CN111454351A - 一种α1-抗胰蛋白酶的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种α1‑抗胰蛋白酶的制备方法，涉及蛋白纯化领域，包括以下步骤：制取蛋白抽提液；PEG沉淀，去除沉淀物，收集清液，调整所述清液的PH至7.2‑7.4；将所述清液进行离子交换层析，其中，在所述离子交换层析过程中控制中间产品的上样量。PEG沉淀的条件为：pH为5.6±0.1，浓度为11.5％‑12.5％；离子交换层析的PH为8.5±0.3。本发明提供的方法，均采用常规设备、试剂和技术，不会引入有风险的添加物和杂质；同时，通过控制纯化效果的参数，蛋白分离度高；通过控制上样的总活性保证了生产工艺的批间稳定性。
Description
技术领域
本发明涉及蛋白纯化领域，尤其涉及一种α1-抗胰蛋白酶的制备方法。
背景技术
α1-AT是α1-抗胰蛋白酶，一种糖蛋白，含糖10％-20％，主要由肝脏合成，广泛分布于正常人血清和体液中。它是血清中最主要的蛋白酶抑制剂，对凝血酶、尿激酶等其他酶也有抑制作用，也是一种急性时相反应蛋白，在炎症性疾病时，α1抗胰蛋白酶可透过毛细血管进入组织液，在炎症局部往往浓度很高，对急性炎症性的发展能起到一定的限制作用。
国外公布的α1-AT的纯化提取的技术只是粗步的公布了大致的制作工艺，先抽提，再PEG，再层析。但其中涉及的具体参数，如缓冲液、PH、电导、PEG浓度等，以及如何控制工艺达到稳定生产，均没有公布。国内已发表的相关专利，工艺过程复杂，可能引入的杂质多，甚至可能引入以前少有人用的毒性杂质，安全性存在隐患。即便同样是采取离子交换的方法，已公布专利所用的层析条件，导致目的蛋白与杂质蛋白分离度低，纯化效率低，从而增加了生产成本。
现有的α1-AT活性的检测方法耗费试剂，成本高，重复性不好控制，且只能检测较高浓度，对于低于检测限的中间产品无法检测，且不能直接读出数值。再加上国外未公布合理的控制纯化工艺稳定性的方法，有可能出现这种情况：生产出来的产品，质量和回收率的批间差异大。
因此，本领域的技术人员致力于开发一种α1-抗胰蛋白酶的制备方法，能够简单、精确的制造出合格的α1-抗胰蛋白酶产品，在降低了生产成本的同时能够保证产品的质量和回收率，并且能够保证生产工艺的批间稳定性。
发明内容
有鉴于现有技术的上述缺陷，本发明所要解决的技术问题是如何简单、精确地制造α1-抗胰蛋白酶，降低成本的同时并保证产品的质量和回收率以及生产工艺的批间稳定性。
为实现上述目的，本发明提供了一种α1-抗胰蛋白酶的制备方法，所述制备方法包括离子交换层析，其中：
所述离子交换层析在PH为8.5±0.3的条件下进行；
以控制离子交换层析蛋白的上样量来确保层析工艺的有效性和批间稳定性，其中，所述控制离子交换层析蛋白的上样量是指在层析填料装填量不变的情况下，每次层析上样样品中目标蛋白的总活性一致；
其中，通过检测所述层析上样样品中含有的α1-抗胰蛋白酶对胰蛋白酶的抑制活性，以保证每次层析上样样品中目标蛋白的总活性一致。
在一些实施例中，可选地，在进行所述离子交换层析之前，用聚乙二醇沉淀的方法对蛋白抽提液进行前处理以获得层析前中间产品；所述聚乙二醇沉淀在PH为5.5～5.7的条件下进行。
在一些实施例中，可选地，检测所述层析前中间产品中α1-抗胰蛋白酶的活性，包括以下步骤：
在所述中间产品的反应体系中加入0.2ml胰蛋白酶来检测所述中间产品中的α1-抗胰蛋白酶的抑制效果，以获得对所述α1-抗胰蛋白酶浓度的检测限；所述胰蛋白酶的蛋白含量通过称重确定，所述胰蛋白酶的浓度为0.06±0.02mg/ml。
在一些实施例中，可选地，在所述检测层析前中间产品α1-抗胰蛋白酶的活性之前，还包括将所述中间产品稀释8倍，以排除聚乙二醇对检测结果的干扰。
在一些实施例中，可选地，所述检测层析前中间产品α1-抗胰蛋白酶的活性还包括：
检测配制好的多个浓度的α1-抗胰蛋白酶国际标准品获得参照体系，其中，
所述参照体系为标准线性曲线，横坐标为所述α1-抗胰蛋白酶国际标准品的多个浓度，纵坐标为所述多个浓度对应的吸光值。
