CN1900107A - α1-抗胰蛋白酶的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种从人血浆分离出的组分IV-1中纯化安全有效的α1-抗胰蛋白酶制备方法。本发明采用血浆分离的废弃物,组分IV-1为原料,提取有高度治疗价值的α1-抗胰蛋白酶,大大提高了宝贵的人血浆的综合利用能力,降低成本,提高经济效益。
Description
技术领域
本发明涉及一种α1-抗胰蛋白酶的制备方法,尤其是指用沉淀和层析法从血浆或血浆蛋白分离的组分中纯化α1-抗胰蛋白酶的制备方法。
背景技术
α1-抗胰蛋白酶是一种大约分子量为52000-55000道尔顿(Da)的糖蛋白。此蛋白是由几个寡核甘酸共价连接的单链蛋白,它是一种内源性蛋白酶抑制剂,例如胰蛋白酶、糜蛋白酶、胰弹性蛋白酶、血管紧张肽原酶、皮肤胶原蛋白酶、脲激酶和分叶核淋巴细胞蛋白酶。
近来应用α1-抗胰蛋白酶治疗由于α1-抗胰蛋白酶缺陷引起的遗传性疾病和后天获得性α1-抗胰蛋白酶缺陷性疾病。给予α1-抗胰蛋白酶能有效地抑制肺中淋巴细胞弹性蛋白酶。淋巴细胞弹性蛋白酶能破坏肺的外源蛋白。当α1-抗胰蛋白酶缺失时,不能很好地调节弹性蛋白酶的活性,使弹性蛋白酶就破坏肺组织导致肺组织损伤引起肺气肿,α1-抗胰蛋白酶能成功的用于治疗肺气肿、慢性气管炎和气管炎等。
目前,α1-抗胰蛋白酶用于治疗肺气肿等疾病是供不应求,由于用于治疗的α1-抗胰蛋白酶基本上是来源人血浆,原料来源有限,为了最大地满足临床病人的需求,应最大可能地提高血浆来源的α1-抗胰蛋白酶产率。同时也要严格要求纯度,因微量杂蛋白可引起病人的免疫反应而产生副作用。此外,应该应用现代先进的简化工艺从血浆分离α1-抗胰蛋白酶和去除病毒,最大限度缩短纯化工艺时间,提高效率。目前,中国尚无此类产品,完全依赖于进口,由于价格昂贵,病人得不到治疗,因此必需填补这项空白。
从血浆分离纯化α1-抗胰蛋白酶的方法繁多,举例如下:
海因(Hein)等人发表的文章和专利〔欧洲呼吸杂志,第9卷增刊:16-20页(Eur.Respir.J.9:16s-20s(1990)和美国专利4,697,003〕阐明用孔氏(Cohn)组分IV-1作原料,用聚乙二醇(PEG)沉淀,接着用DEAE琼脂糖交换层析分离纯化。最后产品纯度达约60%和45%产率,此工艺生产的产品纯度不高,产率低。
来宾(Lebing,Wytold)发表的专利〔美国专利WO02/48176 A1(2000.12.14至2002.06.20公布)〕是应用沉淀法除去部分杂蛋白质,收集上清通过阴离子交换介质收集含α1-抗胰蛋白酶溶液再用阳离子交换介质纯化,经冻干加热法、去污剂(Tween20)及纳米膜过滤等方法去除脂包和非脂包病毒。此纯化工艺及灭活/去除病毒步骤繁多,延长了生产时间。
朱威,祝慈芳等:中国生物制品杂志2001,14(2):97-101,此文叙述了从人血浆分离的组分IV-1纯化α1-抗胰蛋白酶。主要工艺是孔氏组分IV-1(Cohn IV-1)抽提液经沉淀、超滤、离子交换及凝胶过滤,提纯α1-抗胰蛋白酶,用巴氐法灭活病毒。
祝慈芳,朱威:中国生物制品学杂志2004,17(1):39-41,制备工艺同上,除简单描述工艺外,主要是进行了急性肺损伤的治疗效果的试验观察。
