CN114957447B - 一种超滤稀释液及提高人凝血因子ⅷ质量的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种超滤稀释液及提高人凝血因子Ⅷ质量的制备方法。该超滤稀释液含有：氯化钠17‑70mmol/L，枸橼酸钠15mmol/L，甘氨酸120mmol/L，氯化钙1mmol/L，甘露醇137mmol/L，聚山梨酯80 40‑80μg/mL，pH6.50‑7.50，温度2‑10℃。该超滤稀释液能有效减少人凝血因子Ⅷ在后续分装、冻干、干热灭活等步骤中的效价损失，并提高人凝血因子Ⅷ的效价、外观等质量。
Description
技术领域
本发明属于血液制品技术领域，尤其涉及一种超滤稀释液及提高人凝血因子Ⅷ质量的制备方法。
背景技术
人凝血因子Ⅷ是治疗甲型血友病的特效药，而由于国内目前原料血浆的严重不足造成了目前市场供应不足的局面，造成了临床供应的巨大缺口。考虑到血液制品的特殊性和安全性，避免不同的人种的血浆来源问题和潜在的病毒传染问题，所以我们必须加快研发生产，缓解国内人凝血因子Ⅷ的临床使用的极度短缺。因此，在现阶段研发、生产出高质量的人凝血因子Ⅷ具有重要意义。
但是，在人凝血因子Ⅷ的制备过程中，常常发现会产生效价损失严重、外观不好、容易产生异物等质量等问题。
发明内容
鉴于现有技术所存在的问题，本发明提供一种超滤稀释液及提高人凝血因子Ⅷ质量的制备方法，能有效减少人凝血因子Ⅷ在后续分装、冻干、干热灭活等步骤中的效价损失，并能提高人凝血因子Ⅷ复溶后的外观等效果；该制备方法制备人凝血因子Ⅷ成品可以提高收率和质量。
本发明解决上述技术问题的技术方案如下：
本发明提供一种超滤稀释液，所述超滤稀释液包括聚山梨酯80。
采取上述技术方案的有益效果包括：本发明提供的超滤稀释液的配方中含有聚山梨酯80，可以有效减少可见异物，能有效防止蛋白质在过滤、转移、冷冻干燥、储存等过程中发生的物理损伤和表面吸附聚集等，且不会导致药物的失活或功能改变，该超滤稀释液能有效减少人凝血因子Ⅷ在后续分装、冻干、干热灭活等步骤中的效价损失，并提高人凝血因子Ⅷ的效价、外观等质量，具有比活性高、复溶时间短、成品收率高、质量好等优点。
进一步，聚山梨酯80的浓度为40-80μg/mL。
采取上述技术方案的有益效果包括：采用合适浓度的聚山梨酯80可以进一步避免效价损失，有利于提高人凝血因子Ⅷ的效价、外观质量，提高比活性、缩短复溶时间、提高成品收率、提高质量。
进一步，超滤稀释液还包括氯化钠、枸橼酸钠、甘氨酸、氯化钙和甘露醇，氯化钠的浓度为17-70mmol/L，枸橼酸钠的浓度为15mmol/L，甘氨酸的浓度为120mmol/L，氯化钙的浓度为1mmol/L，甘露醇的浓度为137mmol/L。
采取上述技术方案的有益效果包括：采用合适种类和用量的组分与聚山梨酯80配合使用可以进一步避免效价损失，有利于提高人凝血因子Ⅷ的效价、外观、质量、比活性、成品收率，进一步缩短复溶时间，从而避免参数过高或过低对制品产生影响。
进一步，超滤稀释液的pH值为6.50-7.50，温度为2-10℃。
采取上述技术方案的有益效果包括：采用上述条件的超滤稀释液可以进一步提高制品的质量，具有效价高、外观好、质量好、比活性高、成品收率高、复溶时间短等优点。
本发明提供上述超滤稀释液在纯化人凝血因子Ⅷ的过程中的应用。
进一步，上述超滤稀释液可以用于恒体积透析从层析柱上洗脱出的含人凝血因子Ⅷ的溶液。
采取上述技术方案的有益效果包括：将本发明的超滤稀释液用于制备人凝血因子Ⅷ可以有效减少可见异物、减少效价损失。具有效价高、外观好、质量好、比活性高、成品收率高、复溶时间短等优点。
本发明提供一种提高人凝血因子Ⅷ质量的制备方法，包括以下步骤：
(1)将从人血浆中分离出的冷沉淀溶解；
(2)调节pH；
(3)酸沉淀；
(4)采用DEAE SephadexTM A-50凝胶吸附；
(5)过滤DEAE SephadexTM A-50凝胶；
(6)S/D病毒灭活；
(7)EMD-TMAE阴离子交换层析；
(8)采用上述超滤稀释液进行超滤。
采取上述技术方案的有益效果包括：采取上述方法制备的人凝血因子Ⅷ具有效价高、外观好、比活性高、复溶时间短、成品收率高、质量好等优点。
