CN101134776A - 制备α1－抗胰蛋白酶的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种原料来源丰富、价格低廉，纯度较高、操作简便的α1－AT制备方法。本发明采用了如下步骤：(1)抽提蛋白，(2)杂蛋白的变性处理，(3)分离杂蛋白，(4)病毒灭活，(5)纯化，(6)超滤、配制、去病毒来制备α1－AT。本发明采用血浆分离的废弃物即低温乙醇分离法所获得的组分IV为原料，获得具有治疗价值的α1－AT，从而提供了人血浆的综合利用能力，降低生产成本，提高经济效益；在纯化 α1－AT过程中，采用了还原剂如DTT、弱阴离子交换树脂及苯基琼脂糖凝胶，可获得高纯度的α1－AT；在生产过程中采用了巴斯消毒法进行病毒灭活，同时运用15～20nm膜过滤去除病毒，从而使产品的安全性得到保证。
Description
技术领域
本发明涉及医药技术领域，是一种药用α1-抗胰蛋白酶制剂的制备方法。
背景技术
α1-抗胰蛋白酶(α1-antitrypsin，α1-AT或AAT)是由肝细胞合成的一种血浆蛋白，分子量为55,000道尔吨，属于丝氨酸蛋白酶抑制剂家族。α1-AT是体内最重要的蛋白酶抑制物，它不仅作用于胰蛋白酶，同时也作用于糜蛋白酶、尿激酶、肾素、胶原酶、弹性蛋白酶、纤溶酶和凝血酶等。
正常情况下α1-AT由肝大量的生成并分泌，在血浆中以较高浓度(典型浓度为1.3mg/ml)循环；另外生理有效的并且足够浓度的α1-AT发现于健康人的一些器官，尤其是肺液(上皮层液)中。α1-AT的活性下降，可源于数量上的缺乏，如先天性的α1-AT缺乏症；也可由于功能性的不足，如吸烟和细菌感染时抗蛋白酶的活性中心失活。研究结果表明，对于α1-AT缺乏患者，服用外源型人α1-AT可以抑制弹性蛋白酶，从而改善存活率，降低肺部功能损失率，因此用外源性α1-AT替代或补充这些炎症性肺病是可取的(Crystal et al.，AM.J.Respir.Crit.Care Med.158：49～59(1998)；Mathadeva R and Lomas D.，Thorax53：501～505(1998))。
因为α1-AT在临床应用中的治疗作用，α1-AT产品被广泛进行研究。Glaser等(Biochemistry，5：333～348(1975))揭示了一种从Cohn组分沉淀分离α1-AT的方法，该沉淀用pH8.5的磷酸缓冲液溶解并搅拌来激活α1-AT(在pH5.2的Cohn组分中α1-AT大部分失活)，透析和离心，上清液过两次离子交换柱，首先在pH6.0～7.6和8.6条件层析，接着在pH7.6和8.0条件下进一步层析，产生的α1-AT收率在30％左右。
Coan等(Vax Sang48：333～342(1985)；Amer J Med84(sup6A)：32～36(1988)；Eur Respie J3(sup9)：16s-20s(1990))发明一种工艺，从Cohn组分IV-1中获得45％的α1-AT，其纯度大约在60％。该工艺是用pH6.5～8.5的缓冲液溶解Cohn组分IV-1沉淀，加入PEG，并将pH降低到4.6～5.7，从而沉淀杂蛋白；然后离心，上清经离子交换层析分离。
Arrighi等(欧洲专利EP0717049)提出了一种提取α1-AT工艺。Cohn组分IV-1用pH8.2的缓冲液溶解并搅拌1小时，温度控制在42℃；后用硫酸铵沉淀杂蛋白，离心，上清在pH7.2条件下经疏水层析分离。
Glaser等(Anal.Biochem124：364～371(1982)；欧洲专利EP0067293)发明了从Cohn组分IV-1沉淀中分离α1-AT方法。该方法是用pH8.5的缓冲液溶解Cohn’s低温乙醇工艺的沉淀物组分IV-1，采用二硫苏糖醇处理，并综合硫酸铵沉淀、DEAE-纤维素层析，所提取获得的α1-AT纯度只有70％左右。
Lebing等(美国专利WO02/48176A1)利用沉淀方法去除部分杂蛋白，离心所得到的上清液经离子交换介质层析收集α1-AT，再将收集到的α1-AT溶液用阳离子介质分离，所得的溶液经冻干加热法、去污剂及纳米膜过滤等方法去除脂包膜和非脂包膜病毒。