在一些实施例中，可选地，将所述α1-抗胰蛋白酶国际标准品用超纯水溶解后，储存于-80℃保存。
在一些实施例中，可选地，所述离子交换层析的离子交换剂为DEAE或QFF。
本发明提供的α1-抗胰蛋白酶的制备方法，在进行所述离子交换层析之前，对蛋白抽提液进行前处理；所述前处理包括聚乙二醇沉淀。所述聚乙二醇沉淀在PH为5.5～5.7的条件下进行，沉淀过程结束后用压滤或离心的方法将沉淀于上清液分离后，回调上清液的PH值为7.2～7.4保存，并取样作为待测中间产品。
为了对所述中间产品中所包含的α1-抗胰蛋白酶的活性进行检测，本发明还提供了一套检测方法。所使用的活性检测方法，降低了最低检测限，极大程度的扩大了检测范围，并摸索出了标准品的长期储存的方法。使用该方法进行检测，可以降低检测过程中各种试剂的消耗，从而降低了检测成本。因为本方法是利用国际标准品作参照物，可以直接读出产品的活性值。经过系列试验，摸索出对于中间产品合适的稀释倍数，排除了中间产品中PEG对检测结果的干扰，能检测出中间产品活性的真实值。
本发明提供的α1-抗胰蛋白酶的制备方法，通过离子交换层析进行，其中，所述离子交换层析在PH为8.5±0.3的条件下进行；控制所述离子交换层析过程中的中间产品的上样量，其中，通过检测所述中间产品的活性后根据上样的总活性确定所述样品的上样体积。
本发明提供的α1-抗胰蛋白酶的制备方法，具有以下有益的技术效果：
1、制备方法中包括的纯化步骤：PEG沉淀和离子交换层析，均采用常规的设备、试剂和技术，不会引入有风险的添加物和杂质；
2、针对每一步纯化工艺，提出了控制纯化效果的参数，使目的蛋白和杂质蛋白分离度高，同时，在生产出同等量合格产品的情况下，所需要的离子交换剂更少，有效的降低了生产成本，并同时保证产品的质量和回收率；
3、利用中间产品的总活性来控制上样量，以保证生产工艺的批间稳定性，使得各批生产的产品质量和产率具备一致性；
4、使用本发明提供的方法制备的产品，纯度高，比活性高，抗原含量低，多聚体含量低，IgA含量低，产品质量高；
以下将结合附图对本发明的构思、具体结构及产生的技术效果作进一步说明，以充分地了解本发明的目的、特征和效果。
附图说明
图1是5ml规格DEAE.FF柱、上样量为20ml时的离子交换层析分离效果图；
图2是5ml规格DEAE.FF柱、上样量为40ml时的离子交换层析分离效果图；
图3是5ml规格DEAE.FF柱、上样量为80ml时的离子交换层析分离效果图；
图4是5ml规格DEAE.FF柱、上样量为150ml时的离子交换层析分离效果图。
具体实施方式
以下参考说明书附图介绍本发明的一个优选实施例，使其技术内容更加清楚和便于理解。本发明可以通过许多不同形式的实施例来得以体现，本发明的保护范围并非仅限于文中提到的实施例。
本发明提供的α1-AT(α1-抗胰蛋白酶)的制备方法，采用离子交换层析的方法，其中，离子交换层析过程中，通过检测中间产品的活性浓度来控制中间产品的上样量。
本发明的一个较佳实施例的制备过程为：
1，蛋白抽提液经12％PEG(聚乙二醇)沉淀，搅拌半小时，通过压滤获取清液，然后回调清液的PH至7.2-7.4以得到中间产品。经过PEG沉淀处理之后，蛋白抽提液中保留了80％左右的目的蛋白，并去掉了大部分的杂质，使目的蛋白纯度提高了20倍左右，剩下的杂质主要为白蛋白和转铁蛋白等。
2，将中间产品稀释8倍，以消除PEG的干扰，然后用活性检测方法对中间产品活性浓度进行过检测。
3，进行离子交换层析，首先根据离子交换层析所需要上样的的总活性以及检测出的中间产品活性浓度确定离子交换层析上样体积。在进行离子交换层析时，选用的离子交换剂为DEAE填料层析的缓冲液为50mM Tris和0～200mM NaCl，PH为8.5±0.3。
应当理解的是，也可以采用其他方法获得蛋白液，不仅限于本实施例的抽提方式。此外，PEG沉淀也可以采用其他沉淀方法来代替。
研究过程概述：