上述文章采用一次病毒灭活,尚不能完全灭活/去除有抗力的病毒,例如细小病毒B19,此外采用两步PEG沉淀工艺,可以进一步简化。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提出一种从人血浆分离的组分IV-1中纯化安全有效的α1-抗胰蛋白酶制备方法。本制备方法能提高产品纯度、产率,同时缩短了工作时间,节约了原材料,降低了生产成本。
本发明所提供的技术方案是:一种α1-抗胰蛋白酶的制备方法,包括以下步骤:
a、采用孔氏低温乙醇法制得血浆组分IV-1,沉淀;
b、用pH值为9.0~9.8的三羟甲基氨基甲烷缓冲液,将组分IV-1充分溶解,然后在34~40℃加热60~90分钟;
c、在上述溶液中加入分子量为3000~6000da的聚乙二醇,使体积百分浓度为8~12%,静置后离心,得到上清液,目的是去除组分IV-1中杂蛋白及病毒;
d、第一次病毒灭活:用有机溶剂和去污剂来灭活脂包膜病毒;
e、用阴离子交换法层析,用含0.02~0.15M的NaCl-磷酸缓冲液,pH值为6~8,洗脱除去杂蛋白,得到α1-抗胰蛋白酶溶液;
f、第二次病毒灭活,采用巴土德消毒法灭活脂包和非脂包病毒;
g、超滤,去除保护剂,浓缩α1-抗胰蛋白酶溶液;
h、浓缩溶液中加入保护剂,调节蛋白浓度为10~50mg/ml;
i、过滤除菌,分装,冷冻干燥。
其中,聚乙二醇溶液中聚乙二醇最佳分子量为4000。
本发明有如下优点:1、采用血浆分离的废弃物,组分IV-1为原料,提取有高度治疗价值的α1-抗胰蛋白酶,大大提高了宝贵的人血浆的综合利用能力,降低成本,提高经济效益;2、纯化α1-抗胰蛋白酶,采用的是PEG沉淀法和离子交换层析法,可获得高纯度的α1-抗胰蛋白酶,简化了工艺,缩短了生产时间,提高了效率;3、采用二步病毒灭活工艺,同时纯化步骤中的PEG沉淀也有去除病毒作用,确保了产品的安全性。
具体实施方式
下面结合实施例来详细说明本发明。
实施例一:
制备α1-抗胰蛋白酶的原料是孔氏(Cohn)6法制得的血浆组分IV-1,沉淀,将组分IV-1沉淀制备成溶解液,具体方法如下:
组分IV-1沉淀溶解于10~25倍体积的pH值为9.0~9.8的三羟甲基氨基甲烷(Tris)缓冲液中(W/V),置于2~10℃中搅拌溶解,大约60~90分钟,混合溶解后,调pH值或不调节pH值,如果调节pH值,则用0.5M的NaOH溶液缓慢加入,至pH值为9.0~9.5,充分搅拌混合后,置于35~40℃加热60~90分钟,使组分IV-1充分溶解,同时并激活α1-抗胰蛋白酶。
实施例二:
组分IV-1溶液含有多种蛋白质,例如白蛋白、纤维蛋白原、球蛋白、转铁蛋白及变性蛋白等,必须将α1-抗胰蛋白酶与其他杂蛋白分开,可采用下列步骤:
将上述孔氏(Cohn)组分IV-1溶液冷却到2~10℃,然后边搅拌边加入8~12%的PEG4000溶液,搅拌30分钟后,再用0.5M的HCl溶液调节pH值至5.0~6.0,继续搅拌20~40分钟,2~8℃静置数小时或过夜,使之充分沉淀。PEG是非离子沉淀剂,而且作用温和,使α1-抗胰蛋白酶活性不易损失。PEG沉淀可去除杂蛋白和病毒;沉淀经过滤或离心(8000rpm,30分钟),弃去沉淀,保留含有α1-抗胰蛋白酶的PEG上清液。
