CN103613662A - 一种从人血浆中分离纯化人抗凝血酶-ⅲ的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种从人去冷沉淀血浆中分离纯化人抗凝血酶-Ⅲ的方法，其具体操作步骤如下：去冷沉淀人血浆层析，S/D病毒灭活，第二次亲和层析：超滤；除菌过滤；20nm纳滤膜过滤去除病毒；分装；冻干：干热病毒灭活；从人去冷沉淀血浆中分离纯化人抗凝血酶-Ⅲ；经过预过滤处理后，采用亲和层析技术直接将血浆中的抗凝血酶-Ⅲ（AT-Ⅲ）分离纯化出来；经加入适当保护剂以S/D病毒灭活工艺代替巴氏病毒灭活工艺，既减少了活性损失，又缩短了制备时间；然后进行第二次亲和层析进一步纯化AT-Ⅲ，最后经过超滤、20NM纳米膜纳滤除病毒、冻干等步骤，最终制品纯度在95%以上；比活在6IU/mg以上，病毒安全性高，且制备过程中不会影响血浆用来生产下游产品。

Description

一种从人血浆中分离纯化人抗凝血酶-Ⅲ的方法
技术领域
本发明属生物制药领域；涉及一种从人去冷沉淀血浆中分离纯化人抗凝血酶-Ⅲ的方法。
背景技术
    人抗凝血酶-Ⅲ（Antithrombin-Ⅲ，简称AT-Ⅲ）为单肽链α糖蛋白，分子量约58kD（千道尔顿），由423个氨基酸组成，是一种多功能丝氨酸蛋白酶抑制剂，在人体血浆中的抗凝作用占整个抗凝作用的70％左右，其半衰期为2.69天，患病时半衰期缩短，其主要在肝脏合成，故在各种肝脏疾病发生时AT-Ⅲ有不同程度的获得性缺乏。AT-Ⅲ制品主要用来治疗先天性遗传性抗凝血酶-Ⅲ缺乏，AT-Ⅲ缺乏症为常染色体显性遗传，据统计，该症在欧美的发生率为0.2%～0.5%。AT-Ⅲ制品还用来治疗获得性抗凝血酶Ⅲ缺乏，见于各种肝病，如肝硬化、重症呷、肝癌晚期等，以及各种病因引起的DIC综合症，产科与外科手术等造成的血栓等。
上世纪60～70年代即开始有人报道纯化AT-Ⅲ的工艺，但是仅限于实验室开发。1972年Heimburger et al首次分离并鉴定AT-Ⅲ为a2单链糖蛋白，但是其回收率较低，大约在2%左右。1974年Maggie Miller-Andersson et al使用肝素亲和胶从血浆中纯化AT-Ⅲ，然后经过DEAE- Sephadex and Sephadex G200层析处理, 其活性回收率为 34%，纯度在90%以上。1979 年,Wicker et al首先叙述了工业规模制备临床用途的AT-Ⅲ浓缩物, 其原料为工业生产丢弃的Cohn 组分 IV-1沉淀。1989年,Hoffman 等报道了大量制备AT-Ⅲ 的方法， 原料为Cohn 氏工艺组分IV-1, 通过肝素亲和层析与其它蛋白分离，之后, 在 0.5M 枸椽酸钠溶液中将AT-Ⅲ 浓缩物于 60℃加热 10 小时, 以灭活乙肝病毒和其他传染性病毒, 以后, 再进行二次肝素亲和层析, 成品比活不低于 6.4 IU/ mg, 纯度大于 95% , 冻干后4℃存放 2 年, 仍有 90%以上的生物学活性。1994年,W ytold 等发表了以重溶后Cohn 氏组分IV-1沉淀为原料, 进行人血浆AT-Ⅲ肝素亲和层析的大规模提纯改良法, 该工艺包括了病毒灭活的加热过程和为进一步提纯目的的第二步肝素亲和层析, 上述方法可在 5 小时内在 40 升柱上通过 1800 升的原液。AT-Ⅲ成品纯度达 95%以上, 其平均效率为 69% , 比活性为 7.7 IU/mg 蛋白, 由 20 kg FIV-1 沉淀获得30g AT-Ⅲ, 效果达 15～20%。