CN103059129A - 制造人抗凝血酶-iii制品的方法 - Google Patents

Abstract

本专利涉及一种制造人抗凝血酶-III制品的方法，以Cohn低温乙醇法分离血浆蛋白工艺的组分Ⅳ沉淀为原料，经过抽提、压滤、肝素亲和层析、超滤、除菌过滤、冻干等工序以及必要的S/D及干热病毒灭活工艺，最终制备出高纯的抗凝血酶-Ⅲ冻干制品。本方法调整工艺尽可能使其中的AT-Ⅲ溶解；经加入适当保护剂以S/D病毒灭活工艺代替巴氏病毒灭活工艺，减少活性损失，缩短制备时间；并且只需一步肝素亲和层析就可得到高纯度的AT-Ⅲ溶液，再经过超滤、冷冻干燥、干热病毒灭活等步骤，最终制品纯度在95%以上，比活在6.5IU/mg以上，高于欧洲药典及美国药典规定限度3.0IU/mg。

Description

制造人抗凝血酶-III制品的方法

发明领域

本发明涉及一种从人Cohn血浆组分中分离纯化人抗凝血酶-Ⅲ的工艺，属生物制药领域。工艺步骤简洁，只用一步亲和层析，经两步不同的病毒灭活步骤，所得制品安全可靠。主要用来治疗各种原因引起的抗凝血酶-Ⅲ缺乏患者。

背景技术

    人抗凝血酶-Ⅲ（可表示为AT-Ⅲ）为单肽链α糖蛋白，分子量约58kD（千道尔顿），由423个氨基酸组成，是一种多功能丝氨酸蛋白酶抑制剂，在人体血浆中的抗凝作用占整个抗凝作用的70％左右，其半衰期为2.69天，患病时半衰期缩短，其主要在肝脏合成，故在各种肝脏疾病发生时AT-Ⅲ有不同程度的获得性缺乏。AT-Ⅲ制品主要用来治疗先天性遗传性抗凝血酶-Ⅲ缺乏，AT-Ⅲ缺乏症为常染色体显性遗传，据统计，该症在欧美的发生率为0.2%～0.5%。AT-Ⅲ制品还用来治疗获得性抗凝血酶Ⅲ缺乏，见于各种肝病，如肝硬化、重症呷、肝癌晚期等，以及各种病因引起的弥漫性血管内凝血综合症，产科与外科手术等造成的血栓等。

上世纪60～70年代即开始有人报道纯化AT-Ⅲ的工艺，但是仅限于实验室开发。1972年Heimburger et al首次分离并鉴定AT-Ⅲ为a₂单链糖蛋白，但是其回收率较低，大约在2%左右。1974年Maggie Miller-Andersson et al使用肝素亲和胶从血浆中纯化AT-Ⅲ，然后经过DEAE- Sephadex and Sephadex G200层析处理, 其活性回收率为 34%，纯度在90%以上。1979 年,Wicker et al首先叙述了工业规模制备临床用途的AT-Ⅲ浓缩物, 其原料为工业生产丢弃的Cohn 组分IV沉淀。1989年,Hoffman 等报道了大量制备AT-Ⅲ 的方法， 原料为Cohn 氏工艺提取的组分IV, 通过肝素亲和层析与其它蛋白分离，之后, 在 0.5M 枸椽酸钠溶液中将AT-Ⅲ 浓缩物于 60℃加热 10 小时, 以灭活乙肝病毒和其他传染性病毒,再进行二次肝素亲和层析, 成品比活不低于 6.4 IU/mg, 纯度大于 95% ,冷冻干燥后4℃存放 2 年, 仍有 90%以上的生物学活性。1994年, Wytold 等发表了以重溶后Cohn 氏组分IV沉淀为原料, 进行人血浆AT-Ⅲ肝素亲和层析的大规模提纯改良法, 该工艺包括了病毒灭活的加热过程和为进一步提纯目的的第二步肝素亲和层析, 上述方法可在 5 小时内在 40升柱上通过 1800 升的原液。AT-Ⅲ成品纯度达 95%以上, 其平均效率为 69% , 比活性为 7.7 IU/mg 蛋白, 由 20 kg Cohn 氏组分IV沉淀获得30g AT-Ⅲ, 收率可达到15～20%。该法最明显的改进是用Heparin- Hyper D (Sepracor, 硬性硅组成的肝素树指)取代肝素U ltrogel，显著增加了层析容量, 提高了流速, 降低了操作压力。此法的最大特点亦是采用了Cohn 氏组分IV沉淀为AT-Ⅲ 制备原料，便于充分利用原料血浆, 降低成本并对其它血浆蛋白的制备无影响。

