CN114249817A - 一种分离纯化人抗凝血酶ⅲ的方法 - Google Patents
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Abstract
发明提供一种分离纯化人抗凝血酶Ⅲ的方法，属于生物制品及血液制品技术领域。本发明方法中采用了UniGel‑65 Heparin凝胶层析对ATⅢ进行分离纯化。该层析填料以UniGel为基质，与肝素钠进行偶联得到，所述UniGel为表面亲水修饰过的单分散球形多孔交联聚丙烯酸酯“硬胶”层析介质，使用该肝素凝胶对ATⅢ进行分离纯化能使其柱保留时间缩短至不超过3min，实现快速上样、节约工艺时间；且分离后的本发明方法步骤为：1.取冰冻人血浆离心去除冷沉淀DEAE SephdexA50凝胶吸附，得到的DEAE SephdexA50吸附后血浆；2进行肝素亲和层析，得到的洗脱液为一步层析分离纯化后的ATⅢ产品；亲和层析步骤为：平衡、上样、冲洗、洗涤、洗脱，较传统的层析步骤增加了一步冲洗，能提高ATⅢ的收率。
Description
技术领域
本发明涉及生物制品及血液制品技术领域，具体涉及一种分离纯化人抗凝血酶Ⅲ的方法。
背景技术
人抗凝血酶Ⅲ(AntithrombinⅢ，以下简称“ATⅢ”)是血液抗凝血系统中的主要成份的主要成分，占人体总抗凝能力的70～80％，是血液中抗凝的关键物质，作为血液中活性凝血因子最重要的阻碍因子，它控制着血液的凝固和纤维蛋白的溶解，参与保持体内抗凝血功能和纤溶系统与凝血系统的动态平衡，并起着抗凝调节作用。临床上，血液中ATⅢ的水平随各种疾病、症状而变化，弥散性血管内凝血(DIC)、肝疾患、肾病综合症等疾病患者的ATⅢ血浆水平降低。
二十世纪60-70年代即开始有人报道纯化ATⅢ的工艺，但是仅限于实验室开发，1972年Heimburger等首次分离并鉴定ATⅢ为α2单链糖蛋白，但是其回收率较低，大约在2％左右，1974年Miller等使用肝素亲和胶从血浆中纯化ATⅢ，其活性回收率为34％，纯度在90％以上，1979年，Wiker等用Cohn组分IV-1沉淀制备临床用ATⅢ浓缩物。纵观ATⅢ的分离纯化历史，除了最初采用氢氧化铝、磷酸钙吸附、离子交换层析等制备方法外，自1970年以来，ATⅢ的制备方法中都至少用了一次肝素亲和层析，缩短了流程，提高了收率和纯度。二十世纪90年代以后，国外血液制品企业开发了以层析技术为基础的新的分离纯化工艺，直接用去冷沉淀的血浆为原料进行亲和层析制备ATⅢ的技术得到应用和推广，如CSL公司、LFB公司等都采用此工艺进行制备ATⅢ制品。
国内最早报道制备ATⅢ浓缩物的专家为中国医学科学院输血所的刘文芳教授，也是采用肝素亲和层系的方法，直接用血浆进行制备，采用巴氏病毒灭活法进行病毒灭活，最终收率大约在13～25％。比活可达7.5IU/mg左右。
由此可见肝素亲和层析对分离纯化ATⅢ至关重要，目前常见市售的肝素亲和凝胶有GE公司生产的Heparin SepHarose FF和Capto Heparin；Tosoh公司生产的ToyopearlAF-Heparin和HC-650M-Heparin；Pall公司生产的Heparin HyperD等，采用的基质大多为葡聚糖、琼脂糖、硅基等，此类基质耐压性能差，生产中需要降低柱高、减小流速以防止压力过高造成柱床塌陷，限制了批处理量及生产效率、传质速度慢。因此现有市售的肝素亲和凝胶需要在柱保留时间长、流速慢的条件下，吸附载量才会比较高，而在高流速下动态载量下降的非常快。