90年代以后，国外血液制品企业开始推出新的血浆分离纯化工艺，层析技术被广泛应用，直接以去冷沉淀血浆为原料进行亲和层析制备AT-Ⅲ的技术得到应用和推广，如法国的FBL公司等都采用此工艺进行制备AT-Ⅲ制品。另外，为了去除难以采用S/D、加热等方法灭活的人细小病毒（B19），国际上相关制品都加以纳米膜过滤步骤来去除，本步骤采用过滤的方式将制品溶液中可能含有的包括细小病毒B19在内的病毒去除掉，去除能力达到4个Log以上，提高了制品的病毒安全性。
发明内容
本发明目的是发明一种以人去冷沉淀血浆为原料分离纯化制备人抗凝血酶-Ⅲ（AT-Ⅲ）的方法，经过预过滤处理后，采用亲和层析技术直接将血浆中的抗凝血酶-Ⅲ（AT-Ⅲ）分离纯化出来；经加入适当保护剂以S/D病毒灭活工艺代替巴氏病毒灭活工艺，既减少了活性损失，又缩短了制备时间；然后进行第二次亲和层析进一步纯化AT-Ⅲ，最后经过超滤、20NM纳米膜纳滤除病毒、冻干等步骤，最终制品纯度在95%以上，；比活在6 IU/mg以上，病毒安全性高，且制备过程中不会影响血浆用来生产下游产品。：下   
本发明的具体操作步骤如下：
（1）、去冷沉淀人血浆层析
先将人去冷沉淀血浆用0.45μm膜预过滤，然后泵入第一根肝素亲和层析柱中进行第一次亲和层析，经过平衡、上样、洗涤、洗脱等步骤得到AT-Ⅲ浓缩液，而流穿的血浆将继续用于生产其他制品；其中层析温度范围为4℃～15℃，各步骤液体流速为每小时6～9个柱体积。
①平衡：用平衡液对亲和胶进行平衡，平衡液体积不少于4个柱体积；
②上样：将预处理的人去冷沉淀血浆泵入层析柱中，通过亲和胶进行吸附；
③洗涤：用洗涤液对亲和胶进行洗涤，洗涤液体积不少于8个柱体积，观察在线紫外吸收图谱，至图谱趋于水平时停止洗涤；
④洗脱：对亲和胶进行洗脱，观察在线紫外吸收图谱，并用洁净的容器收集吸收峰处的流出液，即为AT-Ⅲ浓缩液。
（2）、S/D病毒灭活
对步骤（1）中所得AT-Ⅲ浓缩液用10kD孔径超滤膜超滤除盐，将盐浓度降至0.15M～0.25M，体积不变。按步骤（1）最终所得液体体积的10%，加入11% S/D病毒灭活液，在24～25℃搅拌6小时；
（3）第二次亲和层析
对经S/D灭活后的溶液，过0.45μm膜预过滤，然后泵入第二根肝素亲和层析柱中进行第二次亲和层析，经过平衡、上样、洗涤、洗脱等步骤得到AT-Ⅲ原液，其中层析温度范围为4～25℃，各步骤液体流速为每小时6～9个柱体积； 
①平衡：用平衡液对亲和胶进行平衡，平衡液体积不少于4个柱体积；
②上样：将步骤（2）S/D病毒灭活最终所得液体泵入层析柱中，通过亲和胶进行吸附；
③洗涤：用洗涤液对亲和胶进行洗涤，洗涤液体积不少于8个柱体积，观察在线紫外吸收图谱，至图谱趋于水平时停止洗涤；
④洗脱：对亲和胶进行洗脱，观察在线紫外吸收图谱，并用洁净的容器收集吸收峰处的流出液，即为AT-Ⅲ原液。
（4）、超滤
对步骤（3）中所得AT-Ⅲ原液用10kD孔径超滤膜超滤，将盐浓度降至0.11M～0.22M，并适当浓缩使每毫升溶液中的活性单位大于50IU，添加必要的冻干保护剂，本保护剂是指甘氨酸，其最终浓度为0.6%～1.6%；
（5）除菌过滤；
（6）20N纳滤膜过滤去除病毒；
（7）分装；
（8）冻干：
①分装后的制品常温入柜；
②将隔板温度在40分钟内快速降至-40℃，保持3小时；
③开启真空泵，真空度控制在7Pa～15Pa；