发明内容

本发明目的是以Cohn 氏组分IV沉淀为原料，以氯化钠-柠檬酸钠溶液为抽提缓冲液对其融解，调整工艺尽可能使其中的AT-Ⅲ溶解；经加入适当保护剂以S/D病毒灭活工艺代替巴氏病毒灭活工艺，减少活性损失，缩短制备时间；并且只需一步肝素亲和层析就可得到高纯度的AT-Ⅲ溶液，再经过超滤、冷冻干燥、干热病毒灭活等步骤，最终制品纯度在95%以上，比活在6.5 IU/mg以上，高于欧洲药典及美国药典规定限度3.0IU/mg。

发明详述

本发明是一种从Cohn低温乙醇法分离血浆蛋白工艺组分Ⅳ沉淀中分离纯化人抗凝血酶-Ⅲ（AT-Ⅲ）的工艺，具体实施过程如下：

（1）、组分Ⅳ沉淀的抽提与处理

抽提缓冲液（氯化钠-柠檬酸钠溶液）与组分Ⅳ沉淀的混合比例为12:1～3:1（m/v）；抽提温度为4～36℃；抽提pH为5.5～11，抽提时间为1～2小时；然后在4～20℃温度下，用气动隔膜泵将抽提混合液进行压滤，去除不溶物；将压滤滤出液pH值调至7.2左右，采用10kD超滤膜进行超滤浓缩；

（2）、S/D病毒灭活

按步骤（1）最终所得液体体积的10%，加入11% S/D病毒灭活液，在24～25℃搅拌6小时，其中的11%S/D病毒灭活液，用含吐温-80和磷酸三丁酯（TNBP），按每110g吐温-80和33g TNBP加水至1千克的方法配制；