1987年Bayer公司制备的α1-蛋白酶抑制剂(人源性)首先上市，该产品是一种无菌、稳定、冻干的纯化人血浆α1-蛋白酶抑制剂(α1-AT，Prolastin)制品，也称之为α1-抗胰蛋白酶。制备的方法是利用Cohn低温乙醇分离法的组分IV-1，采用聚乙二醇(PEG)沉淀、离子交换层析等提取，并运用巴氏消毒法进行病毒灭活，生产的制剂中α1-AT特异活性为每mg总蛋白功能性α1-AT≥0.35mg，纯度为45～80％。
Alpha Terapeutic Corporation制备的α1-蛋白酶抑制剂(人源性)是一种无菌、稳定、冻干的纯化人血浆α1-蛋白酶抑制剂(α1-PI)制品，也称之为α1-抗胰蛋白酶。它是由大量混合人血浆制备的，采用了Cohn低温乙醇分离方法、得到组分IV1+4；组分IV1+4用PH6.0、0.1M NaCl溶解，搅拌，离心，收集沉淀；沉淀溶解在PH8.5、含10.0mM Tris和150.0mM NaCl溶液中，搅拌后再将PH调到8.0，加入PEG至15％浓度，搅拌；过滤，收集滤过液；PEG滤过液中加入ZnCl2，使其终浓度为6.0mM，将溶液PH值调整到7.5，然后降温到5℃，搅拌，离心收集沉淀；沉淀用50mM EDTA-Na2溶解，浓缩透析；透析液体经SD处理灭活病毒；SD处理后的α1-PI溶液上离子交换层析柱，用含有PH8.0、20mMNaCl和20mM磷酸盐(NaH2PO4)缓冲液冲洗；后用PH8.0、100mM NaCl和20mM磷酸盐(NaH2PO4)洗脱液进行洗脱，收集含有α1-PI的洗脱液；洗脱液用1％(wt/wt)斑脱土在20℃条件下作用，过滤，滤液经超滤浓缩，使α1-PI活性达到10单位/ml以上，浓缩液经除菌过滤，分装，冻干。
朱威和祝慈芳等(中国生物制品杂志14(2)：97～101(2001))提出了从人血浆分离的组分IV-1中纯化α1-AT的方法。该方法是Cohn组分IV用缓冲液以1∶10比例35～37℃抽提，上清液通过PEG、HCl等作有机溶剂、等电点沉淀处理后，所获得上清继续以有机溶剂沉淀。将离心分离所得沉淀复溶后，调整蛋白浓度及pH，加入由多糖、盐类、氨基酸等组成的保护剂，在液态状态下作60℃10h加热处理进行病毒灭活，然后用离子交换凝胶作搅拌吸附，所获洗脱液经超滤浓缩后作分子筛层析，收集活性部分，再经超滤浓缩，除菌过滤，分装冻干即获得α1-抗胰蛋白酶制剂。
已经描述的制备α1-AT的各种方法中，有些方法只注重利用有机溶剂进行沉淀或者单纯应用离子交换层析来富集α1-AT，致使纯化所得到的α1-AT纯度达不到现有技术的要求。而部分地与离子交换凝胶联合使用其它制备方法，象使用吸附或沉淀方法，例如与聚乙二醇、锌鳌合剂或肝素吸附剂等一起孵育，这些方法用于或进一步纯化α1-AT，只是其中的每一种方法都必须付出或多或少地损失产物收率的代价(原则上产物损失随制备步骤数的增加而增加)；另外，这些方法往往制备时间被延长，从而将降低α1-AT的完整性和活性，并增加生产成本。
发明内容
本发明的目的是提供一种原料来源丰富、价格低廉，纯度较高、操作简便的α1-AT制备方法。本发明所选用的原料为利用低温乙醇分离法(即Cohn′s法)进行血浆蛋白分离过程中所得到的组分IV沉淀，该沉淀是血浆蛋白分离后的废弃物，来源广泛，目前不计入成本。所选用的纯化方法中采用了还原剂、离子交换层析及疏水层析，并运用巴斯德消毒法和纳米膜过滤两步灭活和/或去除病毒的方法，从而确保产品的安全性。
所叙述的本发明制备方法包括以下步骤：
(1)抽提蛋白：低温乙醇分离法所获得的组分IV沉淀溶于pH8.60～8.90的90～110mM Tris+10～20mM NaCl缓冲液中，其比例为1∶3～5的(w/v)，在2～8℃条件下搅拌1～2h后，用滤器压滤，得滤液a；
(2)杂蛋白的变性处理：滤液a中加入还原剂1，4-二硫苏糖醇(DTT)，使其浓度为10～30mM，反应温度控制在2～8℃，pH为8.60～8.90，搅拌2～4h后用滤器压滤，得滤液b；