中国专利CN104672328B公布了一种人抗凝血酶Ⅲ的生产方法，步骤为：将新鲜冰冻人血浆去除冷沉淀获得血浆上清，上清液使用DEAE Sephadex A50凝胶吸附处理，血浆上清沉淀除杂质蛋白后经深层过滤，滤液经Capto Heparin亲和层析，S/D病毒灭活及Capto Q离子交换层析去除S/D试剂，纳米膜过滤去除病毒、配制、冻干、干热。其中该专利采用CaptoHeparin层析洗脱后，ATⅢ比活为8.45IU/mg，相对于上一阶段的收率仅为60％，但未对其柱保留时间进行研究。山东大学张翠萍发表的硕士论文《人抗凝血酶Ⅲ分离纯化工艺研究》中通过对比现有市售的几种肝素亲和凝胶后选择Capto Heparin作为分离纯化ATⅢ的的亲和层析凝胶，关注点均在分离效果上而未对层析过程中的柱保留时间进行优化，所选用亲和层析凝胶均为现市场上常销售的几种材料。
根据生产实践经验，我们都知道，随着融化后血浆存放时间的延长，血浆中会有更多的蛋白质析出，而随着蛋白析出的增多，层析前澄清过滤就变得更加困难，上样时层析柱的反压也会不断增高。在保证ATIII活性回收率的前提下，应尽量加快上样流速，缩短层析工艺持续时间，减少血浆在低温乙醇工艺前的存放时间，这有利用减少蛋白析出，增加下游产品的回收率。另外很重要的一点是，随着时间的延长，即使在比较低的温度下，血浆中也会有微生物开始滋生，会增加下游产品热源以及微生物限度升高的风险。因此降低层析工艺持续时间，还可以最大限度的减少血浆中微生物限度。而快速上样，是解决以上问题的关键。因此找一种新的肝素亲和层析凝胶填料，缩短其柱保留时间，实现快速上样，对提高生产效率具有实际意义。尤其是当直接用血浆制备ATⅢ时，肝素亲和层析的快速上样对于提高整个血液制品生产线的生产效率具有重大意义。
发明内容
本发明提供一种分离纯化人抗凝血酶Ⅲ的方法，以解决现有技术中存在的技术问题。
为解决上述问题，本发明选用的亲和层析的凝胶是以单分散多孔交联聚丙烯酸酯微球为基质与肝素钠偶联所得，采用单分散技术所制备的微球大小均一，通量显著升高，单分散多孔交联聚丙烯酸酯微球经过表面亲水化改性；采用该亲和层析凝胶对人抗凝血酶Ⅲ进行分离纯化，人抗凝血酶Ⅲ的柱保留时间缩短至不超过3min。
具体地，该聚丙烯酸酯微球粒径为65μm。
具体地，该聚丙烯酸酯微球孔径为
具体地，亲和层析是UniGel-65 Heparin亲和层析。
根据本发明实施例，所述亲和层析包括如下步骤：含有人抗凝血酶Ⅲ的样品上亲和层析柱后，先使用平衡液冲洗层析柱至少1个柱体积，再使用洗涤液洗涤。
优选地，所述平衡液冲洗层析柱1-2个柱体积。
进一步地，所述平衡液含：0.01-0.03mol/L枸橼酸钠，0.1-0.14mol/L氯化钠，pH6.0-8.0。
根据本发明实施例，所述亲和层析包括如下步骤：含有人抗凝血酶Ⅲ的样品上亲和层析柱后，用洗涤液洗涤，所述洗涤液的电导率为20～45mS/cm。
具体地，UniGel-65 Heparin亲和层析的纯化样品为含有人抗凝血酶Ⅲ的样品，任选自：去冷沉淀血浆，或去冷沉淀血浆经DEAE Sephdex A50凝胶吸附后得到的DEAESephdex A50吸附后血浆或以A50吸附后血浆为起始原料分离纯化人抗凝血酶Ⅲ的中间样品，
或改良K-N法组份Ⅳ沉淀溶解液或以改良K-N法组份Ⅳ沉淀溶解液为起始原料分离纯化人抗凝血酶Ⅲ的中间样品，
或Cohn组分IV-1沉淀溶解液或以Cohn组分IV-1沉淀溶解液为起始原料分离纯化人抗凝血酶Ⅲ的中间样品。
本发明采用的聚丙烯酸酯微球为单分散，粒径均一，孔径及粒径大、机械强度高，且经表面亲水改性后表面亲水性能好，非特异性吸附低。该基质与肝素钠偶联得到一种新的肝素亲和凝胶，名为UniGel-65 Heparin。经发明人研究发现，使用UniGel-65 Heparin亲和层析对ATⅢ进行分离纯化能使其柱保留时间缩短至3min，且发明人还意外发现可避免纯化过程中蛋白析出问题。因此该UniGel-65 Heparin亲和层析凝胶能特异应用于ATⅢ的分离，提高分离效率，对节约整个生产线的生产时间具有重大意义。