进一步，步骤(1)将从人血浆中分离出的冷沉淀溶解包括以下步骤：从人血浆中分离出的冷沉淀为起始原料，用含有肝素钠的水溶解，控制温度升温，在升至20-25℃时停止升温，并保持停止时的温度恒温搅拌，在恒温搅拌时采用梯度降速的搅拌方式；梯度降速的搅拌方式包括以下步骤：在 20-25℃温度下使用搅拌速度70rpm搅拌20min，保持上一搅拌速度的温度，使用搅拌速度60rpm搅拌20min，继续保持上一搅拌速度的温度，使用搅拌速度50rpm搅拌20min。
采取上述技术方案的有益效果包括：采取上述方法可以进一步提高人凝血因子Ⅷ的质量。具有效价高、外观好、质量好、比活性高、成品收率高、复溶时间短等优点。
进一步，步骤(2)调节pH包括以下步骤：使用预冷到0-7℃的冰醋酸溶液调节pH值至6.5-7.5，加入速度控制在60-150mL/min；调节pH完成后继续搅拌反应30min。
采取上述技术方案的有益效果包括：采取上述方法可以进一步提高人凝血因子Ⅷ的质量。具有效价高、外观好、质量好、比活性高、成品收率高、复溶时间短等优点。
进一步，步骤(4)采用DEAE SephadexTM A-50凝胶吸附包括以下步骤：将步骤(3)酸沉淀过程离心后收集到的上清液，控制温度在10.0℃-17.0℃，用预冷到0-7℃的氢氧化钠溶液，调节pH值到6.80-7.20，氢氧化钠溶液的加入速度为60-150mL/min，调节pH完成后继续搅拌反应10min，搅拌速度为40-150rpm；然后向药液加入溶胀、平衡后的DEAE SephadexTMA-50凝胶，每1Kg冷沉淀重量应添加1g-2.5g的DEAE SephadexTM A-50凝胶干粉；DEAESephadexTM A-50凝胶加入到药液中以后，充分搅拌30-60min，搅拌速度为 40-60rpm。
采取上述技术方案的有益效果包括：采取上述方法可以进一步提高人凝血因子Ⅷ的质量。具有效价高、外观好、质量好、比活性高、成品收率高、复溶时间短等优点。
进一步，步骤(7)EMD-TMAE阴离子交换层析的方法包括以下步骤：先将/>EMD-TMAE阴离子交换层析柱，清洗层析柱，再在流速2-4L/min下使用5-9倍柱体积平衡液平衡层析柱，平衡液包括10mmol/L 枸橼酸钠、120-150mmol/L氯化钠、1mmol/L氯化钙、120mmol/L甘氨酸、 pH6.50-7.50，使其流出液与平衡液pH一致后备用；然后将经步骤(6)S/D 病毒灭活后的药液经凝胶/>EMD-TMAE层析柱层析上样，再平衡，洗涤，洗脱；上样：流速控制在1.0-2.2L/min，上样温度控制在5.0-20.0℃；再平衡：上样结束后，使用3-5倍柱体积的平衡液再次平衡层析柱，流速控制在120-240L/h，再平衡温度控制在5.0-20.0℃；洗涤：使用3-8倍柱体积洗涤液洗涤层析柱，洗涤液包括10mmol/L枸橼酸钠、190-260mmol/L氯化钠、1mmol/L氯化钙、120mmol/L甘氨酸、pH6.50-7.50；紫外(UV280)检测值应为0.1-3.5mAU，洗涤流速控制在2.0-4.0L/min，洗涤温度控制在 5.0-20.0℃；洗脱：使用1-5倍柱体积的洗脱液洗脱层析柱上吸附的蛋白，洗脱液使用0.5-1倍柱体积时收集流穿液，洗脱液包括10-20mmol/L枸橼酸钠、400-600mmol/L氯化钠、1mmol/L氯化钙、120mmol/L甘氨酸、 pH6.50-7.50，至紫外监测值(UV280)＜0.1mAU时停止收集，洗脱全过程流速控制在1.0-3.0L/min，洗脱温度控制在5.0℃-20.0℃。
采取上述技术方案的有益效果包括：采取上述方法可以进一步提高人凝血因子Ⅷ的质量。具有效价高、外观好、质量好、比活性高、成品收率高、复溶时间短等优点。
进一步，步骤(8)采用上述超滤稀释液进行超滤包括以下方法：
超滤初浓缩：采用已预铺超滤稀释液的超滤系统对经步骤(7) EMD-TMAE阴离子交换层析后的药液进行初浓缩，初浓缩到冷沉淀重量的0.10-0.50倍后停止初浓缩，超滤初浓缩过程中控制药液温度在2.0℃-15.0℃；
恒体积透析：使用2-10℃的超滤稀释液对初浓缩液恒体积透析初浓缩液重量的3-8倍，恒体积洗涤结束后，停止加恒洗液，恒体积透析后过程中控制药液温度2.0-10.0℃；
