CN100562523C - α1-抗胰蛋白酶的制备方法 - Google Patents
α1-抗胰蛋白酶的制备方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN100562523C CN100562523C CNB200610103642XA CN200610103642A CN100562523C CN 100562523 C CN100562523 C CN 100562523C CN B200610103642X A CNB200610103642X A CN B200610103642XA CN 200610103642 A CN200610103642 A CN 200610103642A CN 100562523 C CN100562523 C CN 100562523C
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- alpha1
- antitrypsin
- solution
- virus
- component
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Landscapes
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
本发明公开了一种从人血浆分离出的组分IV-1中纯化安全有效的α1-抗胰蛋白酶制备方法。本发明采用血浆分离的废弃物，组分IV-1为原料，提取有高度治疗价值的α1-抗胰蛋白酶，大大提高了宝贵的人血浆的综合利用能力，降低成本，提高经济效益。
Description
技术领域
本发明涉及一种α1-抗胰蛋白酶的制备方法，尤其是指用沉淀和层析法从血浆或血浆蛋白分离的组分中纯化α1-抗胰蛋白酶的制备方法。
背景技术
α1-抗胰蛋白酶是一种大约分子量为52000-55000道尔顿(Da)的糖蛋白。此蛋白是由几个寡核甘酸共价连接的单链蛋白，它是一种内源性蛋白酶抑制剂，例如胰蛋白酶、糜蛋白酶、胰弹性蛋白酶、血管紧张肽原酶、皮肤胶原蛋白酶、脲激酶和分叶核淋巴细胞蛋白酶。
近来应用α1-抗胰蛋白酶治疗由于α1-抗胰蛋白酶缺陷引起的遗传性疾病和后天获得性α1-抗胰蛋白酶缺陷性疾病。给予α1-抗胰蛋白酶能有效地抑制肺中淋巴细胞弹性蛋白酶。淋巴细胞弹性蛋白酶能破坏肺的外源蛋白。当α1-抗胰蛋白酶缺失时，不能很好地调节弹性蛋白酶的活性，使弹性蛋白酶就破坏肺组织导致肺组织损伤引起肺气肿，α1-抗胰蛋白酶能成功的用于治疗肺气肿、慢性气管炎和气管炎等。
目前，α1-抗胰蛋白酶用于治疗肺气肿等疾病是供不应求，由于用于治疗的α1-抗胰蛋白酶基本上是来源人血浆，原料来源有限，为了最大地满足临床病人的需求，应最大可能地提高血浆来源的α1-抗胰蛋白酶产率。同时也要严格要求纯度，因微量杂蛋白可引起病人的免疫反应而产生副作用。此外，应该应用现代先进的简化工艺从血浆分离α1-抗胰蛋白酶和去除病毒，最大限度缩短纯化工艺时间，提高效率。目前，中国尚无此类产品，完全依赖于进口，由于价格昂贵，病人得不到治疗，因此必需填补这项空白。
从血浆分离纯化α1-抗胰蛋白酶的方法繁多，举例如下：
海因(Hein)等人发表的文章和专利〔欧洲呼吸杂志，第9卷增刊：16-20页(Eur.Respir.J.9：16s-20s(1990)和美国专利4,697,003〕阐明用孔氏(Cohn)组分IV-1作原料，用聚乙二醇(PEG)沉淀，接着用DEAE琼脂糖交换层析分离纯化。最后产品纯度达约60％和45％产率，此工艺生产的产品纯度不高，产率低。
来宾(Lebing，Wytold)发表的专利〔美国专利WO02/48176 A1(2000.12.14至2002.06.20公布)〕是应用沉淀法除去部分杂蛋白质，收集上清通过阴离子交换介质收集含α1-抗胰蛋白酶溶液再用阳离子交换介质纯化，经冻干加热法、去污剂(Tween20)及纳米膜过滤等方法去除脂包和非脂包病毒。此纯化工艺及灭活/去除病毒步骤繁多，延长了生产时间。
朱威，祝慈芳等：中国生物制品杂志2001，14(2)：97-101，此文叙述了从人血浆分离的组分IV-1纯化α1-抗胰蛋白酶。主要工艺是孔氏组分IV-1(Cohn IV-1)抽提液经沉淀、超滤、离子交换及凝胶过滤，提纯α1-抗胰蛋白酶，用巴氐法灭活病毒。
祝慈芳，朱威：中国生物制品学杂志2004，17(1)：39-41，制备工艺同上，除简单描述工艺外，主要是进行了急性肺损伤的治疗效果的试验观察。
上述文章采用一次病毒灭活，尚不能完全灭活/去除有抗力的病毒，例如细小病毒B19，此外采用两步PEG沉淀工艺，可以进一步简化。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提出一种从人血浆分离的组分IV-1中纯化安全有效的α1-抗胰蛋白酶制备方法。本制备方法能提高产品纯度、产率，同时缩短了工作时间，节约了原材料，降低了生产成本。