(3)分离杂蛋白：滤液b过阴离子交换柱(DEAE-Sephrose、DEAE-SephroseFF，层析柱用pH8.40～8.80、20～80m mM的Tris缓冲液平衡)进行纯化，样品的pH控制在8.40～8.80；用pH7.20～7.80、20～80mMTris缓冲液清洗柱子，一般洗3～5个柱体积；选用pH7.20～7.80、NaCl浓度为0.03～0.07M的20～80mMTris缓冲液洗脱，温度控制在室温，分别收集洗脱峰，获得含α1-抗胰蛋白酶的洗脱液A；
(4)病毒灭活：洗脱液A中加入保护剂，保护剂为盐、糖、氨基酸或其混合物，采用巴斯德消毒法(60℃作用10小时)进行病毒灭活；
(5)纯化：病毒灭活后液体中加入固体硫酸铵，使其浓度达到0.8～1.2M，室温下搅拌10～20分钟后过滤，得滤液c；滤液c上疏水层析柱(应用苯基琼脂糖凝胶、辛基琼脂糖凝胶等，柱子先用pH7.30～7.70、含0.8～1.2M硫酸铵的30～70mMTris缓冲液平衡)；用pH7.30～7.70、含0.8～1.2M硫酸铵的30～70mM Tris缓冲液清洗柱子，一般洗3～5个柱体积；选用含0.3～0.6M硫酸铵的30～70mMTris(pH7.30～7.70)缓冲液洗脱，收集洗脱峰，得到含α1-抗胰蛋白酶的洗脱液B；
(6)超滤、配制、去病毒及制备：洗脱液B用10000分子量超滤膜进行超滤透析，透析液为10～30mM磷酸缓冲液(pH6.6～7.4，其中含25～45mM氯化钠、2～5％甘露醇)，后浓缩α1-抗胰蛋白酶溶液，所有操作在2～8℃条件下；用透析液将蛋白含量调整到20～50mg/ml，采用15～20nm膜过滤去除病毒，并除菌过滤后分装。
本发明的优点在于：1、采用血浆分离的废弃物即组分IV为原料，获得具有治疗价值的α1-AT，从而提供了人血浆的综合利用能力，降低生产成本，提供经济效益；2、纯化α1-AT过程中，采用了还原剂如DTT、弱阴离子交换树脂及苯基琼脂糖凝胶，可获得高纯度的α1-AT；3、生产过程中采用了巴氏消毒法进行病毒灭活，同时运用20nm膜过滤去除病毒，从而使产品的安全性得到保证。
附图说明
图1为本发明SDS-PAGE凝胶电泳图。
图中a蛋白标准品；b抽提液；c DTT处理的α1-AT样品；d离子交换层析后的α1-AT样品；e疏水层析后的α1-AT样品。
具体实施方式
现结合实施例，对本发明作详细描述：
实施例1
2000g组分IV沉淀溶于8000ml、pH8.80、100mM Tris+10mM NaCl溶液，2～8℃搅拌1.5小时后，压滤，得滤液7700ml，pH8.90。
实施例2
7700ml滤液中加入176g的1，4-二硫苏糖醇(DTT)，使DTT浓度达到15mM，搅拌3小时，反应温度控制在2～8℃，压滤，得滤液7100ml，pH8.64。
实施例3
DEAE-Sephrose FF柱先用50mMTris缓冲液清洗，洗5个柱体积；7100ml滤液上离子交换层析柱，样品的pH为8.60；上样后用pH7.50的50mMTris缓冲液清洗柱子；然后选用pH7.50、NaCl分别为0.03～0.07M的50mMTris缓冲液洗脱，分别收集洗脱峰；所有过程温度控制在20～25℃条件下进行。收集含α1-AT的洗脱液2700ml。
实施例4
2700ml洗脱液加入甘氨酸、蔗糖和柠檬酸钠，使其浓度分别为3％(w/v)、50％(w/v)和0.5M，室温让其全部溶解后，除菌过滤并采用60℃处理10小时进行病毒灭活；
实施例5
大约3000ml病毒灭活液中加入152g硫酸铵，使其浓度为1M，室温搅拌15分钟后过滤，滤液上疏水层析柱(柱中填料为苯基琼脂糖凝胶，柱子先用含1M硫酸铵的50mMTris缓冲液平衡5个柱体积)。后用pH7.50、含1M浓度硫酸铵的50mM Tris缓冲液清洗。再选用含0.4M硫酸铵浓度的50mMTris(pH7.50)缓冲液洗脱，收集洗脱液3500ml。
实施例6