进一步地，发明人还对亲和层析步骤进行优化，具体步骤如下：它包括如下步骤：⑴取冰冻人血浆离心去除冷沉淀，DEAE Sephdex A50凝胶吸附，得到DEAE Sephdex A50吸附后血浆；⑵UniGel-65 Heparin亲和层析：a平衡预先使用平衡液冲洗层析柱，直至电导平稳且与平衡液相同；b上样DEAE Sephdex A50吸附后血浆过滤后上UniGel-65 Heparin亲和层析柱；c冲洗使用平衡液冲洗层析柱1-2个柱体积；d洗涤使用洗涤液进行洗涤直至UV峰洗至基线；e洗脱使用洗脱液洗脱直至UV峰洗至基线，收集洗脱液即得到高纯度人抗凝血酶Ⅲ溶液。
具体地，平衡液为：0.01-0.03mol/L枸橼酸钠溶液，0.1-0.14mol/L氯化钠，pH为6.0-8.0；
和/或洗涤液为：0.01-0.03mol/L枸橼酸钠溶液，0.3-0.6mol/L氯化钠，pH为6.0-8.0；
和/或洗脱液为：0.01-0.03mol/L枸橼酸钠溶液，1.5-2.5mol/L氯化钠，pH为6.0-8.0。
由于血浆中含有枸橼酸钠，因此优选枸橼酸钠-氯化钠为层析缓冲体系，不会引入新的杂质。
综上所述，由于采用了上述技术方案，本发明的有益效果是：
1.发明人通过大量研究发现，采用多孔交联聚丙烯酸酯微球作为骨架的肝素亲和层析凝胶分离纯化ATⅢ，可获得较短的柱保留时间和较高的回收率。比如采用UniGel-65Heparin亲和层析凝胶分离纯化ATⅢ，其柱保留时间可缩短至不超过3分钟，实现快速上样，节约工艺时间，并且在较短的柱保留时间上能保证ATⅢ的分离纯化效果。进一步地，缩短ATⅢ纯化工艺时间，为后续其他血液制品的分离预留了时间，间接提高了整个血液制品生产线的生产效率。
2.采用UniGel-65 Heparin亲和层析对ATⅢ进行层析分离纯化，发明人意外发现，可避免纯化过程中蛋白析出问题。
3.相比于CN104672328B公开的Capto Heparin单步层析ATⅢ60％的活性回收率，采用本发明优化的层析条件进行一步肝素亲和层析ATⅢ活性回收率能达到90％以上，得到的ATⅢ比活能达到7-11IU/mg。特别地，本发明公开的肝素亲和层析步骤较传统的层析步骤在洗涤前增加了冲洗步骤，可大幅减少洗涤过程中ATⅢ的损失，提高ATⅢ的收率。
具体实施方式
本说明书中公开的所有特征，除了互相排斥的特征和/或步骤以外，均可以以任何方式组合。
本发明采用的专业术语“人抗凝血酶Ⅲ”等同于“ATⅢ”，等同于AntithrombinⅢ。
本发明所述的“去冷沉淀血浆”指将冰冻人血浆去除冷沉淀后获得的血浆上清。在具体的实施方式中，去除冷沉淀的方法可以是：连续流离心、Supradur50P滤板串联0.45μm滤芯过滤、深层过滤、离心加深层过滤等方法。
DEAE Sephdex A50凝胶：也称为A50凝胶，常用的凝胶基质为葡聚糖凝胶，是一种高膨胀凝胶，可吸附酸性蛋白。在具体的实施方式中，可选GE公司提供的DEAE Sephdex A50凝胶。本发明采用DEAE Sephdex A50凝胶吸附去冷沉淀血浆，DEAE Sephdex A50吸附后的血浆可进一步用于后面的肝素亲和层析分离纯化步骤。
UniGel-65 Heparin：为苏州纳微科技股份有限公司开发的一种新的肝素凝胶，该凝胶采用一种新的单分散聚丙烯酸酯微球为肝素层析骨架材料。在本发明人将其用于ATⅢ的纯化分离时，意外地发现该UniGel-65 Heparin层析材料能缩短层析柱保留时间，并且无Capto Heparin Tosoh、Heparin HyperD、HC-650M-Heparin等肝素亲和层析凝胶纯化ATⅢ常见的蛋白析出问题。