最终浓缩：将制品浓缩至冷沉淀重量的0.01-0.40倍后停止终浓缩，超滤终浓缩过程中控制药液温度在2.0℃-10.0℃；
最终浓缩结束后，用0.02-0.50倍左右冷沉淀重量的超滤稀释液分段式循环顶洗超滤系统，并将顶洗液并入制品中；分段式循环顶洗超滤系统的方法包括以下步骤：将0.02-0.50倍冷沉淀重量的超滤稀释液，按照重量平均分成4-8份，每一份将分别顶洗超滤系统，并在顶洗过程中保持循环状态 2-5min，直至每一份都完成循环顶洗后并入制品中；搅拌15-30min。
进一步，还包括配制、分装冻干、干热灭活的步骤。
采取上述技术方案的有益效果包括：采取上述方法可以进一步提高人凝血因子Ⅷ的质量。具有效价高、外观好、质量好、比活性高、成品收率高、复溶时间短等优点。
进一步，步骤(3)酸沉淀采用同时降温和调节pH值的方法，pH值到 6.00-7.00。
采取上述技术方案的有益效果包括：采取上述方法可以进一步提高人凝血因子Ⅷ的质量。具有效价高、外观好、质量好、比活性高、成品收率高、复溶时间短等优点。
进一步，步骤(5)过滤DEAE SephadexTM A-50凝胶的过程中滤芯压力＜ 2.0bar。
采取上述技术方案的有益效果包括：采取上述方法可以进一步提高人凝血因子Ⅷ的质量。具有效价高、外观好、质量好、比活性高、成品收率高、复溶时间短等优点。
进一步，在配制步骤，配制后的溶液pH值至6.9-7.1。
采取上述技术方案的有益效果包括：采取上述方法可以进一步提高人凝血因子Ⅷ的质量。具有效价高、外观好、质量好、比活性高、成品收率高、复溶时间短等优点。
具体实施方式
以下对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。
本发明提供了一种用于在纯化人凝血因子Ⅷ过程中使用的超滤稀释液，能有效减少人凝血因子Ⅷ在后续分装、冻干、干热灭活等步骤中的效价损失，并能提高人凝血因子Ⅷ复溶后的外观等效果。
该超滤稀释液适用于在纯化人凝血因子Ⅷ的过程中用于恒体积透析从层析柱上洗脱出的含人凝血因子Ⅷ的溶液，所述超滤稀释液含有氯化钠 17-70mmol/L，枸橼酸钠15mmol/L，甘氨酸120mmol/L，氯化钙1mmol/L，甘露醇137mmol/L，聚山梨酯80 40-80μg/mL，pH6.50-7.50，温度2-10℃。
本发明提供了一种提高人凝血因子Ⅷ质量的制备方法，采用该制备方法制备人凝血因子Ⅷ成品可以提高收率和产品的效价、比活、外观等质量。
本发明提供的制备方法中包含一种冷沉淀溶解方法，该方法采用恒温搅拌溶解方式与梯度降速的搅拌方式相结合：在20-25℃温度下使用搅拌速度 70rpm搅拌20min，保持上一搅拌速度的温度，使用搅拌速度60rpm搅拌 20min，继续保持上一搅拌速度的温度，使用搅拌速度50rpm搅拌20min。
该方法可以有效降低人凝血因子Ⅷ的活性在冷沉淀溶解过程中的损失。
本发明提供的制备方法中包含一种调pH值的方法，该方法使用预冷到 0-7℃的调pH值缓冲液，该方法可以有效的避免在调pH值过程中由于酸碱中和导致的人凝血因子Ⅷ的活性损失。
本发明提供的制备方法中包含一种超滤方法，该方法是使用分段式循环顶洗超滤系统的方式：将0.02-0.50倍左右冷沉淀重量的超滤稀释液，按照重量平均分成4-8份，每一份将分别顶洗超滤系统，并在顶洗过程中保持循环状态2-5min，直至每一份都完成循环顶洗后并入制品中。该方法可以有效的提高人凝血因子Ⅷ的收率及效价。
本发明的技术效果可以通过以下步骤实现：
(1)冷沉淀溶解：从人血浆中分离出的冷沉淀为起始原料，用2-4倍的注射用水溶解(注射用水中含有肝素钠，比例按每公斤注射用水加入肝素钠4000IU)，起始原料冷沉淀在用注射用水溶解时，控制温度缓慢升温，在升至20-25℃时停止升温，并保持停止时的温度恒温搅拌1h，并在恒温搅拌时采用梯度降速的搅拌方式。梯度降速的搅拌方式为：在20-25℃温度下使用搅拌速度70rpm搅拌20min，保持上一搅拌速度的温度，使用搅拌速度60rpm搅拌20min，继续保持上一搅拌速度的温度，使用搅拌速度50rpm搅拌20min。
(2)冷沉淀溶解后进行pH调节：使用预冷到0-7℃的0.1mol/L冰醋酸溶液调节pH，调节溶液pH值至6.5-7.5，0.1mol/L冰醋酸溶液的加入速度控制在60-150mL/min。调节pH完成后继续搅拌反应30min。