本发明所提供的技术方案是：一种α1-抗胰蛋白酶的制备方法，包括以下步骤：
a、采用孔氏低温乙醇法制得血浆组分IV-1，沉淀；
b、用pH值为9.0～9.8的三羟甲基氨基甲烷缓冲液，将组分IV-1充分溶解，然后在34～40℃加热60～90分钟；
c、在上述溶液中加入分子量为3000～6000da的聚乙二醇，使体积百分浓度为8～12％，静置后离心，得到上清液，目的是去除组分IV-1中杂蛋白及病毒；
d、第一次病毒灭活：用有机溶剂和去污剂来灭活脂包膜病毒；
e、用阴离子交换法层析，用含0.02～0.15M的NaCl-磷酸缓冲液，pH值为6～8，洗脱除去杂蛋白，得到α1-抗胰蛋白酶溶液；
f、第二次病毒灭活，采用巴土德消毒法灭活脂包和非脂包病毒；
g、超滤，去除保护剂，浓缩α1-抗胰蛋白酶溶液；
h、浓缩溶液中加入保护剂，调节蛋白浓度为10～50mg/ml；
i、过滤除菌，分装，冷冻干燥。
其中，聚乙二醇溶液中聚乙二醇最佳分子量为4000。
本发明有如下优点：1、采用血浆分离的废弃物，组分IV-1为原料，提取有高度治疗价值的α1-抗胰蛋白酶，大大提高了宝贵的人血浆的综合利用能力，降低成本，提高经济效益；2、纯化α1-抗胰蛋白酶，采用的是PEG沉淀法和离子交换层析法，可获得高纯度的α1-抗胰蛋白酶，简化了工艺，缩短了生产时间，提高了效率；3、采用二步病毒灭活工艺，同时纯化步骤中的PEG沉淀也有去除病毒作用，确保了产品的安全性。
具体实施方式
下面结合实施例来详细说明本发明。
实施例一：
制备α1-抗胰蛋白酶的原料是孔氏(Cohn)6法制得的血浆组分IV-1，沉淀，将组分IV-1沉淀制备成溶解液，具体方法如下：
组分IV-1沉淀溶解于10～25倍体积的pH值为9.0～9.8的三羟甲基氨基甲烷(Tris)缓冲液中(W/V)，置于2～10℃中搅拌溶解，大约60～90分钟，混合溶解后，调pH值或不调节pH值，如果调节pH值，则用0.5M的NaOH溶液缓慢加入，至pH值为9.0～9.5，充分搅拌混合后，置于35～40℃加热60～90分钟，使组分IV-1充分溶解，同时并激活α1-抗胰蛋白酶。
实施例二：
组分IV-1溶液含有多种蛋白质，例如白蛋白、纤维蛋白原、球蛋白、转铁蛋白及变性蛋白等，必须将α1-抗胰蛋白酶与其他杂蛋白分开，可采用下列步骤：
将上述孔氏(Cohn)组分IV-1溶液冷却到2～10℃，然后边搅拌边加入8～12％的PEG4000溶液，搅拌30分钟后，再用0.5M的HCl溶液调节pH值至5.0～6.0，继续搅拌20～40分钟，2～8℃静置数小时或过夜，使之充分沉淀。PEG是非离子沉淀剂，而且作用温和，使α1-抗胰蛋白酶活性不易损失。PEG沉淀可去除杂蛋白和病毒；沉淀经过滤或离心(8000rpm，30分钟)，弃去沉淀，保留含有α1-抗胰蛋白酶的PEG上清液。
实施例三：
将含有α1-抗胰蛋白酶的聚乙二醇的上清液，用0.5～1.0M的NaOH调节pH值至中性，然后加入吐温80/三磷酸丁脂(S/D)，终浓度分别为1％和0.3％在24℃±1℃，孵育8小时，这种处理方法能有效地灭活脂包膜病毒，如HBV、HCV和HIV等。此方法灭活病毒，大大提高了制品的安全性。
实施例四：
含有α1-抗胰蛋白酶的PEG和S/D溶液经阴离子交换介质层析，在层析前要调节上清液离子强度最小和适当的pH值(为6～8之间)，使α1-抗胰蛋白酶结合到阴离子交换介质上。
离子交换层析过程：用含0.02～0.05M的NaCl-磷酸缓冲液(pH值为6-8)，约3～4柱体积，洗脱来平衡柱子，然后上约1～6柱体积经过滤的样品，流速为80～150cm/小时，使α1-抗胰蛋白酶结合到柱子上，经平衡缓冲液冲洗非结合蛋白(2～6柱体积)至基线后，用含0.04～0.06M的NaCl-磷酸缓冲液(pH值为6～8)洗涤结合的杂蛋白，约2～8柱体积，再用含0.06～0.150M的pH 6～8的磷酸缓冲液洗脱，并收集α1-抗胰蛋白酶洗脱液，其它结合在层析介质上的蛋白质用0.5～2.0M的NaCl-磷酸缓冲液洗脱并使交换介质再生。
这个纯化步骤的目的是：从含α1-抗胰蛋白酶的聚乙二醇溶液中去除聚乙二醇和S/D；纯化了α1-抗胰蛋白酶。
实施例五：
上述含α1-抗胰蛋白酶溶液加入10～50％(V/V)蔗糖和0.2～0.8M柠柠酸钠作保护剂，采用巴士德消毒法(在60℃±0.5℃保持10小时)灭活病毒或经除病毒的纳米膜过滤去除病毒。这种加热法是有效地灭活脂包和非脂包病毒方法，但它会使蛋白变性而活性损失太大，因此必须要加入适量保护剂：10～50％(V/V)蔗糖和0.2～0.8M柠柠酸钠。
经病毒灭活/去除的含α1-抗胰蛋白酶溶液，经分子量1-3万道尔顿滤膜的滤器超滤去除糖及柠檬酸钠并使溶液浓缩(总蛋白达到10～50mg/ml)，再加入适当保护剂(糖、氨基酸及蛋白)，除菌过滤，冷冻干燥，即成成品。