（3）亲和层析

以肝素亲和胶为吸附纯化载体，经过平衡、上样、洗涤、洗脱等步骤得到AT-Ⅲ原液，其中层析温度范围为4～36℃，各步骤液体流速为每小时6～9个柱体积。

①平衡：用平衡液对肝素亲和胶进行平衡，平衡液体积不少于4个柱体积；

②上样：将步骤（2）S/D病毒灭活最终所得液体泵入层析柱中，通过肝素亲和胶进行吸附；

③洗涤：用洗涤液对亲和胶进行洗涤，洗涤液体积不少于8个柱体积，观察在线紫外吸收图谱，至图谱趋于水平时停止洗涤；

④洗脱：对肝素亲和胶进行洗脱，观察在线紫外吸收图谱，并用洁净的容器收集吸收峰处的流出液，即为AT-Ⅲ原液。

（4）、超滤

对步骤（3）中所得AT-Ⅲ原液用10kD孔径超滤膜超滤，添加必要的冷冻干燥保护剂，本保护剂是指甘氨酸，其最终浓度为0.6～1.6%；

（5）除菌过滤

（6）分装

（7）冷冻干燥

①分装后的制品常温入柜，

②将隔板温度在40分钟内降至-40℃，保持3小时；

③开启真空泵，真空度控制在7～15Pa；

④2小时后将隔板温度升至-30℃，保持3小时；

⑤4小时后隔板温度升至-20℃，保持6小时；

⑥8小时后将隔板温度升至0℃，保持20小时；

⑦10小时后将温度升至30℃，保持6小时；真空度控制在5Pa以下保持1小时；

⑧真空压塞出柜。

（8）干热病毒灭活，干热温度100℃，时间为30min～60min。

其中

抽提缓冲液中含氯化钠和柠檬酸钠，其中氯化钠浓度为0.09～0.15M，柠檬

酸钠浓度为0.015～0.025M，pH为5.5～11，其余为水；

平衡液为含氯化钠和柠檬酸钠，其中氯化钠浓度为0.09～0.15M，柠檬酸钠浓度为0.015～0.025M，pH为6.5～7.5，其余为水；

洗涤液中含氯化钠和柠檬酸钠，其中氯化钠浓度为0.3～0.5M，柠檬酸钠浓度为0.015～0.025M，pH为6.5～7.5；其余为水；

洗脱液中含氯化钠和柠檬酸钠，其中氯化钠浓度为2～3M，柠檬酸钠浓度为0.015～0.025M，pH为6.5～7.5；其余为水；

        以上百分比除特别说明外均为质量百分比；以上需要调节pH的地方，所用酸碱均为0.1M盐酸和0.2M氢氧化钠。

本发明的有益效果，以Cohn 氏组分IV沉淀为原料，以氯化钠-柠檬酸钠溶液为抽提缓冲液对其融解，调整工艺尽可能使其中的AT-Ⅲ溶解；经加入适当保护剂以S/D病毒灭活工艺代替巴氏病毒灭活工艺，减少活性损失，缩短制备时间；并且只需一步肝素亲和层析就可得到高纯度的AT-Ⅲ溶液，再经过超滤、冷冻干燥、干热病毒灭活等步骤，最终制品纯度在95%以上，比活在6.5 IU/mg以上，高于欧洲药典及美国药典规定限度3.0IU/mg。

具体实施方式

实施例1

对上样层析条件进行优化，以组分IV沉淀抽提缓冲液pH值、氯化钠浓度及柠檬酸钠浓度为因素，设计三因素三水平正交实验，具体设计方案见下表所示。以三次实验回收活性平均值为考察指标，实验目的获得最佳上样层析条件组合。具体实施过程如下：

分别称取50g组分IV沉淀溶于不同浓度抽提缓冲液中，抽提缓冲液与组分IV比例为4：1（v/m），按设计方案调节pH值，室温下搅拌1小时，然后将其在4℃、4500rpm转速下离心30min，去除沉淀，收集上清液。过滤上清液，采用0.45μm孔径的过滤膜，过滤液上柱进行层析。层析过程如发明详述过程所述，其中柱高10cm，截面积2.0cm²，上样量为100ml。实验设计及结果见下表1：

表1以平均回收活性多少为目的时最优组合计算表

实施例2、

1、基本要求：

在公司中试车间将所需设备调试好并标为备用状态；

将所需容器管线及中试车间清洁干净并标为备用状态；

准备好100kg组分IV沉淀，于-30℃冷库保存备用。

2、主要溶液配制方法

抽提缓冲液含氯化钠和柠檬酸钠，其中氯化钠浓度为0.09～0.15M，柠檬酸钠浓度为0.015～0.025M，pH为5.5～11，其余为水；

平衡液含氯化钠和柠檬酸钠，其中氯化钠浓度为0.09～0.15M，柠檬酸钠浓度为0.015～0.025M，pH为6.5～7.5，其余为水；

洗涤液含氯化钠和柠檬酸钠，其中氯化钠浓度为0.3～0.5M，柠檬酸钠浓度为0.015～0.025M，pH为6.5～7.5；其余为水；

洗脱液含氯化钠和柠檬酸钠，其中氯化钠浓度为2～3M，柠檬酸钠浓度为0.015～0.025M，pH为6.5～7.5；其余为水；

11%S/D溶液含吐温-80和磷酸三丁酯（TNBP），按每110g吐温-80和33g TNBP加水至1千克的方法配制。

以上百分比除特别说明外均为质量百分比。

以上需要调节pH的地方，所用酸碱均为0.1M盐酸和0.2M氢氧化钠。

3、本实施例具体实施方式与发明详述过程一样，发明内容可以直接用于实施例。制备过程如发明内容所述，对100kg组分Ⅳ沉淀经抽提与处理、S/D病毒灭活、亲和层析、除菌过滤得到2.2LAT-III原液、再经分装、冻干、干热病毒灭活得最终制品AT-III，经检测，最终制品各参数指标见表2所示。