(3)酸沉淀：将药液温度降温至5.0-17.0℃，降温过程用预冷到0-7 ℃的0.1mol/L冰醋酸调节pH值到6.00-7.00，降温过程与调节pH值过程需同时开始。调节pH完成后继续搅拌反应30min。然后进行离心，离心时进出液的温度≤17℃。
(4)DEAE SephadexTM A-50凝胶吸附：将离心后收集到的上清液，控制温度在10.0℃-17.0℃，用预冷到0-7℃的0.1mol/L氢氧化钠溶液，调节pH 值到6.80-7.20，0.1mol/L氢氧化钠溶液的加入速度控制在60-150mL/min，调节pH完成后继续搅拌反应10min。搅拌速度控制在40-150rpm。然后向药液加入溶胀、平衡后的DEAE SephadexTM A-50凝胶(每1Kg冷沉淀重量添加 1g-2.5g的DEAE SephadexTM A-50凝胶干粉)。DEAE SephadexTM A-50凝胶加入到药液中以后，充分搅拌30-60min，搅拌速度控制在40-60rpm。
(5)DEAE SephadexTM A-50凝胶过滤：使用2-4根(1.2+0.5μm)或3-5 根0.45μm滤芯并联，并用离心预注液进行滤芯预铺，待药液准备好后进行过滤，去除DEAE SephadexTM A-50凝胶，滤芯压力＜2.0bar。
(6)S/D病毒灭活：药液在反应罐持续搅拌下(40-60rpm)，使用蠕动泵缓慢向药液中加入S/D液，控制流速≤1.0Kg/min，加入结束后，搅拌混匀药液并将搅拌速度降至20-30rpm。S/D病毒灭活所需磷酸三丁酯和聚山梨酯80的浓度分别为0.3％和1％，配制好的S/D溶液中磷酸三丁酯及聚山梨酯 80浓度的分别为3％和10％，S/D溶液需进行10倍稀释，即药液与S/D溶液的比例为9:1。温度控制在24.0℃-26.0℃保温6h，保持缓慢搅拌，灭活结束后30min以内降温至5.0-20.0℃，搅拌速度控制在10-50rpm。
(7)EMD-TMAE阴离子交换层析方法：先将/>EMD-TMAE阴离子交换层析柱，在流速2-4L/min下使用5-9倍柱体积注射用水清洗层析柱，再在流速2-4L/min下使用5-9倍柱体积平衡液 (10mmol/L枸橼酸钠，120-150mmol/L氯化钠，1mmol/L氯化钙，120mmol/L 甘氨酸，pH6.50-7.50)平衡层析柱，使其流出液与平衡液pH一致后备用。然后将经S/D灭活后的药液经凝胶/>EMD-TMAE层析柱层析上样，再平衡，洗涤，洗脱。上样：流速控制在1.0-2.2L/min，上样温度控制在 5.0-20.0℃；再平衡：上样结束后，使用3-5倍柱体积的平衡液再次平衡层析柱，流速控制在120-240L/h，再平衡温度控制在5.0-20.0℃。洗涤：使用3-8倍柱体积洗涤液(10mmol/L枸橼酸钠，190-260mmol/L氯化钠，1mmol/L 氯化钙，120mmol/L甘氨酸，pH6.50-7.50)洗涤层析柱，紫外(UV280)检测值应为0.1-3.5mAU，洗涤流速控制在2.0-4.0L/min，洗涤温度控制在 5.0-20.0℃；洗脱：使用1-5倍柱体积的洗脱液(10-20mmol/L枸橼酸钠， 400-600mmol/L氯化钠，1mmol/L氯化钙，120mmol/L甘氨酸，pH6.50-7.50) 洗脱层析柱上吸附的蛋白，洗脱液使用0.5-1倍柱体积时收集流穿液，至紫外监测值(UV280)＜0.1mAU时停止收集，洗脱全过程流速控制在 1.0-3.0L/min，洗脱温度控制在5.0℃-20.0℃。
(8)超滤：使用2-10℃的超滤稀释液(氯化钠17-70mmol/L，枸橼酸钠15mmol/L，甘氨酸120mmol/L，氯化钙1mmol/L，甘露醇137mmol/L，聚山梨酯80 40-80μg/mL，pH6.50-7.50)预铺2-5倍管路体积的超滤器后备用。超滤初浓缩：初浓缩到冷沉淀重量的0.10-0.50倍后停止初浓缩，超滤初浓缩过程中控制药液温度在2.0℃-15.0℃；恒体积透析：使用2-10℃的超滤稀释液对初浓缩液恒体积透析初浓缩液重量的3-8倍，恒体积洗涤结束后，停止加恒洗液，恒体积透析后过程中控制药液温度2.0-10.0℃；最终浓缩：将制品浓缩至冷沉淀重量的0.01-0.40倍后停止终浓缩，超滤终浓缩过程中控制药液温度在2.0℃-10.0℃。最终浓缩结束后，用0.02-0.50倍左右冷沉淀重量的超滤稀释液分段式循环顶洗超滤系统，并将顶洗液并入制品中。分段式循环顶洗超滤系统的方式为：将0.02-0.50倍左右冷沉淀重量的超滤稀释液，按照重量平均分成4-8份，每一份将分别顶洗超滤系统，并在顶洗过程中保持循环状态2-5min，直至每一份都完成循环顶洗后并入制品中。搅拌15-30min。