Claims (2)
1、一种α1-抗胰蛋白酶的制备方法，包括以下步骤：
a、采用孔氏低温乙醇法制得血浆组分IV-1，沉淀；
b、用pH值为9.0～9.8的三羟甲基氨基甲烷缓冲液，将组分IV-1充分溶解，然后在34～40℃加热60～90分钟；
c、在上述溶解了组分IV-1的溶液中加入分子量为3000～6000道尔顿、8～12％的聚乙二醇溶液，静置后离心，得到上清液；
d、第一次病毒灭活：用有机溶剂三磷酸丁酯和去污剂吐温80来灭活脂包膜病毒；
e、用阴离子交换法层析，用含0.02～0.15M的NaCl-磷酸缓冲液，pH值为6～8，洗脱除去杂蛋白，得到α1-抗胰蛋白酶溶液；
f、第二次病毒灭活，灭活前，α1-抗胰蛋白酶溶液中加入作为保护剂的10～50％(V/V)蔗糖和0.2～0.8M柠檬酸钠，然后采用巴士德消毒法灭活非脂包膜与脂包膜病毒；
g、超滤，去除作为保护剂的蔗糖和柠檬酸钠，浓缩α1-抗胰蛋白酶溶液，调节蛋白浓度为10～50mg/ml；
h、浓缩溶液中加入作为保护剂的糖、氨基酸及蛋白；
i、过滤除菌，分装，冷冻干燥。
2、根据权利要求1所述的α1-抗胰蛋白酶的制备方法，其特征在于：聚乙二醇溶液中聚乙二醇的分子量为4000。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CNB200610103642XA CN100562523C (zh) | 2006-07-26 | 2006-07-26 | α1-抗胰蛋白酶的制备方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CNB200610103642XA CN100562523C (zh) | 2006-07-26 | 2006-07-26 | α1-抗胰蛋白酶的制备方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN1900107A CN1900107A (zh) | 2007-01-24 |
| CN100562523C true CN100562523C (zh) | 2009-11-25 |
Family
ID=37656115
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CNB200610103642XA Active CN100562523C (zh) | 2006-07-26 | 2006-07-26 | α1-抗胰蛋白酶的制备方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN100562523C (zh) |
Families Citing this family (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101274956B (zh) * | 2008-04-11 | 2011-10-05 | 三九集团湛江开发区双林药业有限公司 | 从人血浆组分FIV沉淀中分离纯化α1-抗胰蛋白酶的方法 |
| CN101602804B (zh) * | 2009-05-05 | 2011-09-21 | 成都蓉生药业有限责任公司 | 用改良K-N法组份A+Ⅰ上清制备富含α1-抗胰蛋白酶组份的方法 |
| CN102180966B (zh) * | 2011-01-28 | 2013-04-03 | 哈尔滨派斯菲科生物制药股份有限公司 | 一种规模化生产人α1-抗胰蛋白酶的方法 |
| CN103804484B (zh) * | 2014-01-24 | 2016-03-16 | 南京必优康生物技术有限公司 | 一种网红细胞生长因子及其制备方法和应用 |
-
2006
- 2006-07-26 CN CNB200610103642XA patent/CN100562523C/zh active Active
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN1900107A (zh) | 2007-01-24 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| EP0037078B1 (en) | Process for heat treatment of aqueous solution containing human blood coagulation factor xiii | |
| US5177194A (en) | Process for purifying immune serum globulins | |