3500ml洗脱液用分子量10000道尔顿的超滤膜进行超滤透析，去除硫酸铵及Tris，透析液为20mM磷酸缓冲液(pH7.0，其中含45mM NaCl，3％甘露醇)，后将α1-抗胰蛋白酶溶液浓缩，所有操作均在2～8℃条件下进行。室温下用20mM磷酸缓冲液将浓缩液的蛋白含量调整到20mg/ml，再采用20nm膜过滤去除病毒；然后除菌过滤、分装冻干。
本发明采用了如下步骤：(1)抽提蛋白，(2)杂蛋白的变性处理，(3)分离杂蛋白，(4)病毒灭活，(5)纯化，(6)超滤、配制、去病毒来制备α1-AT。本发明采用血浆分离的废弃物即组分IV为原料，获得具有治疗价值的α1-AT，从而提供了人血浆的综合利用能力，降低生产成本，提供经济效益；在纯化α1-AT过程中，采用了还原剂如DTT、弱阴离子交换树脂及苯基琼脂糖凝胶，可获得高纯度的α1-AT；在生产过程中采用了巴氏消毒法进行病毒灭活，同时运用15～20nm膜过滤去除病毒，从而使产品的安全性得到保证。
Claims (6)
1.一种制备α1-抗胰蛋白酶的方法，包括如下步骤：
(1)抽提蛋白：低温乙醇分离法所获得的组分IV沉淀溶于pH8.60～8.90的90～110mM Tris+10～20mM NaCl缓冲液中，其w/v比例为1∶3～5，在2～8℃条件下搅拌1～2h后，用滤器压滤，得滤液a；
(2)杂蛋白的变性处理：滤液a中加入还原剂即1，4-二硫苏糖醇，使其浓度为10～30mM，反应温度控制在2～8℃，pH为8.60～8.90，搅拌2～4h后用滤器压滤，得滤液b；
(3)分离杂蛋白：
A、滤液b过DEAE-Sephrose或DEAE-SephroseFF阴离子交换柱进行纯化，其层析柱用pH8.40～8.80、20～80mM的Tris缓冲液平衡，样品的pH控制在8.40～8.80；
B、用pH7.20～7.80、20～80mMTris缓冲液清洗柱子，一般洗3～5个柱体积；
C、选用pH7.20～7.80、NaCl浓度为0.03～0.07M的20～80mMTris缓冲液洗脱，温度控制在室温，分别收集洗脱峰，可获得含α1-抗胰蛋白酶的洗脱液A；
(4)病毒灭活：洗脱液A中加入保护剂，保护剂为盐类、糖类、氨基酸或其混合物，采用巴斯德消毒法即在60℃作用10小时进行病毒灭活；
(5)纯化：
A、病毒灭活后液体中加入固体硫酸铵，使其浓度达到0.8～1.2M，室温下搅拌10～20分钟后过滤，得滤液c；
B、滤液c上疏水层析柱，使用苯基琼脂糖凝胶、辛基琼脂糖凝胶，柱子先用pH7.30～7.70、含0.8～1.2M硫酸铵的30～70mM Tris缓冲液平衡；
C、用pH7.30～7.70、含0.8～1.2M硫酸铵的30～70mM Tris缓冲液清洗柱子，一般洗3～5个柱体积；
D、选用含0.3～0.6M硫酸铵的30～70mMTris，其pH7.30～7.70的缓冲液洗脱，收集洗脱峰，得到含α1-抗胰蛋白酶的洗脱液B；
(6)超滤、配制、去病毒及制备：
洗脱液B用10000分子量超滤膜进行超滤透析，透析液为pH6.6～7.4、含25～45mM氯化钠、2～5％甘露醇的10～30mM磷酸缓冲液，后浓缩α1-抗胰蛋白酶溶液，所有操作在2～8℃条件下；用透析液将蛋白含量调整到20～50mg/ml，采用15～20nm膜过滤去除病毒，并除菌过滤后分装。
2.根据权利要求1的制备方法，其特征在于所说的还原剂1，4-二硫苏糖醇，优选使用浓度为15mM。
3.根据权利要求1和/或2的制备方法，其特征在于所说的离子交换层析介质为弱阴离子交换树脂，优选采用DEAE-SephroseFast Flow。
4.根据权利要求1的制备方法，其特征在于所说的病毒灭活步骤中，优选在存在柠檬酸钠、糖、氨基酸或其混合物条件下的巴斯德消毒。
5.根据权利要求1的制备方法，其特征在于所说的疏水层析优选在苯基琼脂糖凝胶上进行。
6.根据权利要求1的制备方法，其特征在于所说的步骤(6)的病毒灭活步骤中，用孔径15～20nm的钠米膜进行病毒颗粒的分离。
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