为了保正层析后所获得的α1-抗胰蛋白酶蛋白液的纯度，我们首先对离子交换层析的PH值进行了一系列的摸索。研究发现:在PH为8.2-8.8之间时，目的蛋白与杂质蛋白之间可以得到较好的分离，纯度和比活性可以提高3倍左右。优选地，将离子交换层析的PH选为8.5，洗脱方式选用步集梯度清洗杂蛋白洗脱α1-AT蛋白。
如表1所示，为选用PH8.5进行离子交换层析的结果，α1-AT的纯度、比活性和回收率均达到了比较好的结果。
表1 PH8.5离子交换层析后的结果(5mlDEAE.FF柱)
确定了合适的PH值后，还需要确定合适的中间产品的上样量，才能保证纯化产品的质量和生产过程的经济效益。上样量太大，目的蛋白和杂质蛋白分离不开，产品纯度和比活性等指标不能达标；上样量太小，洗脱盐浓度太高，容易产生α1-AT多聚体，同样影响产品质量，且上样量太小使得分离同等的产品需要大量的DEAE.FF或QFF填料导致成本上升，经济效益低。要控制目的蛋白的上样量，需要找到合适的方法。经过比较控制中间产品的总抗原含量和总活性的效果，抗原含量的洗脱电导区域比较广，但是蛋白活性在一个较集中的洗脱电导区域内回收率接近90％，说明抗原含量并不是影响蛋白与填料吸附的关键指标，而中间产品的总活性与蛋白的吸附条件高度相关，因此，本发明最终决定根据中间产品的总活性来确定上样量，保证每批上样的中间产品蛋白液的抗胰蛋白总活性与DEAE.FF填料的比值一致，为6.0～7.2mg a1-AT/mg DEAE.FF。
在用5ml规格DEAE.FF柱进行上样量试验时，图1是上样量为20ml时的层析效果图，图2是上样量为40ml时的层析效果图，图3是上样量为80ml时的层析效果图，图4是150ml时的层析效果图。从图中可以看出，上样量越大，目的蛋白与杂质蛋白的分离越不清楚，所以选择合适的上样量尤为重要。检测样品中的目的蛋白活性的浓度，根据所选择的合适的上样体积，换算出合适的上样目的蛋白总活性。
表2是在确定层析工艺后，将纯化工艺进一步放大到规格为0.8L的DEAE.FF柱，纯化以及超滤浓缩后出来的产品的各项关键指标检测结果。表2说明，在pH8.5时，控制合适的上样量之后，经过放大纯化规模，产品的质量依然可以达标，且大大提高了纯化效率，降低了生产的成本。
表2控制上样量并放大纯化规模后的终产品关键指标检测结果
| 关键指标 | 结果 |
| 活性(mg) | 7 |
| 蛋白含量(mg) | 11.5 |
| 比活性(mg/mg) | 0.61 |
| 活性/抗原含量(mg/mg) | 0.77 |
要控制上样的总活性，需要对离子交换层析过程中的中间产品的活性进行检测。而中间产品的活性比较低，且由于经过了PEG沉淀，中间产品里含有10％-12％的PEG。因此，对中间产品的活性的检测，其检测范围比较大，而且最低检测限度也比较低，还要排出PEG的干扰。为保证中间产品活性检测的准确性，本发明还提供了一种酶活性检测方法，通过α1-抗胰蛋白酶酶活性检测法对中间产品的活性进行检测。检测方法的详细描述如下：
1、储存条件
将α1-AT国际标准品用1ml超纯水溶解，分装至2ml规格离心管(EP管)中，于-80℃储存。
将胰蛋白酶用超纯水溶解至2mg/ml.分装至2ml规格EP管中，于-80℃储存。
2、实验前准备：
取出一支分装的α1-AT国际标准品，融化后用Tris缓冲液(pH7.4，50mM Tris)稀释至0.2mg/ml。
取出一支分装的胰蛋白酶，融化后用Tris缓冲液(pH7.4，50mM Tris)稀释至0.06mg/ml。
称取40mg底物BAPNA，用0.8ml DMSO溶解，再加入5ml酒精溶解，再加入4.2ml Tris缓冲液(pH7.4，50mM Tris)溶解，浓度为4mg/ml。
3、标准曲线样品配制表：
4、待检测样品稀释：
将PEG后的样品回调清液的PH至7.2-7.4用Tris缓冲液(pH7.4，50mM Tris)稀释8倍。
5、检测
1)将制作好的标准曲线各样品及稀释好的待检测样品各200μl中加入100μl Tris缓冲液(pH7.4，50mM Tris)，混匀。
2)各样品反应体系中加入200μl0.06±0.02mg/ml的胰蛋白酶溶液，混匀，于37℃水浴锅中水浴10分钟，后取出。