柱保留时间＝柱体积/流速。
下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
相比于CN104672328B公开的Capto Heparin单步层析ATⅢ60％的活性回收率，采用本发明优化的层析条件进行一步肝素亲和层析ATⅢ活性回收率能达到90％以上，得到的ATⅢ比活能达到7-11IU/mg。特别地，本发明公开的肝素亲和层析步骤较传统的层析步骤在洗涤前增加了冲洗步骤，可大幅减少洗涤过程中ATⅢ的损失，提高ATⅢ的收率。在一些实施方式中，控制洗涤液的导率在20～45mS/cm之间，可一定程度上降低洗涤过程的ATⅢ的损失。
实施例1
UniGel-65 Heparin凝胶层析与市售的几种层析的柱保留时间比较
⑴准备DEAE Sephdex A50凝胶干胶约2g,用注射用水溶胀后使用平衡液进行置换平衡，平衡好后待用；取冰冻人血浆4袋，每袋约600g，融化混合后，在4℃下，转速4000rpm离心15min以去除冷沉淀，DEAE Sephdex A50凝胶吸附，得到的DEAE Sephdex A50吸附后血浆，平均分为四份备用；
⑵分别采用UniGel-65 Heparin凝胶及现市售的几种Capto Heparin Tosoh、Heparin HyperD、HC-650M-Heparin凝胶对DEAE Sephdex A50吸附血浆进行层析，得到ATⅢ溶液。在层析柱所能承受的合适压力下，计算各层析柱层析过程中的ATⅢ的柱保留时间。
实验结果如下：
表1各肝素凝胶层析过程中柱保留时间对比
从上述表中可看出，采用骨架为多孔交联聚丙烯酸酯的UniGel-65 Heparin肝素亲和层析对ATⅢ进行分离纯化，其柱保留时间可缩短至3min，明显优于现市面上销售的几种肝素凝胶Capto Heparin Tosoh、Heparin HyperD、HC-650M-Heparin。
采用骨架为多孔交联聚丙烯酸酯的UniGel-65 Heparin肝素亲和层析对ATⅢ进行分离纯化，层析前后压差明显低于现市面上销售的几种肝素凝胶Capto Heparin Tosoh、Heparin HyperD、HC-650M-Heparin。可能的原因是：冰冻血浆融化时存在不稳性，放置时间越久，析出蛋白越多，造成上样时层析柱压差越来越高。
发明人意外观察到，UniGel-65 Heparin凝胶层析过程中无蛋白析出，其他几种肝素凝胶层析过程中均有蛋白析出的现象，只是程度不同。
进一步地，发明人试验发现其他几种肝素凝胶超过3小时后，蛋白析出速率会加快，这不仅会造成柱压升高，进一步减慢流速，还会增加蛋白损失。
由此可以看出，利用肝素亲和层析从血浆及其衍生物中分离纯化ATⅢ，其柱保留时间短，一方面可以缩短ATⅢ纯化工艺时间，提高生产效率、降低ATⅢ有效成分在纯化过程中被微生物污染的风险，另一方面可以降低ATⅢ损失。
实施例2
UniGel-65 Heparin肝素亲和层析条件优化
⑴准备DEAE Sephdex A50凝胶干胶约1g,用注射用水溶胀后使用平衡液进行置换平衡，平衡好后待用；取冰冻人血浆2袋，每袋约600g融化后，在4℃下，转速4000rpm离心15min以去除冷沉淀，DEAE Sephdex A50凝胶吸附，得到的DEAE Sephdex A50吸附后血浆，分成两等份备用；
对比实验1：
⑵采用UniGel-65 Heparin胶对DEAE Sephdex A50吸附后血浆进行层析：
