Ⅳ-1为原料,两步PEG沉淀,第一步为11.5%为去除杂蛋白,第二步28%为富集沉淀α1-抗胰蛋白酶,再经一步DEAE-Sepharose CL-6B层析,巴氏法病毒灭活,该制剂含有12%白蛋白,2.5%IgA,具备生物活性即抑制猪弹性蛋白酶(PPE活性)的AAT仅占总蛋白含量的60%,基于此工艺,美国Bayer公司开发出全世界第一个α1-抗胰蛋白酶产品海因等Hein et al:Production of Alpha 1-Proteinase inhibitor(Human)Eur.RespirJ.9:16s-20s(1990)发表的工艺采用Cohn法组分Ⅳ-1为原料,采用PEG沉淀和阴离子交换层析,最终产品的纯度为60%。朱威等:α1-抗胰蛋白酶制剂的制备及其病毒灭活,中国生物制品杂志,2001,14(2):97-101发表了Cohn法组分Ⅳ抽提液经两次沉淀,第一次去杂,第二次富集α1-抗胰蛋白酶及离子交换批量吸附及凝胶过滤纯化α1-抗胰蛋白酶,工艺中仅采用一次病毒灭活,采用的是巴氏法。有改为两步病毒灭活措施的必要,并且工艺中有PEG4000用量大的缺陷。莱宾等Lebing et al:美国专利No.6,462,180:采用CoanⅣ-1为原料,经PEG沉淀,再经两步离子交换层析。病毒灭活方法采用去污剂(Tween20),纳米过滤,冻干后干热病毒灭活,此发明中病毒灭活工艺较为繁复,可以进一步优化。卜凤荣等:专利申请号:200610103642.X,发明名称:α1-抗胰蛋白酶的制备方法,公开了采用组分Ⅳ-1为原料,提取α1-抗胰蛋白酶,病毒灭活方法为S/D病毒灭活和巴氏消毒法的组合,但制备采用PEG沉淀加一步阴离子交换层析,纯度还达不到高纯的标准。
随着国内血浆蛋白分离技术的发展,Kistler与Nitschmann法及其改良法也广泛地为国内厂家所采用。改良Kistler和Nitschmann法(简称改良K-N法)确实提升了主要血浆蛋白制品白蛋白的收率。但也造成了一些问题,一些重要的血浆蛋白制品如α1-抗胰蛋白酶等制备困难。采用Cohn法离心工艺处理1吨血浆可得17-20kg FIV-1蛋白沉淀,而改良Kistler与Nitschmann法处理1吨血浆可得100kg FIV沉淀(其中50kg蛋白沉淀和50kg助滤剂),由此可见,采用改良Kistler与Nitschmann法的FIV沉淀中的杂蛋白含量远高于Cohn法FIV-1沉淀,故纯化难度也高出许多。
国际上有一些厂家及研究者,如法国伯尔诺夫等Burnouf et al:“Biochemical and Biological Properties of anα1-antitrypsin Concentrate”VoxSang 52:291-297(1987)应用Kistler与Nitschmann法的组份A或组份A+Ⅰ上清经层析柱进行分离纯化α1-抗胰蛋白酶,该方法存在对设备要求较高,需要大规模的层析系统及配套设施,操作时间较长,病毒灭活不充分等缺陷。
发明内容
为了解决上述问题,本发明运用改良Kistler和Nitschmann法工艺的废弃沉淀FIV来纯化制备α1-抗胰蛋白酶,提供了一种制备α1-抗胰蛋白酶的方法。
本发明提供了一种制备α1-抗胰蛋白酶的方法,它包括如下步骤:
a.沉淀溶解:采用低温乙醇法中的改良K-N法组份Ⅳ沉淀(按专利号ZL03135795.4,名称:“一种血浆蛋白分离方法”所述的方法制备)溶解于8-12倍体积的pH8.1-9.0的缓冲液中,常温分散搅拌1小时,30-40℃加热搅拌1小时,常温搅拌4-14小时,整个溶解过程6-16小时,得溶解液;
b.PEG沉淀:将a步骤溶解液冷至5℃,加入PEG3000-6000浓度为6-10%(g/ml),搅拌,用酸调整pH值至5.05-5.35,加入1.0-2.0%助滤剂,搅拌过滤得到PEG上清液,滤液用碱调到pH7.0;
c、病毒灭活:S/D法;S/D病毒灭活完成后用等体积缓冲液进行稀释终止来保存α1-抗胰蛋白酶的生物活性;
d、纯化:采用阴离子交换层析纯化;
e.超滤;
f、纯化:采用阳离子交换层析纯化;
g.超滤透析;
h.15nm纳米过滤;