| ES2281104T3 (es) | Proceso para separar el inhibidor de alfa-1-proteinasa de una pasta de fraccion cohn iv-1 + iv-4. | |
| JP2008120822A6 (ja) | タンパク質溶液からアポリポタンパク質を除去する方法 | |
| US20080242844A1 (en) | Ultra-high Yield Intravenous Immune Globulin Preparation | |
| AU2006287833B2 (en) | An ultra-high yield intravenous immune globulin preparation | |
| TW200918145A (en) | Method for purifying factor VIII and von willebrand factor | |
| JPH04243899A (ja) | 第ｖｉｉｉ因子の精製およびこの方法で得られた第ｖｉｉｉ因子 | |
| CN100562523C (zh) | α1-抗胰蛋白酶的制备方法 | |
| EP0252392B1 (en) | Viral inactivation and purification of active proteins | |
| CN101274956B (zh) | 从人血浆组分FIV沉淀中分离纯化α1-抗胰蛋白酶的方法 | |
| RU2198668C2 (ru) | Способ получения раствора гамма-глобулина, предназначенного для внутривенного введения, и продукт, получаемый этим способом | |
| CN107849086A (zh) | 源自血浆的乙型肝炎人免疫球蛋白的制备方法 | |
| EP0011739B1 (en) | Process for obtaining blood coagulation factor xiii derived from human placenta | |
| CN101134776A (zh) | 制备α1－抗胰蛋白酶的方法 | |
| CN1867582B (zh) | 制备α-1-抗胰蛋白酶溶液的方法 | |
| CN1562339A (zh) | 脑蛋白水解物制剂的制备方法 | |
| WO1998030230A1 (fr) | Compositions proteinees et procede de production | |
| US4302445A (en) | Method for concentrating and purifying antihemophilic factor or factor VIII | |
| KR100992488B1 (ko) | ＡｐｏＡ-Ｉ의 정제방법 및 정제된ＡｐｏＡ-Ｉ을 이용한재구축 ＨＤＬ의 생산 방법 | |
| CN101747432A (zh) | 一种α1-抗胰蛋白酶药物的制备方法 | |
| JP2003501480A (ja) | 静注用免疫グロブリンの製造方法および製剤 | |
| US20180305401A1 (en) | Processes for purifying proteins from plasma | |
| Lebing | Alpha1‐Proteinase Inhibitor: The Disease, the Protein, and Commercial Production | |
| JPH08225461A (ja) | プラスミノーゲンの精製方法およびプラスミノーゲン製剤 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| CP03 | Change of name, title or address |
Address after: 050200 No. 6, Qingshan Road, Luquan Green Island Torch Development Zone, Shijiazhuang, Hebei Patentee after: Bohui Biopharmaceutical (Hebei) Co.,Ltd. Address before: Shijiazhuang City, Hebei Province, West Bridge 050081 Kok Street No. 660 Patentee before: HEBEI DAAN PHARMACY CO.,LTD. |
|
| CP03 | Change of name, title or address |