a平衡使用平衡液冲洗层析柱，线性流速为280cm/h，直至电导平稳且与平衡液相同，平衡液为：含0.01mol/L枸橼酸钠溶液，含0.1mol/L氯化钠，pH为7.1；
b上样取一份DEAE Sephdex A50吸附后血浆过0.45μm滤膜后进行上样，上样线性流速为280cm/h，上样量为：25个柱体积；
c洗涤使用洗涤液对层析柱进洗涤，线性流速为280cm/h，洗涤液为：含0.01mol/L枸橼酸钠溶液，含0.4mol/L氯化钠，pH为7.0，UV起峰开始收集洗涤液，直至UV峰到基线停止收集，称重并取样；
d洗脱使用洗脱液洗脱层析柱，线性流速为280cm/h，洗脱液：含0.01mol/L枸橼酸钠溶液，含2mol/L氯化钠，pH为7.0，UV起峰开始收集洗脱液，直至UV峰洗至基线，称重并取样，洗脱液即为高纯度ATⅢ溶液；
e再生使用3个柱体积3mol/L氯化钠冲洗层析柱，电导平稳后再用注射用水冲洗，直至电导到基线，最后使用2个柱体积20％乙醇保存。
对比实验2：
⑵采用UniGel-65 Heparin胶对DEAE Sephdex A50吸附血浆进行层析
a平衡使用平衡液冲洗层析柱，线性流速为280cm/h，直至电导平稳且与平衡液相同，平衡液为：含0.01mol/L枸橼酸钠溶液，含0.1mol/L氯化钠，pH为7.1；
b上样取另一份DEAE Sephdex A50吸附后血浆过0.45μm滤膜后进行上样，上样线性流速为280cm/h，上样量为：25个柱体积；
c冲洗使用2个柱体积平衡液冲洗层析柱，线性流速为280cm/h；
d洗涤使用洗涤液对层析柱进洗涤，线性流速为280cm/h，洗涤液为：含0.01mol/L枸橼酸钠溶液，含0.4mol/L氯化钠，pH为7.0，UV起峰开始收集洗涤液，直至UV峰到基线停止收集，称重并取样；
e洗脱使用洗脱液洗脱层析柱，线性流速为280cm/h，洗脱液：含0.01mol/L枸橼酸钠溶液，含2mol/L氯化钠，pH为7.1，UV起峰开始收集洗脱液，直至UV峰洗至基线，称重并取样，洗脱液即为高纯度ATⅢ溶液。
表3对比实验各阶段ATⅢ收率
由此可看出，对比实验2相对于对比实验1在洗涤前增加了冲洗操作，能有效减少洗涤过程中ATⅢ的损失，提高ATⅢ的收率及纯度。
实施例3
⑴准备DEAE Sephdex A50凝胶干胶约1g,用注射用水溶胀后使用平衡液进行置换平衡，平衡好后待用；取冰冻人血浆一袋，每袋约600g融化后，在4℃下，转速4000rpm离心15min以去除冷沉淀，DEAE Sephdex A50凝胶吸附，得到的DEAE Sephdex A50吸附后血浆；⑵采用UniGel-65 Heparin胶对DEAE Sephdex A50吸附血浆进行层析：
a平衡使用平衡液冲洗层析柱，线性流速为280cm/h，直至电导平稳且与平衡液相同，平衡液为：含0.01mol/L枸橼酸钠溶液，含0.14mol/L氯化钠，采用调节pH为6.0；
b上样DEAE Sephdex A50吸附后血浆过0.45μm滤膜后进行上样，上样线性流速为280cm/h，上样量为：25个柱体积；
c冲洗使用1个柱体积平衡液冲洗层析柱，线性流速为280cm/h；
d洗涤使用洗涤液对层析柱进洗涤，线性流速为280cm/h，洗涤液为：含0.01mol/L枸橼酸钠溶液，含0.3mol/L氯化钠，采用HCl调节pH为6.0，UV起峰开始收集洗涤液，直至UV峰到基线停止收集，称重并取样；
e洗脱使用洗脱液洗脱层析柱，线性流速为280cm/h，洗脱液为：含0.01mol/L枸橼酸钠溶液，含1.5mol/L氯化钠，pH为6.1，UV起峰开始收集洗脱液，直至UV峰洗至基线，称重并取样，洗脱液即为高纯度ATⅢ溶液。
实验结果：最终得到的洗脱液中ATⅢ的比活为6.69IU/mg，收率为90.29％，无蛋白析出。