(9)配制：依据人凝血因子Ⅷ效价计算稀释配液量，向步骤(8)中得到的超滤终浓缩液加入经分段式循环顶洗超滤系统的超滤稀释液，稀释至规定体积，溶液pH值至6.9-7.1，如pH值不在范围内，使用0.1mol/L氢氧化钠溶液或0.1mol/L冰醋酸溶液调节pH值。
(10)将步骤(9)得到的配制液进行分装，冻干，干热灭活。
下面通过具体实施例进行介绍。
实施例1
本实施例提供的人凝血因子Ⅷ的制备方法，可以包括如下步骤：
(1)冷沉淀溶解：将预融后的人血浆破袋后进行融浆，再以 5000-5600rpm的速度进行连续分离离心，从人血浆中分离出的冷沉淀 35.10kg为起始原料，用4倍的注射用水溶解(按每公斤注射用水4000IU 加入肝素钠)，起始原料冷沉淀在用注射用水溶解时，控制温度缓慢升温，在升至20.7℃时停止升温，并保持停止时的温度恒温搅拌1h，并在恒温搅拌时采用梯度降速的搅拌方式：20.7℃：70rpm(20min)→20.7℃：60rpm (20min)→20.7℃：50rpm(20min)。
(2)调节pH：使用预冷到0-7℃的0.1mol/L冰醋酸溶液调节pH，调节溶液pH值至7.00，0.1mol/L冰醋酸溶液的加入速度控制在70mL/min。调节pH完成后继续搅拌反应30min。
(3)酸沉淀：将药液温度降温至12.9℃，降温过程用预冷到0-7℃的 0.1mol/L冰醋酸调节pH值到6.33，降温过程与调节pH值过程需同时开始。调节pH完成后继续搅拌反应30min。然后进行离心，离心时进出液的温度≤ 17℃。
(4)DEAE SephadexTM A-50凝胶吸附：将离心后收集到的上清液，控制温度在12.0℃，用预冷到0-7℃的0.1mol/L氢氧化钠溶液，0.1mol/L氢氧化钠溶液的加入速度控制在70mL/min，调节pH值到6.84，调节pH完成后继续搅拌反应10min。搅拌速度控制在60rpm。将39g DEAE SephadexTM A-50 凝胶放入10倍重量以上的溶胀液溶胀5h以上备用，将溶胀后的DEAE SephadexTM A-50凝胶，使用10Kg A-50凝胶平衡液浸泡10min，重复平衡3 次。然后向药液加入溶胀、平衡后的DEAE SephadexTM A-50凝胶。DEAE SephadexTM A-50凝胶加入到药液中以后，充分搅拌50min，搅拌速度控制在 50rpm。溶胀液的成分为：氯化钠70mmol/L；A-50凝胶平衡液成分为：氯化钠80mmol/L，枸橼酸钠15mmol/L。
(5)DEAE SephadexTM A-50凝胶过滤：使用3根1.2+0.5μm滤芯并联，并用离心预注液进行滤芯预铺，待药液准备好后进行过滤，去除DEAE SephadexTM A-50凝胶，滤芯压力＜2.0bar。
(6)S/D病毒灭活：药液在反应罐持续搅拌下(50rpm)，使用蠕动泵缓慢向药液中加入S/D液，控制流速≤1.0Kg/min，加入结束后，搅拌混匀药液并将搅拌速度降至30rpm。S/D病毒灭活所需磷酸三丁酯和聚山梨酯80 的浓度分别为0.3％和1％，配制好的S/D溶液中磷酸三丁酯及聚山梨酯80浓度的分别为3％和10％，S/D溶液需进行10倍稀释，即药液与S/D溶液的比例为9:1。温度控制在24.0℃-26.0℃保温6h，灭活结束后30min以内降温至 5.0-20.0℃，搅拌速度控制在30rpm。