④2小时后将隔板温度升至-30℃，保持3小时；
⑤4小时后隔板温度升至-20℃，保持6小时；
⑥8小时后将隔板温度升至0℃，保持20小时；
⑦10小时后将温度升至30℃，保持6小时；真空度控制在5Pa以下保持1小时；
⑧真空压塞出柜；
（9）干热病毒灭活，干热温度100℃，时间为30min～60min；
其中：
平衡液含氯化钠和柠檬酸钠，其中氯化钠浓度为0.09 M～0.15M，柠檬酸钠浓度为0.015 M～0.025M，pH为6.5～7.5，其余为水；
洗涤液中含氯化钠和柠檬酸钠，其中氯化钠浓度为0.3 M～0.5M，柠檬酸钠浓度为0.015 M～0.025M，pH为6.5～7.5；其余为水；
洗脱液中含氯化钠和柠檬酸钠，其中氯化钠浓度为2 M～3M，柠檬酸钠浓度为0.015 M～0.025M，pH为6.5～7.5；其余为水；
    11%S/D溶液含吐温-80和磷酸三丁酯（TNBP），按每110g吐温-80和33g TNBP
加水至1千克的方法配制；
以上百分比浓度除特别说明外均为质量百分比
以上需要调节pH的地方，所用酸碱均为0.1M盐酸和0.2M氢氧化钠。
   本发明的有益效果，本发明的工艺步骤操作简单，经两步亲和层析步骤，直接将去冷沉淀血浆纯化得到高纯的AT-III浓缩物，加以两步必要的病毒灭活/去除步骤，进一步提高了制品的病毒安全性。其工艺步骤操作简单，且制备过程中不会影响血浆用来生产下游产品，最终所得制品安全可靠。本发明所得制品主要用来治疗各种原因引起的抗凝血酶-Ⅲ缺乏患者。
具体实施方式
实施例
1、基本要求：
在公司中试车间将所需设备调试好并标为备用状态；
将所需容器管线及中试车间清洁干净并标为备用状态；
准备好500L新鲜人去冷沉淀血浆，于0～4℃融浆罐中保存备用。
2、主要溶液配制方法
抽提缓冲液中含氯化钠和柠檬酸钠，其中氯化钠浓度为0.09～0.15M，柠檬酸钠浓度为0.015M～0.025M，pH为5.5～11，其余为水；
平衡液含氯化钠和柠檬酸钠，其中氯化钠浓度为0.09M～0.15M，柠檬酸钠浓度为0.015M～0.025M，pH为6.5～7.5，其余为水；
洗涤液中含氯化钠和柠檬酸钠，其中氯化钠浓度为0.3M～0.5M，柠檬酸钠浓度为0.015M～0.025M，pH为6.5～7.5；其余为水；
洗脱液中含氯化钠和柠檬酸钠，其中氯化钠浓度为2M～3M，柠檬酸钠浓度为0.015M～0.025M，pH为6.5～7.5；其余为水；
11%S/D溶液含吐温-80和磷酸三丁酯（TNBP），按每110g吐温-80和33g TNBP加水至1千克的方法配制。
以上百分比除特别说明外均为质量百分比。
以上需要调节pH的地方，所用酸碱均为0.1M盐酸和0.2M氢氧化钠。
3、本实施例具体制备过程：
（1）、人去冷沉淀血浆层析
先将约500L人去冷沉淀血浆用0.45μm膜预过滤，然后泵入第一根肝素亲和层析柱中进行第一次亲和层析，经过平衡、上样、洗涤、洗脱等步骤得到AT-Ⅲ浓缩液，而流穿的血浆将继续用于生产其他制品。其中层析温度范围为4～15℃，各步骤液体流速为每小时6～9个柱体积。
①平衡：用平衡液对亲和胶进行平衡，平衡液体积不少于4个柱体积；
②上样：将预处理的人去冷沉淀血浆泵入层析柱中，通过亲和胶进行吸附；
③洗涤：用洗涤液对亲和胶进行洗涤，洗涤液体积不少于8个柱体积，观察在线紫外吸收图谱，至图谱趋于水平时停止洗涤；