实施例4
步骤⑴同实施例3；
⑵采用UniGel-65 Heparin胶对DEAE Sephdex A50吸附血浆进行层析：
a平衡使用平衡液冲洗层析柱，线性流速为280cm/h，直至电导平稳且与平衡液相同，平衡液为：含0.01mol/L枸橼酸钠溶液，含0.12mol/L氯化钠，采用HCl调节pH为8.0；
b上样DEAE Sephdex A50吸附后血浆过0.45μm滤膜后进行上样，上样线性流速为280cm/h，上样量为：40个柱体积；
c冲洗使用2个柱体积平衡液冲洗层析柱，线性流速为280cm/h；
d洗涤使用洗涤液对层析柱进洗涤，线性流速为280cm/h，洗涤液为：含0.01mol/L枸橼酸钠溶液，含0.6mol/L氯化钠，采用HCl调节pH为7.9，UV起峰开始收集洗涤液，直至UV峰到基线停止收集，称重并取样；
e洗脱使用洗脱液洗脱层析柱，线性流速为280cm/h，洗脱液为：含0.01mol/L枸橼酸钠溶液，含2.5mol/L氯化钠，pH为8.0，UV起峰开始收集洗脱液，直至UV峰洗至基线，称重并取样，洗脱液即为高纯度ATⅢ溶液。
实验结果：最终得到的洗脱液中ATⅢ的比活为7.56IU/mg，收率为90.03％，无蛋白洗出。
实施例5
步骤⑴同实施例3；
⑵采用UniGel-65 Heparin胶对DEAE Sephdex A50吸附血浆进行层析：
a平衡使用平衡液冲洗层析柱，线性流速为280cm/h，直至电导平稳且与平衡液相同，平衡液为：含0.03mol/L枸橼酸钠溶液，含0.12mol/L氯化钠，采用HCl调节pH为7.9；
b上样DEAE Sephdex A50吸附后血浆过0.45μm滤膜后进行上样，上样线性流速为280cm/h，上样量为：40个柱体积；
c冲洗使用2个柱体积平衡液冲洗层析柱，线性流速为280cm/h；
d洗涤使用洗涤液对层析柱进洗涤，线性流速为280cm/h，洗涤液为：含0.03mol/L枸橼酸钠溶液，含0.6mol/L氯化钠，采用HCl调节pH为7.9，UV起峰开始收集洗涤液，直至UV峰到基线停止收集，称重并取样；
e洗脱使用洗脱液洗脱层析柱，线性流速为280cm/h，洗脱液为：含0.03mol/L枸橼酸钠溶液，含2.5mol/L氯化钠，pH为7.9，UV起峰开始收集洗脱液，直至UV峰洗至基线，称重并取样，洗脱液即为高纯度ATⅢ溶液。
实验结果：最终得到的洗脱液中ATⅢ的比活为7.06IU/mg，收率为92.03％，无蛋白析出。
实施例6
步骤⑴同实施例3；
⑵采用UniGel-65 Heparin胶对DEAE Sephdex A50吸附血浆进行层析：
a平衡使用平衡液冲洗层析柱，线性流速为280cm/h，直至电导平稳且与平衡液相同，平衡液为：含0.02mol/L枸橼酸钠溶液，含0.1mol/L氯化钠，采用HCl调节pH为7.4；
b上样DEAE Sephdex A50吸附后血浆过0.45μm滤膜后进行上样，上样线性流速为280cm/h，上样量为：30个柱体积；
c冲洗使用2个柱体积平衡液冲洗层析柱，线性流速为280cm/h；
d洗涤使用洗涤液对层析柱进洗涤，线性流速为280cm/h，洗涤液为：含0.02mol/L枸橼酸钠溶液，含0.4mol/L氯化钠，采用HCl调节pH为7.5，UV起峰开始收集洗涤液，直至UV峰到基线停止收集，称重并取样；
e洗脱使用洗脱液洗脱层析柱，线性流速为280cm/h，洗脱液为：含0.02mol/L枸橼酸钠溶液，含2mol/L氯化钠，pH为7.5，UV起峰开始收集洗脱液，直至UV峰洗至基线，称重并取样，洗脱液即为高纯度ATⅢ溶液。
实验结果：最终得到的洗脱液中ATⅢ的比活为8.06IU/mg，收率为91.93％，无蛋白析出。