(7)EMD-TMAE阴离子交换层析：先将/>EMD-TMAE 阴离子交换层析柱，在流速3L/min下使用5倍柱体积注射用水清洗层析柱，再在流速3L/min下使用5倍柱体积平衡液平衡层析柱，使其流出液与平衡液pH一致后备用。然后将经S/D灭活后的药液经凝胶/>EMD-TMAE 层析柱层析上样，再平衡，洗涤，洗脱。上样：流速控制在1.83L/min，上样温度控制在11.0℃；再平衡：上样结束后，使用3倍柱体积的平衡液再次平衡层析柱，流速控制在2.5L/min，再平衡温度控制在16.0℃。洗涤：使用5倍柱体积洗涤液洗涤层析柱，紫外(UV280)检测值应为0.1-3.5mAU，洗涤流速控制在2.5L/min，洗涤温度控制在14.0℃；洗脱：使用3倍柱体积的洗脱液洗脱层析柱上吸附的蛋白，洗脱液使用0.5-1倍柱体积时收集流穿液，至紫外监测值(UV280)＜0.1mAU时停止收集，洗脱全过程流速控制在1.58L/min，洗脱温度控制在14.0℃。平衡液的成分为：10mmol/L枸橼酸钠，120mmol/L氯化钠，1mmol/L氯化钙，120mmol/L甘氨酸，pH6.98；洗涤液的成分为：10mmol/L枸橼酸钠，220mmol/L氯化钠，1mmol/L氯化钙， 120mmol/L甘氨酸，pH6.98；洗脱液的成分为：10mmol/L枸橼酸钠，450mmol/L 氯化钠，1mmol/L氯化钙，120mmol/L甘氨酸，pH6.98。
(8)超滤：使用2-10℃的超滤稀释液预铺2-5倍管路体积的超滤器后备用。超滤初浓缩：初浓缩到冷沉淀重量的0.20倍后停止初浓缩，超滤初浓缩过程中控制药液温度在12.1℃；恒体积透析：使用2-10℃的超滤稀释液对初浓缩液恒体积透析初浓缩液重量的8倍，恒体积洗涤结束后，停止加恒洗液，恒体积透析后过程中控制药液温度8.6℃；最终浓缩：将制品浓缩至冷沉淀重量的0.05倍后停止终浓缩，超滤终浓缩过程中控制药液温度在8.0℃。最终浓缩结束后，用0.20倍左右冷沉淀重量的超滤稀释液分段式循环顶洗超滤系统，并将顶洗液并入制品中。分段式循环顶洗超滤系统的方式为：将0.20倍左右冷沉淀重量的超滤稀释液，按照重量平均分成4份，每一份0.05倍左右冷沉淀重量的超滤稀释液将分别顶洗超滤系统，并在顶洗过程中保持循环状态2min，直至4份都完成循环顶洗后并入制品中。搅拌 15-30min。超滤稀释液的成分为：氯化钠25mmol/L，枸橼酸钠15mmol/L，甘氨酸120mmol/L，氯化钙1mmol/L，甘露醇137mmol/L，聚山梨酯80 60μ g/mL，pH6.99。
(9)配制：可以取上一步所得制品检测人凝血因子Ⅷ效价，测得效价为32IU/mL，溶液pH值为7.01。也可以将所得制品直接进行分装。
(10)分装：将配制液进行过滤除菌分装，共分装773瓶。再进行冻干，干热灭活。
冻干可以采用下面的方法，也可以采用其他方法。例如：将分装后的制品进行预冻、升华、解析干燥；预冻：制品转入冻干机后将产品架设定在5 ℃保持2-3小时，产品架设定在-5℃保持1小时。将产品架设定在-48到-50 ℃保持2.5-4小时，制品温度达到零下-35℃以下。当制冷冷凝器-50℃后开启真空泵组抽真空达≤15帕以下；升华：真空稳定后，设定产品架温度在 -25--20℃干燥15小时后逐渐升温产品架到设定温产0℃保持1小时，经2 小时升温把产品架升温至设定温度15℃；解析干燥：在观察冻干机视窗产品水线已消失后，进一步提高产品架温度，使产品架30-34℃保持，期间制品均达28℃或以上继续干燥10-12小时，保温后逐渐抽最高真空。(升华过程中制品温度不得超过35℃，干燥全程真空≤20Pa)。
干热灭活可以采用下面的方法，也可以采用其他方法。例如：将冻干制品移入干热灭活柜，温度98-100℃，维持30min。结束后取样送检，得到冻干型人凝血因子Ⅷ成品。
采用实施例1方法制备的人凝血因子成品质量检测结果如表1所示，从表1中可以看出，本发明制备的人凝血因子各项指标均符合规定，并且复溶时间、水分含量、枸橼酸离子含量、磷酸三丁酯残留量、聚山梨酯80残留量、甘露醇含量等各项指标均优于标准。
表1实施例1的人凝血因子成品质量检测结果
对比例1
对比例1提供的人凝血因子Ⅷ的制备方法与实施例1除下面步骤外，其他均与实施例1相同。
对比例1中与实施例1不同的步骤包括：
步骤(1)中在冷沉淀溶解过程中的搅拌速度一直是90rpm，未采用梯度降速的搅拌方式。
步骤(2)和步骤(3)中使用室温的0.1mol/L冰醋酸溶液调节pH，未使用预冷的预冷到0-7℃的0.1mol/L冰醋酸溶液调节pH。