④洗脱：对亲和胶进行洗脱，观察在线紫外吸收图谱，并用洁净的容器收集吸收峰处的流出液，即为AT-Ⅲ浓缩液。
（2）、S/D病毒灭活
对步骤（1）中所得AT-Ⅲ浓缩液用10kD孔径超滤膜超滤除盐，将盐浓度降至0.15～0.25M，体积不变。按步骤（1）最终所得液体体积的10%，加入11% S/D病毒灭活液，在24～25℃搅拌6小时。
（3）第二次亲和层析
对经S/D灭活后的溶液，过0.45μm膜预过滤，然后泵入第二根肝素亲和层析柱中进行第二次亲和层析，经过平衡、上样、洗涤、洗脱等步骤得到AT-Ⅲ原液，其中层析温度范围为4～25℃，各步骤液体流速为每小时6～9个柱体积。
①平衡：用平衡液对亲和胶进行平衡，平衡液体积不少于4个柱体积；
②上样：将步骤（2）S/D病毒灭活最终所得液体泵入层析柱中，通过亲和胶进行吸附；
③洗涤：用洗涤液对亲和胶进行洗涤，洗涤液体积不少于8个柱体积，观察在线紫外吸收图谱，至图谱趋于水平时停止洗涤；
④洗脱：对亲和胶进行洗脱，观察在线紫外吸收图谱，并用洁净的容器收集吸收峰处的流出液，即为AT-Ⅲ原液。
（4）、超滤
对步骤（3）中所得AT-Ⅲ原液用10kD孔径超滤膜超滤，将盐浓度降至0.11M～0.22M，并适当浓缩使每毫升溶液中的活性单位大于50IU，添加必要的冻干保护剂，本保护剂是指甘氨酸，其最终浓度为0.6%～1.6%；第二次亲和层析、超滤浓缩除盐、除菌过滤得到2.0L AT-III原液；
（5）除菌过滤；
（6）20nm纳米膜过滤去除病毒；
（7）分装；
（8）冻干：
①分装后的制品常温入柜；
②将隔板温度在40分钟内降至-40℃，保持3小时；
③开启真空泵，真空度控制在7～15Pa；
④2小时后将隔板温度升至-30℃，保持3小时；
⑤4小时后隔板温度升至-20℃，保持6小时；
⑥8小时后将隔板温度升至0℃，保持20小时；
⑦10小时后将温度升至30℃，保持6小时；真空度控制在5Pa以下保持1小时；
⑧真空压塞出柜；
（9）干热病毒灭活，干热温度100℃，时间为30min～60min。
最终AT-Ⅲ制品各参数指标见表2所示。
 
表1  AT-Ⅲ制品的参数指标
项目 具体规定 参数指标
外观 应为白色疏松体，无融化迹象，复溶后为无色或者基本无色澄清液体，可带乳光，不应浑浊 符合规定
可见异物 除允许有微量细小蛋白颗粒外，其余应符合规定 不符合规定
真空度 应符合规定 符合规定
复溶时间 室温下应于10分钟内完全溶解 3
装量差异 应符合规定 符合规定
pH 稀释10～20倍后6.0～7.5 6.9
水份 不高于3.0% 1.1
AT-Ⅲ活性 应为标示量500IU的80%～120% 440
比活性 比活性大于3IU/mg 蛋白质 5.4
摩尔渗透压 应不低于240mOsmol/kg 349
肝素残留 小于0.1IU/IU AT-Ⅲ 0.04
 Na+浓度 应不高于250mmol/L 144
甘氨酸含量 0.6～1.6 %（m/v） 1.4
异常毒性 应符合规定 符合规定
无菌 应无菌生长 符合规定
热源 每kg家兔注射50IU，应符合规定 符合规定
磷酸三丁酯  不高于10μg/ml 1
吐温-80 不高于100μg/ml 11
“mOsmol/kg”渗透压摩尔浓度单位（每千克溶剂中溶解溶质的克数/分子量。

Claims (1)

1. 一种从人去冷沉淀血浆中分离纯化人抗凝血酶-Ⅲ的方法，其特征是它的具体操作步骤如下：
（1）、去冷沉淀人血浆层析