3)各样品反应体系中加入200μl 4mg/ml底物BAPNA，混匀，于37℃水浴锅中水浴13分钟，后取出。
4)各样品反应体系中加入200μl 50％冰醋酸，终止反应，混匀。
5)从各样品反应体系中取出200μl转移至96孔板，于酶标仪410nm处读取吸光值。
6、数据处理
以标准样品浓度为横坐标，吸光值为纵坐标，作标准线性曲线。若稀释后的待测样品的检测值落到标准曲线的线性范围区间，根据吸光值计算出稀释后的样品的浓度。再结合稀释倍数，可获得样品浓度。根据层析柱的上样载量，计算出上样体积。
本发明的检测方法，对清液进行进一步稀释为8倍，以消除PEG的影响。通过本发明提出的检测方法，可以检测低浓度的α1-AT的中间产品的活性，且有效排除了PEG对检测结果的干扰，保证了工艺的一致性。同时，该检测方法利用国际标准品作为参照物，可以直接读出中间产品的活性值，使检测过程变得方便。此外，该检测方法还能用于对成品的活性的检测。
以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术无需创造性劳动就可以根据本发明的构思作出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。
Claims (7)
1.α1-抗胰蛋白酶的制备方法，其特征在于：所述制备方法包括离子交换层析，其中：
所述离子交换层析在PH为8.5±0.3的条件下进行；
以控制离子交换层析蛋白的上样量来确保层析工艺的有效性和批间稳定性，其中，所述控制离子交换层析蛋白的上样量是指在层析填料装填量不变的情况下，每次层析上样样品中目标蛋白的总活性一致；
其中，通过检测所述层析上样样品中含有的α1-抗胰蛋白酶对胰蛋白酶的抑制活性，以保证每次层析上样样品中目标蛋白的总活性一致。
2.如权利要求1所述的α1-抗胰蛋白酶的制备方法，其特征在于：
在进行所述离子交换层析之前，用聚乙二醇沉淀的方法对蛋白抽提液进行前处理以获得层析前中间产品；所述聚乙二醇沉淀在PH为5.5～5.7的条件下进行。
3.如权利要求2所述的α1-抗胰蛋白酶的制备方法，其特征在于，检测所述层析前中间产品中α1-抗胰蛋白酶的活性，包括以下步骤：
在所述中间产品的反应体系中加入0.2ml胰蛋白酶来检测所述中间产品中的α1-抗胰蛋白酶的抑制效果，以获得对所述α1-抗胰蛋白酶浓度的检测限；所述胰蛋白酶的蛋白含量通过称重确定，所述胰蛋白酶的浓度为0.06±0.02mg/ml。
4.如权利要求3所述的α1-抗胰蛋白酶的制备方法，其特征在于，在所述检测层析前中间产品α1-抗胰蛋白酶的活性之前，还包括将所述中间产品稀释8倍，以排除聚乙二醇对检测结果的干扰。
5.如权利要求3所述的α1-抗胰蛋白酶的制备方法，其特征在于，所述检测层析前中间产品α1-抗胰蛋白酶的活性还包括：
检测多个浓度的α1-抗胰蛋白酶国际标准品获得参照体系，其中，
所述参照体系为标准线性曲线，横坐标为所述α1-抗胰蛋白酶国际标准品的多个浓度，纵坐标为所述多个浓度对应的吸光值。
6.如权利要求5所述的α1-抗胰蛋白酶的制备方法，其特征在于，将所述α1-抗胰蛋白酶国际标准品用超纯水溶解后，储存于-80℃保存。
7.如权利要求1所述的α1-抗胰蛋白酶的制备方法，其特征在于，所述离子交换层析的离子交换剂为DEAE或QFF。
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-
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Patent Citations (5)
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| 焦云鹏编: "《酶制剂生产与应用》", 31 August 2015, 中国轻工业出版社 * |
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