步骤(4)中使用室温的0.1mol/L氢氧化钠溶液调节pH，未使用预冷的预冷到0-7℃的0.1mol/L氢氧化钠溶液调节pH。
步骤(8)中直接使用0.17倍的冷沉淀重量的超滤稀释液顶洗超滤系统，未使用分段式循环顶洗超滤系统的方式。
表2实施例1与对比例1的成品检测结果
| 成品效价 | 成品比活性 | 成品复溶时间 | |
| 实施例1 | 24IU/mL | 48IU/mg | ＜1min |
| 对比例1 | 17.2IU/mL | 17.2IU/mg | 2min |
从表2中可以看出，采用本发明提供的人凝血因子Ⅷ成品效价更高、成品比活性更好、复溶时间更短，因此，采用本发明提供的人凝血因子Ⅷ的制备方法要要优于其他方法。
对比例2
对比例2提供的人凝血因子Ⅷ的制备方法与实施例1除下面步骤外，其他均与实施例1相同。
对比例2中与实施例1不同的步骤包括：
步骤(8)中直接使用0.15倍的冷沉淀重量的超滤稀释液顶洗超滤系统，未使用分段式循环顶洗超滤系统的方式。
表3实施例1与对比例1和对比例2的各步骤的活性收率结果
注：活性收率＝(该步骤的样品收集液活性IU/mL×体积mL)÷(冷沉淀溶解后的样品收集液活性IU/mL×体积mL)×100％。
从以上数据可以看出，实施例1中一种提高人凝血因子Ⅷ质量的制备方法，可以生产出相关质量指标远高于现行国家药典标准的制品。其效价高，比活性高，复溶时间短，并且实施例1中的各个步骤中的活性收率以及最后的成品收率，要远高于对比例2与对比例3的活性收率。
对比例3
本实施例提供的人凝血因子Ⅷ的制备方法除下面的配方外均与实施例1 相同。
对比例3采用的超滤稀释液的配方为：氯化钠70mmol/L，枸橼酸钠 15mmol/L，甘氨酸120mmol/L，氯化钙1mmol/L，甘露醇137mmol/L。此配方未加入聚山梨酯80。
表4实施例1与对比例3的分装前、半成品、冻干后、干热灭活后的效价检测结果
表5实施例1与对比例3的可见异物检测结果
从以上数据可以看出，使用实施例1中配方的超滤稀释液后，分装前后的损失率为8.1％，冻干前后的损失率仅为2.6％，干热灭活前后的损失率为 9.4％，制品复溶后外观澄清，无絮状出现。使用对比例3中配方的超滤稀释液后，分装前后的损失率为18.75％，冻干前后的损失率为33.08％，干热灭活前后的损失率为25.29％，制品复溶后有絮状出现。通过表4及表5结果可知，采用本发明提供的超滤稀释液，能有效减少人凝血因子Ⅷ在后续分装、冻干、干热灭活等步骤中的效价损失，要远远低于对比例3的损失率。采用本发明方法获得的制品复溶后的外观等状态，要优异于目前其他工艺的同产品。
本发明提供的超滤稀释液以及提高人凝血因子Ⅷ质量的制备方法(包含冷沉淀溶解方法、调pH值的方法、超滤方法)得到的制品，质量指标远高于现行国家药典标准，且具有产品质量稳定、制备方法简单等优点。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (4)
1.一种超滤稀释液，其特征在于，所述超滤稀释液包括聚山梨酯80；聚山梨酯80的浓度为40-80μg/mL；超滤稀释液还包括氯化钠、枸橼酸钠、甘氨酸、氯化钙和甘露醇，氯化钠的浓度为17-70mmol/L，枸橼酸钠的浓度为15mmol/L，甘氨酸的浓度为120mmol/L，氯化钙的浓度为1mmol/L，甘露醇的浓度为137mmol/L；超滤稀释液的pH值为6.50-7.50，温度为2-10℃。
2.权利要求1所述超滤稀释液在纯化人凝血因子Ⅷ的过程中的应用。
3.一种提高人凝血因子Ⅷ质量的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将从人血浆中分离出的冷沉淀溶解；将从人血浆中分离出的冷沉淀溶解包括以下步骤：从人血浆中分离出的冷沉淀为起始原料，用含有肝素钠的水溶解，控制温度升温，在升至20-25℃时停止升温，并保持停止时的温度恒温搅拌，在恒温搅拌时采用梯度降速的搅拌方式；梯度降速的搅拌方式包括以下步骤：在20-25℃温度下使用搅拌速度70rpm搅拌20min，保持上一搅拌速度的温度，使用搅拌速度60rpm搅拌20min，继续保持上一搅拌速度的温度，使用搅拌速度50rpm搅拌20min；