i.除菌分装,冻干。
其中,所述的步骤a还包括将搅拌后溶解液弃去沉淀,在上清液中加入2-3%助滤剂,边搅拌边进行压滤得滤液,超滤浓缩至约滤液体积的1/6-1/7,浓缩后蛋白浓度控制在5.1-6.0%得超滤浓缩液,再进行b步骤PEG沉淀。
其中,S/D病毒灭活为采用1%Tween80/0.3%TNBP,在24±1℃,6小时,S/D病毒灭活完成后用等体积缓冲液进行稀释终止。
其中,d步骤所述的纯化:平衡层析柱缓冲液采用0.02-0.03M PBS(磷酸氢二钠与磷酸二氢钠)pH6.45-6.65,洗脱缓冲液0.075-0.085M PBS(磷酸氢二钠与磷酸二氢钠),pH6.45-6.65;所述的阴离子交换层析为:DEAE-SepharoseFast Flow层析、DEAE-Sepharose CL-6B,DEAE-Sephacel,Q--Sepharose FastFlow
其中,f步骤所述的纯化:平衡层析柱缓冲液采用0.003M磷酸氢二钠+0.003M枸橼酸钠pH5.36-5.44。所述的阳离子交换树脂为:CM-SepharoseFast Flow层析、CM-Sepharose CL-6B,SP-Sepharose Fast Flow层析。
其中,所述的助滤剂为硅藻土。
其中,所述的PEG为PEG4000。
本发明方法采用改良Kistler和Nitschmann法工艺的废弃组分沉淀FIV来制备α1-抗胰蛋白酶,既解决了长期困扰的K-N工艺制备α1-抗胰蛋白酶的难题,实现了血浆资源的综合利用,又对血浆蛋白主体分离工艺无干扰影响,PEG4000用量少,操作体积小,不使用离心设备,简化工艺,节省设备投入,具备了很好的应用前景。
具体实施方式
仪器及材料:
强力电动搅拌机JB90-D型上海标本仪器厂
低温循环仪:HC2050重庆恒达仪器厂
HC2030重庆恒达仪器厂
超滤器:Millipore 0.5M2,截留值10KD
Millipore Pellicon 0.11M2,截留值10KD
压滤机:Seitzschenk Niro 490板式压滤器德国
滤器:Millipore 293
pH仪:Metler Toledo Delta 320
电导仪Metler Toledo 326
层析柱:XK50Pharmacia Biotech
紫外监测仪:UV-1Pharmacia
记录仪:REC112amershampharmacia Biotech
蠕动泵:Masterflex L/S Cole-Parmer Instrument CompanyImage双光径免疫浊度分析仪美国Beckman Coulter公司Versamax Microplate reader美国Molecular Devices公司
助滤剂:Celite 503吉林临江塞力特公司
滤板:50P美国Pall公司
实施例1本发明抗α1-抗胰蛋白酶的制备方法
a.沉淀溶解:3kg Kistler和Nitschmann法组份Ⅳ沉淀溶解于24L 0.02MPBS pH 8.1的缓冲液,搅拌1小时后,40℃加温搅拌1小时后,再进行常温搅拌14小时。整个溶解过程16小时,弃去沉淀,添加2%Celite到上清液中。压滤后超滤浓缩到4L,蛋白浓度5.1%。
b.PEG沉淀:FIV沉淀溶解液冷至5℃加入PEG4000至6%(g/ml),搅拌1小时后,pH用1N HCl调整到5.05,2%Celite添加量为1.5%,采取压滤方式,进行过滤,滤液pH用0.5N NaOH调整到pH7.05。
c.S/D病毒灭活:采用1%Tween80/6%TNBP,24±1℃,6小时24±1℃,6小时。S/D病毒灭活后用等体积的PBS缓冲液进行稀释终止,在此实施例中用约4L 0.01M PBS pH6.5终止。
d.用酸碱调整pH,2M NaCl调整电导调整pH,电导与平衡后的DEAE-Sepharose FF流出液一致。