在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。
Claims (10)
1.一种分离纯化人抗凝血酶Ⅲ的方法，包括采用亲和层析对人抗凝血酶Ⅲ进行分离纯化，其特征在于，所述亲和层析的凝胶是以单分散多孔交联聚丙烯酸酯微球为基质与肝素钠偶联所得，所述单分散多孔交联聚丙烯酸酯微球经过表面亲水化改性；采用所述亲和层析对人抗凝血酶Ⅲ进行分离纯化，人抗凝血酶Ⅲ的柱保留时间缩短至不超过3min。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述聚丙烯酸酯微球的粒径为65μm。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述聚丙烯酸酯微球的孔径为
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述亲和层析是UniGel-65 Heparin亲和层析。
5.根据权利要求1～4任一项所述的方法，其特征在于，所述亲和层析包括如下步骤：含有人抗凝血酶Ⅲ的样品上亲和层析柱后，先使用平衡液冲洗层析柱至少1个柱体积，再使用洗涤液洗涤；
优选地，所述平衡液冲洗层析柱1-2个柱体积。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述平衡液含：0.01-0.03mol/L枸橼酸钠，0.1-0.14mol/L氯化钠，pH 6.0-8.0。
7.根据权利要求1～4任一项所述的方法，其特征在于，所述亲和层析包括如下步骤：含有人抗凝血酶Ⅲ的样品上亲和层析柱后，用洗涤液洗涤，所述洗涤液的电导率为20～45mS/cm。
8.根据权利要求5或7任一项所述的方法，其特征在于，所述含有人抗凝血酶Ⅲ的样品任选自：去冷沉淀血浆，或去冷沉淀血浆经DEAE Sephdex A50凝胶吸附后得到的DEAESephdex A50吸附后血浆或以DEAE Sephdex A50吸附后血浆为起始原料分离纯化人抗凝血酶Ⅲ的中间样品，
或改良K-N法组份Ⅳ沉淀溶解液或以改良K-N法组份Ⅳ沉淀溶解液为起始原料分离纯化人抗凝血酶Ⅲ的中间样品，
或Cohn组分IV-1沉淀溶解液或以Cohn组分IV-1沉淀溶解液为起始原料分离纯化人抗凝血酶Ⅲ的中间样品。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述含有人抗凝血酶Ⅲ的样品是去冷沉淀血浆经DEAE Sephdex A50凝胶吸附后得到的DEAE Sephdex A50吸附后血浆，所述亲和层析步骤具体方法如下：a平衡预先使用平衡液冲洗层析柱直至电导平稳且与平衡液相同；b上样DEAE Sephdex A50吸附后血浆过滤后上UniGel-65 Heparin亲和层析柱；c冲洗使用平衡液冲洗层析柱1-2个柱体积；d洗涤使用洗涤液进行洗涤直至UV峰洗至基线；e洗脱使用洗脱液洗脱直至UV峰洗至基线，收集洗脱液即得到高纯度人抗凝血酶Ⅲ溶液。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述平衡液为：0.01-0.03mol/L枸橼酸钠，0.1-0.14mol/L氯化钠，pH 6.0-8.0；
和/或所述洗涤液为：0.01-0.03mol/L枸橼酸钠，0.3-0.6mol/L氯化钠，pH 6.0-8.0；
和/或所述洗脱液为：0.01-0.02mol/L枸橼酸钠，1.5-2.5mol/L氯化钠，pH 6.0-8.0。
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