实施例三:
将含有α1-抗胰蛋白酶的聚乙二醇的上清液,用0.5~1.0M的NaOH调节pH值至中性,然后加入吐温80/三磷酸丁脂(S/D),终浓度分别为1%和0.3%在24℃±1℃,孵育8小时,这种处理方法能有效地灭活脂包膜病毒,如HBV、HCV和HIV等。此方法灭活病毒,大大提高了制品的安全性。
实施例四:
含有α1-抗胰蛋白酶的PEG和S/D溶液经阴离子交换介质层析,在层析前要调节上清液离子强度最小和适当的pH值(为6~8之间),使α1-抗胰蛋白酶结合到阴离子交换介质上。
离子交换层析过程:用含0.02~0.05M的NaCl-磷酸缓冲液(pH值为6-8),约3~4柱体积,洗脱来平衡柱子,然后上约1~6柱体积经过滤的样品,流速为80~150cm/小时,使α1-抗胰蛋白酶结合到柱子上,经平衡缓冲液冲洗非结合蛋白(2~6柱体积)至基线后,用含0.04~0.06M的NaCl-磷酸缓冲液(pH值为6~8)洗涤结合的杂蛋白,约2~8柱体积,再用含0.06~0.150M的pH 6~8的磷酸缓冲液洗脱,并收集α1-抗胰蛋白酶洗脱液,其它结合在层析介质上的蛋白质用0.5~2.0M的NaCl-磷酸缓冲液洗脱并使交换介质再生。
这个纯化步骤的目的是:从含α1-抗胰蛋白酶的聚乙二醇溶液中去除聚乙二醇和S/D;纯化了α1-抗胰蛋白酶。
实施例五:
上述含α1-抗胰蛋白酶溶液加入10~50%(V/V)蔗糖和0.2~0.8M柠柠酸钠作保护剂,采用巴士德消毒法(在60℃±0.5℃保持10小时)灭活病毒或经除病毒的纳米膜过滤去除病毒。这种加热法是有效地灭活脂包和非脂包病毒方法,但它会使蛋白变性而活性损失太大,因此必须要加入适量保护剂:10~50%(V/V)蔗糖和0.2~0.8M柠柠酸钠。
经病毒灭活/去除的含α1-抗胰蛋白酶溶液,经分子量1-3万道尔顿滤膜的滤器超滤去除糖及柠檬酸钠并使溶液浓缩(总蛋白达到10~50mg/ml),再加入适当保护剂(糖、氨基酸及蛋白),除菌过滤,冷冻干燥,即成成品。
Claims (2)
1、一种α1-抗胰蛋白酶的制备方法,包括以下步骤:
a、采用孔氏低温乙醇法制得血浆组分IV-1,沉淀;
b、用pH值为9.0~9.8的三羟甲基氨基甲烷缓冲液,将组分IV-1充分溶解,然后在34~40℃加热60~90分钟;
c、在上述溶液中加入分子量为3000~6000道尔顿的聚乙二醇,使体积百分浓度为8~12%,静置后离心,得到上清液;
d、第一次病毒灭活:用有机溶剂和去污剂来灭活脂包膜病毒;
e、用阴离子交换法层析,用含0.02~0.15M的NaCl-磷酸缓冲液,pH值为6~8,洗脱除去杂蛋白,得到α1-抗胰蛋白酶溶液;
f、第二次病毒灭活,采用巴士德消毒法灭活非脂包膜与脂包膜病毒;
g、超滤,去除保护剂,浓缩α1-抗胰蛋白酶溶液;
h、浓缩溶液中加入保护剂,调节蛋白浓度为10~50mg/ml;
i、过滤除菌,分装,冷冻干燥。
2、根据权利要求1所述的α1-抗胰蛋白酶的制备方法,其特征在于:聚乙二醇溶液中聚乙二醇的分子量为4000。
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