e.DEAE-Sepharose FF层析:层析柱直径5cm,柱高15cm,柱体积300ml,用0.02M PBS pH6.45平衡DEAE-Sepharose FF,大概需20柱床体积CV(Column Volume),平衡后上样流速30ml/min,(线流速90cm/h)结束上样后,用0.02M pH6.45,平衡层析柱缓冲液(即上样缓冲液,)洗流穿峰至基线左右。用0.075M pH6.45PBS,洗脱AAT,流速40ml/min(线流速120cm/h),收集洗脱峰,此后换2M NaCl 2CV,流速40ml/min,换0.5M NaOH 2CV,流速40ml/min,换pH 4.0醋酸盐缓冲液2CV,流速40ml/min,检测流出液pH为4.0。
f.超滤浓缩及调制:取步骤e得到的含有AAT的洗脱峰,超滤后将pH及电导调整至尽量与CM-Sepharose FF层析平衡后流出液保持一致。
g.CM-Sepharose FF层析:层析柱直径5cm,柱高30cm,柱体积600ml,平衡层析柱缓冲液采用0.003M磷酸氢二钠+0.003M枸橼酸钠pH5.36。平衡CM--Sepharose FF柱,大约20CV,平衡后上样,上样流速8ml/min(线流速24cm/h),收集含有α1-抗胰蛋白酶流穿峰,流穿峰后峰不予收集,此后换2MNaCl 2CV,流速40ml/min(线流速120cm/h)洗脱,换0.5M NaOH 2CV,流速40ml/min,换pH 4.0醋酸盐缓冲液2CV,流速40ml/min,检测流出液pH为4.0。
h.超滤透析
i.15nm纳米膜过滤
j.除菌分装,冻干
AAT制剂检测:醋纤膜电泳纯度100%,HPLC主峰94.3%,AAT含量15mg/ml,AAT活性:抑制猪弹性蛋白酶(PPE活性)14.18mg/ml,蛋白浓度1.487%,白蛋白与APA载脂蛋白均在检测限下,IgA 0.133mg/ml (占总蛋白的1%以下),渗透压274mOsmol/kg,处于等渗水平。
实施例2本发明抗α1-抗胰蛋白酶的制备方法
a.沉淀溶解:3kg Kistler和Nitschmann法组份Ⅳ沉淀溶解于36L 0.03MPBS pH 9.0的缓冲液,搅拌1小时后,40℃加温1小时后,再进行常温搅拌4小时。整个溶解过程6小时。弃去沉淀,添加3%Celite到上清液中。压滤后超滤浓缩到5L,蛋白浓度6.0%。
b.PEG沉淀:FIV沉淀溶解液冷至5℃加入PEG4000至10%(g/ml),搅拌1小时后,pH用1N HCl调整到5.35,助滤剂添加量为1.5-2%,采取压滤方式,进行过滤,滤液pH用0.5N NaOH调整到pH7.01。
c.S/D病毒灭活:采用1%Tween80/0.3%TNBP,在24±1℃,6小时。S/D病毒灭活后用等体积的PBS缓冲液进行稀释终止,在此实施例中用约5L0.015M PBS pH6.5终止。
d.调整pH,电导与平衡后的DEAE-Sepharose FF流出液一致。
e.DEAE-Sepharose FF层析:层析柱直径5cm,柱高15cm,柱体积300ml,用0.03M PBS pH6.65平衡DEAE-Sepharose FF,大概需20CV,平衡后上样流速30ml/min,(线流速90cm/h)结束上样后,用0.03M pH6.65平衡液洗流穿峰至基线左右,用0.085M pH6.65PBS,洗脱,流速40ml/min(线流速120cm/h),收集峰此后换2M NaCl 2CV,流速40ml/min,换0.5M NaOH 2CV,流速40ml/min,换pH 4.0醋酸盐缓冲液2CV,流速40ml/min,检测流出液pH为4.0。
f.超滤浓缩及调制:超滤浓缩后调至CM-Sepharose FF平衡后的电导水平。将pH及电导调整至尽量与CM-Sepharose FF层析平衡后流出液保持一致。
g.CM-Sepharose FF层析:层析柱直径5cm,柱高30cm,柱体积600ml用平衡层析柱缓冲液采用0.003M磷酸氢二钠+0.003M枸橼酸钠pH5.44。平衡CM--Sepharose FF柱,大约20CV,平衡后上样,上样流速8ml/min(线流速24cm/h),收集流穿峰,流穿峰后峰不予收集,此后换2M NaCl 2CV,流速40ml/min(线流速120cm/h)洗脱,换0.5M NaOH 2CV,流速40ml/min,换pH 4.0醋酸盐缓冲液2CV,流速40ml/min,检测流出液pH为4.0。