先将人去冷沉淀血浆用0.45μm膜预过滤，然后泵入第一根肝素亲和层析柱中进行第一次亲和层析，经过平衡、上样、洗涤、洗脱等步骤得到AT-Ⅲ浓缩液，而流穿的血浆将继续用于生产其他制品；其中层析温度范围为4℃～15℃，各步骤液体流速为每小时6～9个柱体积；
①平衡：用平衡液对亲和胶进行平衡，平衡液体积不少于4个柱体积；
②上样：将预处理的人去冷沉淀血浆泵入层析柱中，通过亲和胶进行吸附；
③洗涤：用洗涤液对亲和胶进行洗涤，洗涤液体积不少于8个柱体积，观察在线紫外吸收图谱，至图谱趋于水平时停止洗涤；
④洗脱：对亲和胶进行洗脱，观察在线紫外吸收图谱，并用洁净的容器收集吸收峰处的流出液，即为AT-Ⅲ浓缩液；
（2）、S/D病毒灭活
对步骤（1）中所得AT-Ⅲ浓缩液用10kD孔径超滤膜超滤除盐，将盐浓度降至0.15M～0.25M，体积不变；按步骤（1）最终所得液体体积的10%，加入11% S/D病毒灭活液，在24～25℃搅拌6小时；
（3）第二次亲和层析
对经S/D灭活后的溶液，过0.45μm膜预过滤，然后泵入第二根肝素亲和层析柱中进行第二次亲和层析，经过平衡、上样、洗涤、洗脱等步骤得到AT-Ⅲ原液，其中层析温度范围为4～25℃，各步骤液体流速为每小时6～9个柱体积； 
①平衡：用平衡液对亲和胶进行平衡，平衡液体积不少于4个柱体积；
②上样：将步骤（2）S/D病毒灭活最终所得液体泵入层析柱中，通过亲和胶进行吸附；
③洗涤：用洗涤液对亲和胶进行洗涤，洗涤液体积不少于8个柱体积，观察在线紫外吸收图谱，至图谱趋于水平时停止洗涤；
④洗脱：对亲和胶进行洗脱，观察在线紫外吸收图谱，并用洁净的容器收集吸收峰处的流出液，即为AT-Ⅲ原液；
（4）、超滤
对步骤（3）中所得AT-Ⅲ原液用10kD孔径超滤膜超滤，将盐浓度降至0.11M～0.22M，并适当浓缩使每毫升溶液中的活性单位大于50IU，添加必要的冻干保护剂，本保护剂是指甘氨酸，其最终浓度为0.6%～1.6%；
（5）除菌过滤；
（6）20N纳滤膜过滤去除病毒；
（7）分装；
（8）冻干：
①分装后的制品常温入柜；
②将隔板温度在40分钟内快速降至-40℃，保持3小时；
③开启真空泵，真空度控制在7Pa～15Pa；
④2小时后将隔板温度升至-30℃，保持3小时；
⑤4小时后隔板温度升至-20℃，保持6小时；
⑥8小时后将隔板温度升至0℃，保持20小时；
⑦10小时后将温度升至30℃，保持6小时；真空度控制在5Pa以下保持1小时；
⑧真空压塞出柜；
（9）干热病毒灭活，干热温度100℃，时间为30min～60min；
其中：
平衡液含氯化钠和柠檬酸钠，其中氯化钠浓度为0.09 M～0.15M，柠檬酸钠浓度为0.015 M～0.025M，pH为6.5～7.5，其余为水；
洗涤液中含氯化钠和柠檬酸钠，其中氯化钠浓度为0.3 M～0.5M，柠檬酸钠浓度为0.015 M～0.025M，pH为6.5～7.5；其余为水；
洗脱液中含氯化钠和柠檬酸钠，其中氯化钠浓度为2 M～3M，柠檬酸钠浓度为0.015 M～0.025M，pH为6.5～7.5；其余为水；
    11%S/D溶液含吐温-80和磷酸三丁酯（TNBP），按每110g吐温-80和33g TNBP
加水至1千克的方法配制；
以上百分比浓度除特别说明外均为质量百分比
以上需要调节pH的地方，所用酸碱均为0.1M盐酸和0.2M氢氧化钠。
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