(2)调节pH；调节pH包括以下步骤：使用预冷到0-7℃的冰醋酸溶液调节pH值至6.5-7.5，加入速度控制在60-150mL/min；调节pH完成后继续搅拌反应30min；
(3)酸沉淀；
(4)采用DEAE SephadexTM A-50凝胶吸附；采用DEAE SephadexTM A-50凝胶吸附包括以下步骤：将步骤(3)酸沉淀过程离心后收集到的上清液，控制温度在10.0℃-17.0℃，用预冷到0-7℃的氢氧化钠溶液，调节pH值到6.80-7.20，氢氧化钠溶液的加入速度为60-150mL/min，调节pH完成后继续搅拌反应10min，搅拌速度为40-150rpm；然后向药液加入溶胀、平衡后的DEAE SephadexTM A-50凝胶，每1Kg冷沉淀重量添加1g-2.5g的DEAE SephadexTM A-50凝胶干粉；DEAE SephadexTM A-50凝胶加入到药液中以后，充分搅拌30-60min，搅拌速度为40-60rpm；
(5)过滤DEAE SephadexTM A-50凝胶；
(6)S/D病毒灭活；
(7)EMD-TMAE阴离子交换层析；/>EMD-TMAE阴离子交换层析的方法包括以下步骤：先将/>EMD-TMAE阴离子交换层析柱清洗，再在流速2-4L/min下使用5-9倍柱体积平衡液平衡层析柱，平衡液包括10mmol/L枸橼酸钠、120-150mmol/L氯化钠、1mmol/L氯化钙、120mmol/L甘氨酸、pH6.50-7.50，使其流出液与平衡液pH一致后备用；然后将经步骤(6)S/D病毒灭活后的药液经凝胶/>EMD-TMAE层析柱层析上样，再平衡，洗涤，洗脱；上样：流速控制在1.0-2.2L/min，上样温度控制在5.0-20.0℃；再平衡：上样结束后，使用3-5倍柱体积的平衡液再次平衡层析柱，流速控制在120-240L/h，再平衡温度控制在5.0-20.0℃；洗涤：使用3-8倍柱体积洗涤液洗涤层析柱，洗涤液包括10mmol/L枸橼酸钠、190-260mmol/L氯化钠、1mmol/L氯化钙、120mmol/L甘氨酸、pH6.50-7.50；紫外检测值应为0.1-3.5mAU，洗涤流速控制在2.0-4.0L/min，洗涤温度控制在5.0-20.0℃；洗脱：使用1-5倍柱体积的洗脱液洗脱层析柱上吸附的蛋白，洗脱液使用0.5-1倍柱体积时收集流穿液，洗脱液包括10-20mmol/L枸橼酸钠、400-600mmol/L氯化钠、1mmol/L氯化钙、120mmol/L甘氨酸、pH6.50-7.50，至紫外监测值＜0.1mAU时停止收集，洗脱全过程流速控制在1.0-3.0L/min，洗脱温度控制在5.0℃-20.0℃；
(8)采用权利要求1所述超滤稀释液进行超滤，包括以下方法：
超滤初浓缩：采用已预铺超滤稀释液的超滤系统对经步骤(7)EMD-TMAE阴离子交换层析后的药液进行初浓缩，初浓缩到冷沉淀重量的0.10-0.50倍后停止初浓缩，超滤初浓缩过程中控制药液温度在2.0℃-15.0℃；
恒体积透析：使用2-10℃的超滤稀释液对初浓缩液恒体积透析初浓缩液重量的3-8倍，恒体积洗涤结束后，停止加恒洗液，恒体积透析后过程中控制药液温度2.0-10.0℃；
最终浓缩：将制品浓缩至冷沉淀重量的0.01-0.40倍后停止终浓缩，超滤终浓缩过程中控制药液温度在2.0℃-10.0℃；
最终浓缩结束后，用0.02-0.50倍左右冷沉淀重量的超滤稀释液分段式循环顶洗超滤系统，并将顶洗液并入制品中；分段式循环顶洗超滤系统的方法包括以下步骤：将0.02-0.50倍冷沉淀重量的超滤稀释液，按照重量平均分成4-8份，每一份将分别顶洗超滤系统，并在顶洗过程中保持循环状态2-5min，直至每一份都完成循环顶洗后并入制品中；搅拌15-30min。
4.根据权利要求3所述制备方法，其特征在于，还包括配制、分装冻干、干热灭活的步骤；和/或，在配制步骤，配制后的溶液pH值至6.9-7.1；
和/或，步骤(3)酸沉淀采用同时降温和调节pH值的方法，pH值到6.00-7.00；
和/或，步骤(5)过滤DEAE SephadexTM A-50凝胶的过程中滤芯压力＜2.0bar。
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