h.超滤透析
i.15nm纳米膜过滤
j.除菌分装,冻干
AAT制剂检测:醋纤膜电泳纯度100%,HPLC主峰96.1%,AAT含量23.4mg/ml,AAT活性:抑制猪弹性蛋白酶(PPE活性)20.67mg/ml,蛋白浓度2.387%,白蛋白与APA载脂蛋白均在检测限下,IgA 0.194mg/ml (占总蛋白的1%以下),渗透压261mOsmol/kg,处于等渗水平。
实施例3本发明α1-抗胰蛋白酶的制备方法
a.沉淀溶解:3kg Kistler和Nitschmann法组份Ⅳ沉淀溶解于30L 0.03MPBS pH 8.5的缓冲液,现搅拌分散混悬1小时后,再进行40℃加温1小时后,尔后继续常温16-25℃搅拌4小时。
b.PEG沉淀:FIV沉淀溶解液冷至5℃加入PEG4000至9%(g/ml),搅拌1小时后,pH用1N HCl调整到5.10,助滤剂添加量为2%,采取压滤方式,进行过滤,滤液pH用0.5N NaOH调整到pH7.00。
c.S/D病毒灭活:采用1%Tween80/0.3%TNBP,在24±1℃,6小时。S/D病毒灭活后用等体积的PBS缓冲液进行稀释终止,在此实施例中用约30L0.015M PBS pH6.5终止。
d.调整pH,电导与平衡后的DEAE-Sepharose FF流出液一致。
e.DEAE-Sepharose FF层析:层析柱直径5cm,柱高15cm,柱体积300ml,用0.03M PBS pH6.6平衡DEAE-Sepharose FF,大概需20CV,平衡后上样流速60ml/min,(线流速180cm/h)结束上样后,用0.03M pH6.6平衡液洗流穿峰至基线左右。用0.085M pH6.6PBS洗脱AAT,流速40ml/min(线流速120cm/h),收集峰此后换2M NaCl 2CV,流速40ml/min,换0.5M NaOH 2CV,流速40ml/min,换pH 4.0醋酸盐缓冲液2C V,流速40ml/min,检测流出液pH为4.0。
f.超滤浓缩及调制:超滤浓缩后调至CM-Sepharose FF平衡后的电导水平。将pH及电导调整至尽量与CM-Sepharose FF层析平衡后流出液保持一致。
g.CM-Sepharose FF层析:层析柱直径5cm,柱高30cm,柱体积600ml用平衡层析柱缓冲液采用0.003M磷酸氢二钠+0.003M枸橼酸钠pH5.42。平衡CM--Sepharose FF柱,大约20C V,平衡后上样,上样流速8ml/min(线流速24cm/h),收集流穿峰,流穿峰后峰不予收集,此后换2M NaCl 2CV,流速40ml/min(线流速120cm/h)洗脱,换0.5M NaOH 2CV,流速40ml/min,换pH 4.0醋酸盐缓冲液2CV,流速40ml/min,检测流出液pH为4.0。
h.超滤透析;
i.15nm纳米膜过滤;
j.除菌分装,冻干;
AAT制剂检测:醋纤膜电泳纯度99%,HPLC主峰92.3%,AAT含量15.6mg/ml,AAT活性:抑制猪弹性蛋白酶(PPE活性)15.18mg/ml,蛋白浓度1.58%,白蛋白与APA载脂蛋白均在检测限下,IgA 0.15mg/ml (占总蛋白的1%以下),渗透压273mOsmol/kg,处于等渗水平。
本发明制备的AAT是高纯制剂,且生物活性保存完好,S/D及PEG残留均远在允许限下,且工艺反复实施8次以上,有很好的稳定性。证明本发明对比现有其他工艺具备以下显著优点:
a.采用改良Kistler和Nitschmann法工艺的废弃组分沉淀FIV来制备α1-抗胰蛋白酶,既解决了长期困扰的K-N工艺或其改良工艺制备α1-抗胰蛋白酶的难题,实现了血浆资源的综合利用,又对血浆蛋白主体分离工艺无干扰影响。
b.PEG4000用量少:采用沉淀溶解压滤后进行超滤浓缩的方式处理3kgFⅣ沉淀仅用400g,而其他工艺如Coan工艺处理3kgFⅣ-1则需用8400g,PEG4000试剂价格昂贵,仅PEG400用量成本一项就占到总生产成本的很高比例,故此一项改进的发明就极大降低了生产成本。