表2  AT-Ⅲ制品的参数指标

项目	具体规定	参数指标
			外观	应为白色疏松体，无融化迹象，复溶后为无色或者基本无色澄清液体，可带乳光，不应浑浊	符合规定
可见异物	除允许有微量细小蛋白颗粒外，其余应符合规定	符合规定
			真空度	应符合规定	符合规定
复溶时间	室温下应于10分钟内完全溶解	1
			装量差异	应符合规定	符合规定
pH	稀释10～20倍后6.0～7.5	7.1
			水份	不高于3.0%	1.8
AT-Ⅲ活性	应为标示量的80%～120%	480
			比活性	比活性大于3IU/mg 蛋白质	9.4
摩尔渗透压	应不低于240mOsmol/kg	273
			肝素残留	小于0.1IU/IU AT-Ⅲ	0.08
Na+浓度	应不高于250mmol/L	低于90
			甘氨酸含量	0.6～1.6 g/L	0.8
异常毒性	应符合规定	符合规定
			无菌	应无菌生长	符合规定
热源	每kg家兔注射50IU，应符合规定	符合规定
			磷酸三丁酯	不高于10μg/ml	1
吐温-80	不高于100μg/ml	11

“mOsmol/kg”渗透压摩尔浓度单位（每千克溶剂中溶解溶质的克数/分子量）。

Claims (1)

1. 制造人抗凝血酶-III制品的方法，其特征是一种从Cohn低温乙醇法分离血浆蛋白工艺组分Ⅳ沉淀中分离纯化人抗凝血酶-Ⅲ（AT-Ⅲ）的工艺，具体实施过程如下步骤：

（1）、组分Ⅳ沉淀的抽提与处理

抽提缓冲液（氯化钠-柠檬酸钠溶液）与组分Ⅳ沉淀的混合比例为12:1～3:1  m/v；抽提温度为4～36℃；抽提pH为5.5～11，抽提时间为1～2小时；然后在4～20℃温度下，用气动隔膜泵将抽提混合液进行压滤，去除不溶物；将压滤滤出液pH值调至7.2左右，采用10kD超滤膜进行超滤浓缩；

（2）、S/D病毒灭活

按组分Ⅳ沉淀的抽提与处理步骤最终所得液体体积的10%，加入11% S/D病毒灭活液，在24～25℃搅拌6小时，其中的11%S/D病毒灭活液，用含吐温-80和磷酸三丁酯TNBP，按每110g吐温-80和33g TNBP加水至1千克的方法配制；

（3）亲和层析

以肝素亲和胶为吸附纯化载体，经过平衡、上样、洗涤、洗脱等步骤得到AT-Ⅲ原液，其中层析温度范围为4～36℃，各步骤液体流速为每小时6～9个柱体积；

①平衡：用平衡液对肝素亲和胶进行平衡，平衡液体积不少于4个柱体积；

②上样：将S/D病毒灭活步骤最终所得液体泵入层析柱中，通过肝素亲和胶进行吸附；

③洗涤：用洗涤液对亲和胶进行洗涤，洗涤液体积不少于8个柱体积，观察在线紫外吸收图谱，至图谱趋于水平时停止洗涤；

④洗脱：对肝素亲和胶进行洗脱，观察在线紫外吸收图谱，并用洁净的容器收集吸收峰处的流出液，即为AT-Ⅲ原液；

（4）、超滤

对亲和层析步骤中所得AT-Ⅲ原液用10kD孔径超滤膜超滤，添加必要的冷冻干燥保护剂，本冷冻干燥保护剂是指甘氨酸，其最终浓度为0.6～1.6%；

（5）、除菌过滤

（6）、分装

（7）、冷冻干燥

①分装后的制品常温入柜： 

②将隔板温度在40分钟内降至-40℃，保持3小时；

③开启真空泵，真空度控制在7～15Pa；

④2小时后将隔板温度升至-30℃，保持3小时；

⑤4小时后隔板温度升至-20℃，保持6小时；

⑥8小时后将隔板温度升至0℃，保持20小时；

⑦10小时后将温度升至30℃，保持6小时；真空度控制在5Pa以下保持1小时；

⑧真空压塞出柜： 

（8）、干热病毒灭活

干热温度100℃，时间为30min～60min。