c.操作体积小:经超滤浓缩后,体积缩小,不仅所用PEG4000及S/D试剂大为减少,且操作时间也同时降低。
d.不使用离心设备,简化工艺,节省设备投入。
e.在第一步病毒灭活后采用阴离子交换层析,既纯化了AAT,又去除了S/D及PEG4000,做到一举三得,工艺组合流畅合理。
f.病毒灭活技术采用双重机制的灭活方法,有机溶剂/清洗剂(Solvent/Detergent,S/D)法为国际公认的灭活脂包膜病毒的有效方法,而纳米膜过滤除则为去除非脂包膜病毒,特别是指示病毒猪细小病毒PPV的公认有效措施,去除效果可达4个log以上,这两种方法均较为温和安全,对α1-抗胰蛋白酶生物活性影响较小。而其他方法例如加热法存在着较为剧烈及灭活PPV效果不确切等因素。故发明人采用S/D病毒灭活法和纳米膜病毒去除的组合可达到国家病毒灭活技术指南的标准的要求。
g.制剂纯度及比活在所有国内外报道文献处于最好水平之列。
综上所述,本发明制备方法具备了很好的应用前景。
Claims (7)
1.一种制备α1-抗胰蛋白酶的方法,其特征在于:它包括如下步骤:
a.沉淀溶解:采用低温乙醇法中的改良K-N法组份Ⅳ沉淀溶解于8-12倍体积的pH8.1-9.0的缓冲液中,常温分散搅拌1小时,30-40℃加热搅拌1小时,常温搅拌4-14小时,得溶解液;
b.PEG沉淀:将a步骤溶解液冷至5℃,加入PEG3000-6000,PEG浓度为6-10%(g/ml),搅拌1小时,用酸调整pH值至5.05-5.35,加入1.0-2.0%助滤剂,搅拌过滤得到滤液,滤液用碱调到pH7.0;
c.病毒灭活:用S/D法灭活;
d.纯化:采用阴离子交换层析纯化;
e.超滤;
f.纯化:采用阳离子交换层析纯化;
g.超滤透析;
h.15nm纳米过滤;
i.除菌分装,冻干。
2.一种制备α1-抗胰蛋白酶的方法,其特征在于:它包括如下步骤:
a.沉淀溶解:采用低温乙醇法中的改良K-N法组份Ⅳ沉淀溶解于8-12倍体积的pH8.1-9.0的缓冲液中,常温分散搅拌1小时,30-40℃加热搅拌1小时,常温搅拌4-14小时,得溶解液,弃去沉淀,在上清液中加入2-3%助滤剂,边搅拌边进行压滤得滤液,超滤浓缩至约滤液体积的1/6-1/7,浓缩后蛋白浓度控制在5.1-6.0%得超滤浓缩液;
b.PEG沉淀:将a步骤的超滤浓缩液冷至5℃,加入PEG3000-6000,PEG浓度为6-10%(g/ml),搅拌1小时,用酸调整pH值至5.05-5.35,加入1.0-2.0%助滤剂,搅拌过滤得到滤液,滤液用碱调到pH7.0;
c.病毒灭活:用S/D法灭活;
d.纯化:采用阴离子交换层析纯化;
e.超滤;
f.纯化:采用阳离子交换层析纯化;
g.超滤透析;
h.15nm纳米过滤;
i.除菌分装,冻干。
3.根据权利要求1或2所述的制备方法,其特征在于:c步骤所述S/D病毒灭活为采用1%Tween80/0.3%TNBP,在24±1℃,6小时,灭活后用等体积缓冲液进行稀释终止来保存α1-抗胰蛋白酶的生物活性。
4.根据权利要求1或2所述的制备方法,其特征在于:d步骤所述的纯化:阴离子交换层析采用的树脂为DEAE-Sepharose Fast Flow、DEAE-Sepharose CL-6B,DEAE-Sephacel或者Q--Sepharose Fast Flow;平衡层析柱缓冲液,采用0.02-0.03M PBS溶液,pH6.45-6.65,洗脱缓冲液0.075-0.085M PBS溶液,pH6.45-6.65。
5.根据权利要求1或2所述的制备方法,其特征在于:f步骤所述的纯化:阳离子交换采用的树脂为:CM-Sepharose Fast Flow层析、CM-SepharoseCL-6B,SP-Sepharose Fast Flow层析;平衡层析柱缓冲液采用0.003M磷酸氢二钠+0.003M枸橼酸钠,pH5.36-5.44。
6.根据权利要求1或2所述的制备方法,其特征在于:步骤b所述的助滤剂为硅藻土。
7.根据权利要求1或2所述的制备方法,其特征在于:步骤b所述的PEG为PEG4000。
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